Предисловие
| Вид материала | Методическое пособие |
- Содержание предисловие 3 Введение, 2760.07kb.
- Томас Гэд предисловие Ричарда Брэнсона 4d брэндинг, 3576.37kb.
- Электронная библиотека студента Православного Гуманитарного Университета, 3857.93kb.
- Е. А. Стребелева предисловие,, 1788.12kb.
- Breach Science Publishers». Предисловие. [3] Мне доставляет удовольствие написать предисловие, 3612.65kb.
- Том Хорнер. Все о бультерьерах Предисловие, 3218.12kb.
- Предисловие предисловие petro-canada. Beyond today’s standards, 9127.08kb.
- Библейское понимание лидерства Предисловие, 2249.81kb.
- Перевод с английского А. Н. Нестеренко Предисловие и научное редактирование, 2459.72kb.
- Тесты, 4412.42kb.
Занятие № 4
Тема: Ферменты бактерий. Выделение чистых культур бактерий (II и III этапы). Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, УФО и химическим веществам. Культивирование анаэробов.
Цель занятия: Произвести учет I этапа выделения чистой культуры, изучить культуральные свойства и морфологию колоний. Освоить методы культивирования анаэробов. Провести II и III этапы выделения чистой культуры микроорганизмов из смыва вымени коровы. Сделать посевы для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам, УФО и химическим веществам.
Материалы и оборудование: Набор бумажных индикаторных дисков, сулема, фенол, предметные стекла, бактериологическая петля, дистиллированная вода, растворы красок, этиловый спирт 96%, посевы с чистыми культурами (I этап), иммерсионное масло, фильтровальная бумага.
Демонстрация:
1. Аппаратура для культивирования анаэробов (насос Камовского, анаэростат, эксикатор).
- Рост анаэробов (по Фортнеру, в среде Китт-Тароцци, в молоке, в высоком столбике).
Вопросы для обсуждения:
1. Классификация антибиотиков, механизм действия.
2. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.
3. Ферментативные свойства бактерий – протеолитические, гликолитические, окислительно-восстановительные ферменты, ферменты агрессии. Методы их обнаружения.
4. Систематика микроорганизмов.
5. Культуральные свойства микроорганизмов.
6. Влияние физических и химических факторов на микроорганизмы.
7. Классификация бактерий по типам дыхания. Сущность процесса дыхания у микробов.
8. Культивирование анаэробов.
I. Антибиотики. Методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам
Антибиотики – химиотерапевтические вещества микробного, полусинтетического или синтетического происхождения. В малых концентрациях вызывают гибель или торможение размножения чувствительных к ним микроорганизмов и опухолевых клеток.
При определении чувствительности микроорганизмов к антибиотикам используют следующие методы:
- Метод «бумажных дисков». При использовании этого метода признаком антибактериальной активности антибиотиков является определение зоны роста культуры на МПА вокруг диска, пропитанного антибиотиком. При наложении диска на среду антибиотики растворяются влагой среды и диффундируют в окружающую среду. В зависимости от активности антибиотиков площадь задержки роста микроорганизмов различна.
- Метод серийных разведений (пробирочный вариант). Позволяет определить действующую концентрацию антибиотика. Учет опыта проводится по последней пробирке, где наблюдается задержка роста микробной культуры.
II. Классификация ферментов
-
Гидролазы
Оксидоредуктазы
Трансферазы
Лиазы
Изомеразы
Лигазы
Экзоферменты
Эндоферменты
Индуцибельные
Конститутивные
III. Культивирование анаэробов
К анаэробам относят микроорганизмы, которые существуют в бескислородных условиях. Различают: а) строгие (облигатные) анаэробы палочка столбняка, ботулизма; б) факультативные анаэробы, которые размножаются при ограниченном доступе кислорода и в анаэробных условиях (кишечная палочка). Аэробы вырастают на поверхности столбика; рост анаэробов происходит в глубоких слоях среды. Факультативные анаэробы растут как на поверхности среды, так и в глубине.
Существует несколько методов создания анаэробных условий.
- Применяемые для культивирования анаэробов питательные среды подвергаются перед засевом регенерированию, т.е. освобождению от растворенного кислорода химическим или физическим методом. Обогатительной средой для анаэробов является среда Китт–Тароцци, которая состоит из мясопептонного бульона с 0.5% глюкозы и кусочками паренхиматозных органов на дне пробирки в качестве редуцирующего вещества; сверху среда заливается слоем вазелинового масла для механического разобщения воздухом. Для культивирования анаэробов часто пользуются средой Вильсон–Блера. Среда Вильсон–Блера состоит из МПА, глюкозы, раствора сульфита натрия и раствора хлорного железа. Отнятый от глюкозы в процессе анаэробного дыхания водород восстанавливает сульфит натрия в сернистый натрий, а последний реагирует с хлорным железом и образует сернистое железо, которое окрашивает колонии в черный цвет.
