Автореферат диссертации на соискание ученой степени
| Вид материала | Автореферат диссертации |
- Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 378.33kb.
- Автореферат диссертации на соискание учёной степени, 846.35kb.
- Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 267.76kb.
- Акинфиев Сергей Николаевич автореферат диссертации, 1335.17kb.
- L. в экосистемах баренцева моря >03. 02. 04 зоология 03. 02. 08 экология Автореферат, 302.63kb.
- Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 645.65kb.
- Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 678.39kb.
- Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 331.91kb.
- Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 298.92kb.
- Автореферат диссертации на соискание ученой степени, 500.38kb.
На правах рукописи
ФЕДОТОВА
Мария Вадимовна
ВЛИЯНИЕ ЕСТЕСТВЕННЫХ РЕГУЛЯТОРОВ МЕТАБОЛИЗМА НА МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ СУСТАВОВ У КРЫС В НОРМЕ И ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ АРТРИТЕ
03.00.13 – физиология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
2008
Работа выполнена в ФГУ «Саратовский НИИ травматологии и ортопедии
Минздравсоцразвития
Научный руководитель:
доктор медицинских наук Митрофанов Владимир Александрович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук,
профессор Киричук Вячеслав Федорович
доктор биологических наук,
доцент Фельдман Бронислав Владимирович
Ведущая организация:
Самарский государственный медицинский университет РОСЗДРАВА
Защита состоится « 26 » декабря 2008 г.
в 13 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.009.01 при
Астраханском государственном университете по адресу: 414000, г.
Астрахань, пл. Шаумяна, 1
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Астраханского государственного университета по адресу: 414000, г. Астрахань, пл. Шаумяна, 1
Автореферат разослан « » ____________ 2008 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор биологических наук Нестеров Юрий Викторович
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Важную роль в функционировании организма играет опорно-двигательная система, одной из структурный единиц которой является сустав.
Нормальное функционирование суставов обеспечивается многими составляющими, например, образованием процессами синтеза и деградации хряща, которые находятся в равновесии в здоровом организме.
Изменения в суставах с их разрушением происходят интенсивно при старении организма, а также воздействии самых разнообразных повреждающих факторов. Поражения суставов у людей относятся к самой распространенной категории заболеваний (Статун А.Н., 2005; Черкашина М.О. и соавт., 2006; Зборовский А.Б. и соавт., 2007; Каратеев Д.Е., Олюнин Ю.А., 2008). . Как правило, это тяжелые хронические процессы, в том числе ревматические, облигатным проявлением которых является развитие аутоиммунного синовита, плохо поддающегося коррекции (Завадовский Б.В. и соавт., 2005; Зборовский А.Б. и соавт., 2005; Сучков С.В. и соавт., 2005; Прокопьева Н.Л. и соавт., 2008; Westwood O.M.R. et al., 2006). В связи с этим актуальной проблемой является поиск регуляторных механизмов, усиливающих восстановительные и подавляющие деструктивные процессы в суставах.
Вследствие того, что «традиционные» базисные противовоспалительные препараты во многих случаях не способны достаточно эффективно контролировать прогрессирование деструкции суставных тканей, необходимо использовать новые подходы к репаративной регенерации суставов, восстановлению их функциональной активности (Сигидин Я.А., Лукина Г.В., 2000; Сажин В.П., Беликова О.Д., Федотова Т.И., 2004; Сорока Н.Ф., Кевра В.М., 2005; Kraag G.R., 1989).
Одна из точек зрения на развитие повреждения суставов заключается в том, что происходит уменьшение синтеза и увеличение катаболизма в суставных тканях. Для сохранения гомеостатического равновесия в таких случаях можно использовать системные полиэнзимные комплексы, относящиеся к классу биорегуляторов (Зборовский А.Б., Стожаров М.Ю., Мозговая Е.Э., 2003; Лила А.М., Стернин Ю.М., Мазуров В.И., 2003; Гусейнов Н.И., Гусейнова Н.Н., 2005).
По данным литературы известно, что полиэнзимы оказывают противовоспалительное, противоотёчное, иммуномодулирующее, аналгезирующее действия, фибринолитический и тромболитический эффекты, улучшают реологические свойства крови (Ноуза К., 1994; Штаудер Г., 1996; Насонова В.А., Гавалов С.М., 1999; Зборовский А.Б. и соавт., 2003).Они способны также стимулировать процесс ликвидации иммунных комплексов и ингибировать активность компонентов комплемента (Мазуров В.И., Лила А.М., Стернин Ю.М., 1995; Насонова В.А., Гавалов С.М., 1999; Зборовский А.Б., Стожаров М.Ю., Мозговая М.М., 2003; Inderst R., 1992, Репина М.А., 2002, Сизякина Л.П.,2006). Однако вопрос о том, обладают ли полиэнзимы саногенетическими эффектами остается открытым. Нет четкой информации о том, могут ли энзимы в ранние сроки прервать прогрессирование физиологического воспаления и, тем более, привести к регрессу наступивших органических изменений, восстановлению нормальной структуры и функции органа. Исследования в этом направлении остаются актуальными.
Второй компонент регуляторного влияния на суставы — применение хондропротекторов. К известным хондропротекторам относятся глюкозамина сульфат - естественное низкомолекулярное вещество, участвующее в биосинтезе протеогликанов суставного хряща. Обоснование введения его извне для защиты хряща от разрушения весьма актуально (Павлов В.П., 1990; Копьева Т.П., Веникова М.С., 1992; Шелепина Т.А., 1996). В экспериментах доказано, что глюкозамин вступает в реакции биосинтеза ГАГ, стимулирует образование полноценных протеогликанов (ПГ), а также подавляет образование супероксидных радикалов и ферментов, разрушающих коллаген (Липец А.И. и соавт., 1996; Кудрявцев И.В. и соавт., 1998; Неверов В.А., Кишко А.И., Климов А.В., 1999; Барсукова Н.А., Пышнограева Л.В., Пешехонова Л.К., 2003; Dodge G.R. et al., 1999; Piperno M. et al., 2000). В литературе отсутствует информация о сравнительной эффективности полиэнзимов и хондропротекторов на восстановление морфофункциональных характеристик суставов.
