Geum.ru

Предисловие

Вид материалаМетодическое пособие
Занятие № 3
Материалы и оборудование
II. Накопительные культуры, принцип элективности.
Метод механического разобщения микроорганизмов
Биологический метод выделения чистой культуры
Метод физического воздействия
При химическом методе
Ход работы
Подобный материал:
1   2   3   4   5   6


Занятие № 3


Тема: Питательные среды. Выделение чистых культур бактерий (I этап).

Цель занятия: Изучить состав питательных сред, их классификацию, требования, предъявляемые к питательным средам. Освоить методы выделения чистых культур. Провести I этап выделения чистой культуры микроорганизмов из смыва вымени коровы.

Материалы и оборудование: Набор ингредиентов для приготовления питательных сред, готовые питательные среды, микроскоп, предметные стекла, бактериологическая петля, дистиллированная вода, растворы красок, этиловый спирт 96%-ный, пробирки с микробными культурами, иммерсионное масло, фильтровальная бумага.

Вопросы для обсуждения:

1. Питательные среды, их приготовление.

2. Основные типы сред, классификация.

3. Требования, предъявляемые к питательным средам.

4. Накопительные культуры и принцип элективности.

5. Микробные ассоциации (микробиоценозы).

6. Методы посева: штрихом, уколом, шпателем, тампоном.

7. Методы выделения чистых культур аэробных бактерий:
  • метод механического разобщения
  • биологический метод
  • методы физического воздействия
  • методы химического воздействия



I. Питательные среды

Питательные среды  это субстраты для питания микроорганизмов, применяемые в микробиологической практике для выращивания микроорганизмов в лабораторных или производственных условиях и выделения чистых культур (штаммов микроорганизмов). Чистая культура  это популяция микроорганизмов одного вида, выросшая на питательной среде. Штамм – это чистая культура микроорганизмов, выделенная из того или иного источника. Культуры одного вида, выделенные из разных источников или из одного источника в разное время, считаются разными штаммами и могут отличаться друг от друга по свойствам.


Классификация питательных сред


По физическим свойствам
По составу
По назначению

1. жидкие – МПБ, 1% пептонная вода
1. простые
1. общие (универсальные)  МПБ, МПА

2. полужидкие  полужидкий МПА (концентрация агара до 1%)
2. сложные  КАА
2. элективные  солевые, щелочной природы

3. плотные – МПА (концентрация агара 23 %)
3. синтетические  Сотона
4. дифференциально-диагностические  Эндо, Олькеницкого, цветной ряд Гисса







5. консервирующие – тиоглюколиевая, глицериновая


Требования, предъявляемые к питательным средам:

 должны быть питательными, т.е. содержать в легко усвояемом виде все вещества, необходимые для метаболизма;

 должны иметь оптимальную рН, так как концентрация ионов водорода влияет на проницаемость оболочки. Для большинства патогенных микроорганизмов оптимальна слабощелочная среда, за исключением: холерного вибриона (рН  8.59.0), туберкулезной палочки (рН  6.26.8), грибов р.Candida (рН  6.26.8);

 должны обладать буферностью  содержать вещества, нейтрализующие продукты обмена;

 должны быть изотоничными для микробной клетки  осмотическое давление в среде должно соответствовать давлению внутри клетки. Для большинства микроорганизмов оптимум составляет 0.5% NaCl;

 среды должны быть стерильными и прозрачными;

 плотные среды должны быть влажными и иметь необходимую консистенцию;

 среды должны иметь определенный окислительно-восстановительный потенциал (r H2), который показывает насыщение среды кислородом. Аэробные микроорганизмы имеют высокий окислительно-восстановительный потенциал, а анаэробные  низкий;
  • среды должны быть унифицироваными, т.е. содержать постоянные количества отдельных ингредиентов. Например: для патогенных энтеробактерий содержание аминного азота составляет 0.8 – 1.2 г/л, для дифтерии – 2.53.0 г/л.



II. Накопительные культуры, принцип элективности.

Методы выделения чистых культур

Накопительной называют культуру, в которой преобладают представители одной физиологической группы или одного вида микроорганизмов. Метод накопительных культур был введен в практику микробиологических исследований С.Н.Виноградским и М.Бейеринком. Сущность его заключается в создании элективных, т.е. избирательных условий, которые обеспечивают преимущественное развитие желаемых микроорганизмов или группы микроорганизмов из смешанной популяции.