2. Воздух из среды удаляют механическим путем. Для этого используют анаэростаты, из которых воздух выкачивается насосом.
3. Замена воздуха индифферентным газом, например водородом, который получается в аппарате Киппа и через присоединенную трубку поступает в сосуд, где помещены посевы анаэробов, вытесняя кислород.
4. Механическая защита от кислорода воздуха используется с применением способа Виньяль–Вейона. Для этого берут стеклянную трубку и один из ее концов вытягивают в капилляр, а у другого делают перетяжку и вставляют ватную пробку, засевают в растопленный агар исследуемый материал, перемешивают среду и затем насасывают агар в стерильную трубку. Затем запаивают капилляр и трубку помещают в термостат. В среде вырастают колонии бактерий, которые можно извлечь, распилив трубку.
5. Химическое поглощение кислорода воздуха, например щелочным раствором пирогаллола (10%-ный раствор щелочи и пирогаллола) в особых пробирках (способ Бюхнера).
6. Биологический метод – комбинированный посев культур анаэробов и аэробов (способ Фортнера). Посев производят на чашку Петри с толстым слоем кровяного агара, разделенного пополам вырезанной в середине чашки прокаленным стерильным скальпелем небольшой полоски агара. На одной половине агара делают посев культуры аэроба, например Bac.prodigiosum, а на другой – анаэроба, чашку обмазывают парафином и помещают в термостат. Сначала происходит рост аэробов; когда же они исчерпают из чашки в достаточной мере кислород, начинается рост анаэробов.
Ход работы:
I. Изучить культуральные свойства, описать морфологию колоний.
- Просмотреть чашки, засеянные на предыдущем занятии. Отметить на поверхности среды наличие отдельных колоний;
- Изучить морфологические особенности строения отдельных колоний:
1) величину (крупная – 4–5 мм в диаметре, средняя –2–4 мм, мелкая – 1–2 мм, карликовая – меньше 1 мм);
2) форму очертания колонии (правильно и неправильно круглая, розеткообразная, ризоидная и др.);
3) степень прозрачности (непрозрачная, полупрозрачная, прозрачная);
4) цвет колонии (бесцветная, пигментированная);
5) поверхность (гладкая, шероховатая, блестящая, влажная или морщинистая, матовая, сухая, с радиальной или концентрической исчерченностью);
6) положение колонии на питательной среде (плоская, выпуклая, с вдавлением);
7) консистенция (плотная, сухая, слизистая, мажущаяся, тянущаяся и др.). Консистенция определяется петлей во время взятия материала колонии для приготовления мазка.
II. Изучить колонии под микроскопом. Для этого установить чашку Петри вверх дном на предметном столике микроскопа, опустить конденсор, осветить поле зрения зеркалом и установить объектив 8. Изучить структуру и края и колонии:
1) характер края колонии (ровные, волнистые, зазубренные, бахромчатые, фестончатые);
2) структура колонии (гомогенная, зернистая, волокнистая и др.).
III. Из части изученной колонии приготовить мазок, окрасить по Граму, промикроскопировать и убедиться в наличии однотипных бактерий.
IV. При наличии однотипных бактерий оставшуюся часть колонии (смесь № 1) засеять петлей штрихом на поверхность скошенного МПА для получения чистой культуры и поместить в термостат.
V. Изучить биохимические свойства бактерий. Сделать посевы для:
- определения протеолитических ферментов;
- обнаружения продуктов метаболизма: индола, H2S, NH3;
- определения гликолитических ферментов.
VI. Провести III этап выделения чистой культуры:
- Визуально отметить характер роста выделенной культуры на скошенном агаре (цвет, прозрачность, однородность);
- Приготовить препарат, окрасить по Граму и промикроскопировать. Убедиться в чистоте выделенной культуры;
- Определить семейство и род выделенной чистой культуры по "Определителю бактерий" Берги: 1) пользуясь "ключом" определителя (стр. 2425), установить часть определителя; 2) пользуясь "ключом" соответствующей части, определить семейство бактерий; 3) пользуясь "определителем", сделать посевы чистой культуры для последующего определения рода выделенной культуры бактерий.
VII. Сделать посевы для определения чувствительности к антибиотикам, УФО и химическим веществам.
VIII. Результаты исследований занести в протокол в виде таблицы:
| Морфологические свойства | Культуральные свойства | ||||
| Форма, расположение спор | Величина | Форма | Цвет | Край | Консистенция |
| | | | | | |
Тесты для проверки знаний:
- По наличию субстрата ферменты классифицируются на: а) экзоферменты, б) индуцибельные, в) конститутивные, г) эндоферменты.