При создании элективных условий учитывается физиология выделяемых микроорганизмов: источник питания; отношение к аэрации, температуре, кислотности среды; способность к образованию эндоспор. О получении накопительной культуры судят по появлению характерных признаков развития выделяемых микроорганизмов: помутнение среды, иногда сопровождаемое пигментацией; появление пленки, осадка; выделение газа.

В природных условиях и в макроорганизме микробы находятся в ассоциациях. Для выделения необходимого микроорганизма в чистую культуру используют несколько методов:
  1. Метод механического разобщения микроорганизмов представляет собой разобщение при посеве для получения изолированных колоний (посев штрихом петлей; метод "петли-дорожки"; метод Дригальского (рис. 1); метод серийных разведений).
  2. Биологический метод выделения чистой культуры заключается в том, что патологическим материалом заражается чувствительное к определенному виду микроорганизма экспериментальное животное. После его гибели микроб обнаруживается в мазках-отпечатках из органов при микроскопии, а также при посевах из органов на среды.
  3. Метод физического воздействия предполагает физическое отделение микробов друг от друга при посеве. Например: метод термического воздействия при отделении споровых культур от неспоровых или использование ультрафиолетового облучения.
  4. При химическом методе используют свойство устойчивости микроорганизмов к кислотам, спиртам и щелочам. Культивирование проводят на элективных средах: для стафилококка добавляют 15%-ный NaCl, для холерного вибриона – OH-. Химическими веществами можно подействовать на исследуемый материал, например: на мокроту больного с поозрением на туберкулез действуют 10 %-ной H2SO4, микобактерии туберкулеза кислотоустойчивы, а все остальные микробные формы погибают.



Р
ис. 1. Посев микроорганизмов на поверхность плотной среды: а – шпатель Дригальского; б – положение чашки и руки при посеве шпателем; в – рост микроорганизмов после рассева шпателем; г – рост микроорганизмов после рассева петлей


Ход работы:

I. Изучить набор ингредиентов для приготовления питательных сред: агар-агар, пептон, мясные кубики, желатин.

II. Изучить набор концентратов для приготовления сред: а) сухие полуфабрикаты, б) гидролизат рыбный.

III. Изучить готовые питательные среды.


IV. Выделить чистую культуру аэробов (I этап):
  • Приготовить препарат из смыва вымени коровы, окрасить по Граму;
  • Выявить различных по морфологии бактерий в изучаемой микробной ассоциации (смыв вымени) и зарисовать.

V. Выделить чистую культуру методом механического разобщения:
  • Произвести посев из смыва вымени коровы на чашку Петри с МПА методом Дригальского;
  • Произвести посев из смыва вымени коровы на чашку Петри с МПА методом "штриха".

VI. Выделение чистой культуры химическим методом (разбор).

VII. Выделение чистой культуры биологическим методом (разбор).

VIII. Выделить чистую споровую культуру из смеси СТИ (вакцинальный штамм) физическим путем (кипячением) и неспоровую культуру (протея) методом Шукевича:
  • Приготовить препарат из смеси бактерий № 2, окрасить по Граму и промикроскопировать. Отметить наличие крупных ГР(+) палочек (подозрение на споровую культуру) и мелких полиморфных ГР(-) палочек (подозрение на культуру протея), зарисовать;
  • Произвести посев исследуемой смеси № 2 для выделения чистой культуры Proteus vulgaris методом Шукевича на скошенный МПА (сеять только в конденсационную воду!);
  • Смесь № 2 прокипятить 5–10 минут и штрихом посеять на МПА.

IX. Все посевы подписать и поставить в термостат при 37 о С на 24 часа.

X. Результаты исследований занести в протокол.


Тесты для проверки знаний:
  1. Элективные среды: а) МПА, б) кровяной агар, в) щелочной агар,

г) солевой агар. Ответ: в, г

2. Вещества, необходимые для роста микроорганизмов: а) аминокислоты, б) индикаторы, в) витамины, г) ферменты, д) микроэлементы.

Ответ: а, в, д


Ключевые слова: питательные среды, накопительные культуры, элективность, чистая культура, микробные ассоциации (микробиоценозы), штамм