Ответ: а, г
- Установить соответствие действия антибиотика на микроорганизмы:
1) Пеницилин а)блокирует синтез белка;
2) Стрептомицин б)нарушает синтез клеточной стенки;
в)нарушает синтез ДНК;
г)блокирует синтез пептидогликана
Ответ: 1) б, г; 2) а, в
Ключевые слова: антибиотики, ферменты, аэробы, облигатные анаэробы, факультативные анаэробы.
Занятие № 5
Тема: IV этап выделения чистой культуры. Влияние факторов внешней среды на микроорганизмы. Понятие о стерилизации и дезинфекции.
Цель занятия: Определить род и сделать посевы для определения вида выделенной чистой культуры. Изучить и дать оценку результатов воздействия на микроорганизмы физических, химических и биологических факторов внешней среды (анализ посевов предыдущего занятия); влияние антибиотиков на рост микробной культуры.
Материалы и оборудование: Студенческие посевы, микроскопы, бактериологические петли, "Краткий определитель бактерий Берги" (1980), чашки Петри с МПБ, среды (Гисса, Пешкова), центрифужные пробирки с плазмой крови для определения коагулазы.
Вопросы для обсуждения:
1. Подвижность бактерий, методы определения.
2. Методы оценки антимикробного действия факторов внешней среды.
3. Понятие о стерилизации.
4. Методы стерилизации.
5.Понятие о дезинфекции. Дезинфецирующие химические вещества и механизм действия на микробную клетку.
I. Антимикробное действие факторов внешней среды
1.Температура. Наибольшая температура, при которой возможно развитие микроорганизмов, называется максимальной. Большинство микроорганизмов плохо переносит превышение максимальной температуры развития. Уже при 5560 оС возможна тепловая коагуляция белка, при которой клетка погибает. Для уничтожения вегетативных форм большинства
микроорганизмов используют температуру в пределах 61.585.0 оС и экспозицию от 3 до 30 минут. Гибель микроорганизмов под воздействием высоких температур наступает вследствие денатурации клеточных белков, разрушения осмотического барьера клетки, нарушения равновесия ферментативных реакций и т.д.
2.Кислотность среды. Большинство микроорганизмов развивается в нейтральной (рН = 7.0), слабощелочной (рН = 7.27.3) или слабокислой (рН = 6.86.9) среде. Для мицельных грибов и дрожжей благоприятной является слабокислая среда, для бактерий нейтральная. На развитие микроорганизмов влияют значительные отклонения концентраций водородных и гидроксильных ионов от видовых потребностей к реакции среды.
3. Осмотическое давление. При высокой концентрации растворенных в воде веществ у большинства микроорганизмов наступает плазмолиз клетки протоплазма выделяет воду и уплотняется; затормаживаются процессы обмена веществ и клетка переходит в состояние анабиоза. Некоторые виды микроорганизмов (осмофилы) способны легко переносить высокие концентрации растворов и даже нуждаются в них.
4. Антисептики. Это химические вещества, избирательно действующие на микроорганизмы. Относятся к группе общепротоплазматических ядов, действующих не только на микроорганизмы, но и на любую живую или растительную клетку. В качестве антисептиков широко применяют 0.55.0%-ные растворы фенола, 0.110%-ные растворы хлорной извести.
5. УФО. Рассеянный свет не оказывает заметного отрицательного влияния на большинство бактерий. Прямой солнечный свет действует на них губительно. Сильным бактерицидным действием обладают ультрафиолетовые лучи. УФО вызывает повреждения матричной РНК, обусловленные разрывом связей в тиминовых димерах. Повреждения, вызванные УФО, частично обратимы.
II. Стерилизация
Стерилизация (лат.sterilis бесплодный) полное уничтожение микроорганизмов в питательной среде, посуде и т.д. В основу стерилизации положена способность бактерицидных агентов вызывать гибель микроорганизмов и их спор. К таким агентам относятся высокая температура, лучевая энергия, некоторые химические соединения.
- Стерилизация под действием высоких температур. Эффективность бактерицидного действия температурного фактора зависит от степе -
ни нагревания, продолжительности воздействия данной температуры, вида микроорганизма и состава среды, в которой он культивируется.
Стерилизация под воздействием высоких температур осуществляется разными способами:
1. Прокаливание (фламбирование) до и после употребления прокаливание в пламени спиртовки бактериологической петли, иглы, кончиков пинцетов и других металлических предметов.
2. Стерилизация кипячением производится в стерилизаторе на слабом огне, во избежание разбрызгивания жидкости.
3. Пастеризация означает нагревание при 6580 оС 30 минут с последующим быстрым охлаждением до 1011 оС; направлена на уничтожение вегетативных клеток бактерий и спор грибов. Пастеризация используется в пищевой промышленности.
4. Стерилизация фильтрованием используется для стерилизации синтетических сред определенного состава, которые содержат легкоразлагающиеся или летучие компоненты витамины, аминокислоты цистеин и цистин, белки, ароматические углеводы, их производные и пр. Фильтрование жидкостей осуществляется через мелкопористые материалы, легко адсорбирующие клетки микроорганизмов: асбест, целлюлозу, фарфор, каолит. Для стерилизации используют также фильтры, изготовленные из каолина с примесью кварцевого песка, "свечи" Шамберлена, и из инфузорной зелени "свечи" Бернфельда.
5. Стерилизация горячим воздухом (сухим жаром) осуществляется в сушильных шкафах при температуре 160180 оС в течение 2 часов.
6. Стерилизация текучим паром (тиндализация) применяется для сред, портящихся под действием температур больше 100 оС. Используют дробную стерилизацию в кипятильнике Коха по 30 минут в течение трех дней ежедневно.
7. Стерилизация насыщенным паром под давлением основывается на нагревании материала насыщенным паром при давлении выше атмосферного. Режим стерилизации (избыточное давление и время) выбирают в зависимости от характера стерилизуемого материала. Стерилизацию проводят в автоклаве, который представляет собой герметически закрывающийся двустенный металлический котел.
II. Стерилизация облучением связанна с использованием УФлучей, источником которых являются специальные бактерицидные лампы. На клетки бактерий летальный эффект оказывают ультрафиолетовые, рентгеновские, гамма-, альфа-, бета-лучи и нейтроны.
III. Химическая стерилизация (дезинфекция) представляет собой удаление или разрушение патогенных микробов, находящихся на неживых поверхностях или объектах, с помощью дезинфицирующих веществ. Бактерицидное действие химических агентов обуславливается активностью функциональных групп, концентрацией активного компонента данного вещества, длительностью контакта, рН, температурой, влажностью, присутствием органического вещества. В качестве дезинфицирующих агентов применяют галогены, фенол и их производные, соединения тяжелых металлов, спирты, микробоцидные газы и т.д.
Ход работы:
I. Произвести учет пестрого ряда:
- Учесть изменение цвета сред пестрого ряда, отметить наличие или отсутствия выделения газообразных продуктов;
- Определить наличие индола, аммиака и сероводорода по изменению цвета индикаторных бумажек. Заполнить сводную таблицу биохимических свойств бактерий и наличия продуктов метаболизма.
| Физиологические свойства | |||||
| | МПБ | ||||
| Тип дыхания, рост по уколу в МПА | Глюкоза | Каталаза | Сероводород | Индол | Аммиак |
| | | | | | |
II. Определить род выделенного микроба по соответствующей групповой таблице, используя "Краткий определитель бактерий Берги (стр.266) и руководствуясь следующими признаками:
1. Движение (подвижный, неподвижный);
2. Расщепление глюкозы до газа (+) / (-) или кислоты (+) / (-);
3. Наличие или отсутствие каталазы (+) / (-);
4. Наличие или отсутствие сероводорода (+) / (-);
5. Наличие или отсутствие индола (+) / (-);
- Наличие или отсутствие аммиака (+) / (-).
- Оценить бактерицидное действие физических и химических факторов внешней среды по наличию и величине задержки роста микробной культуры, обработанной УФО, сулемой, фенолом; измерить диаметр зоны.
- Результаты опыта записать по форме:
| Исследуемый признак | Фенол | Сулема | УФО | Заключение |
| Зона задержки роста | | | | |
| | | | | |
Проанализировать влияние антибиотиков на микробную культуру. Отметить отсутствие или наличие зоны задержки роста микробов. Отсутствие зоны задержки роста указывает на устойчивость выделенного вида микроорганизма к данному антибиотику.
Результаты записать по форме:
| Название антибиотика | Величина зоны задержки роста при действии, мм | Заключение |
| | | |
VI. Пользуясь "определителем", сделать посевы чистой культуры для последующего определения вида выделенной культуры бактерий.
VII.Результаты исследований и выводы занести в протокол.
Тесты для проверки знаний:
- Действие УФО связано с: а) бактерицидным действием на микробную культуру, б) нарушением целостности ЦПМ, в) действием на тиминовые димеры, г) действием на гликопептидный слой.
Ответ: а, в
- При тиндализации используются: а) УФО, б) стерилизация текучим паром, в) фильтрация, г) дробная стерилизация, д) кипятильник Коха.
Ответ: а, г, д
Ключевые слова: антисептики, стерилизация, дезинфекция, пастеризация, тиндализация