Третий компонент регуляторных воздействий – это антигипоксанты. Их эффект связан с тканевой гипоксией, которая вносит весомый вклад в процессы деградации ПГ суставного хряща (СХ). Имеются экспериментальные и клинические данные о высокой эффективности антигипоксанта оксибутирата натрия (натриевая соль гамма-оксимасляной кислоты) при остеоартрозе (Красивина И.Г., Козлов Г.С., Носков С.М., 1996; Красивина И.Г., 1996,2001), травматическом повреждении суставов (Митрофанов В.А., Жадёнов И.И., Овчинникова Н.М., 1996; Митрофанов В.А., Овчинникова Н.М., 1997).
На сегодняшний день нет четкого представления и доказательной базы данных о возможном потенцирующем действии антигипоксантов на восстановление функциональной активности суставов при их локальном применении.
В силу изложенного, актуальным представляется проведение экспериментальных исследований, направленных на изучение эффектов естественных регуляторов метаболизма на морфо-функциональные характеристики суставов, коррекцию регенеративных процессов при экспериментальном моделировании повреждения суставов, среди которых наиболее тяжелые дисфункции связаны с процессами развития аутоиммунного воспаления. Такие модели позволяют получать информацию, важную и для медицины, где поиск безопасных регуляторных воздействий, может быть полезным для коррекции процессов при аутоиммунных артритах (АА).
Наиболее близкой к АА человека является экспериментальная модель адъювантного артрита (АдА) (Спасов А.А. и соавт., 2005; Hua J. et al., 2005), поэтому для выяснения закономерностей функциональной и структурной организации суставов и поиска главных точек приложения естественных регуляторов метаболических процессов использование данной экспериментальной модели является оптимальным.
Сравнительного исследования эффективности применения перечисленных препаратов при АА ни в клинических, ни в экспериментальных условиях проведено не было, хотя очевидно, что изучение таких подходов даст новое, более целостное представление о процессе развития нарушений в суставных тканях и динамике их восстановления. Это имеет важное значение для разработки более эффективных методов профилактики и лечения заболеваний опорно-двигательного аппарата.
В связи с вышеизложенным представляется перспективным комплексное изучение состояния суставных тканей при экспериментальном АдА в условиях сочетанного воздействия полиэнзимного препарата «Вобэнзим», хондропротектора «Дона», антигипоксанта «Оксибутират натрия».
Цель исследования: представить морфофункциональные характеристики суставов крыс и оценить влияние естественных регуляторов метаболизма на динамику изменений в организме животных при экспериментальном моделировании аутоиммунного артрита.
Задачи исследования:
1.Изучить влияние полиферментного препарата «Вобэнзим» на физиолого-иммунологические характеристики, включающие изменения в суставах крыс, общелабораторные, биохимические, интегральные иммунологические и гистоморфометрические показатели при экспериментальном моделировании АдА.
2.Определить действие хондропротектора «Дона» (глюкозамина сульфат) на процессы восстановления и регенерации суставов на экспериментальной модели АдА на основании общелабораторных, биохимических, иммунологических и гистоморфометрических параметров.
3.Исследовать физиолого-иммунологический статус крыс под действием антигипоксанта «Оксибутират натрия» на основании методов комплексной оценки изменения в суставах крыс с АдА, их функциональных возможностей и основных лабораторных, биохимических, иммунологических и гисто-морфометрических маркеров.
4.Определить действие сочетанного применения «Вобэнзима» и «Доны» на изменения в суставах крыс при их использовании в качестве регуляторных средств в условиях развития экспериментального АдА с помощью принятых в исследовании критериев (общелабораторных, биохимических, иммунологических и гистоморфометрических) .
5.Провести сравнительный анализ влияния веществ, модифицирующих биологический ответ (комбинированного применения вобэнзима, доны и оксибутирата натрия), на восстановление функции суставов, лабораторные, биохимические, иммунологические и гистоморфометрические параметры у крыс с АдА.
Научная новизна:
Впервые изучено влияние естественных регуляторов метаболизма (энзимов, гликозаминогликанов, антигипоксантов) на регенерацию суставных тканей, физиолого-иммунологические и морфологические показатели крыс с воспроизведенным экспериментальным АдА.
Впервые определено влияние сочетанного применения полиферментного препарата «Вобэнзим», хондропротектора «Дона» и антигипоксанта «Оксибутират натрия» в различных комбинациях на морфо-функциональные характеристики суставов у крыс.
Получены новые экспериментальные данные о влиянии этих препаратов на метаболические процессы, в частности, на состояние процессов перекисного окисления липидов [ПОЛ] (по уровню малонового диальдегида [МДА] в крови) и содержание ГАГ в соединительной ткани коленных суставов и крови животных.
Выявлено влияние предложенной комбинации препаратов на состояние морфологических структур синовиальной оболочки (СО) и СХ суставов экспериментальных животных.
Впервые при АдА изучена возможность снижения степени выраженности воспалительной деструкции тканей сустава с помощью комплексного применения полиферментного препарата, хондропротектора и антигипоксанта.
Научно-практическая значимость работы:
Экспериментальное моделирование АдА у крыс является адекватным методом, который может быть использован для оценки эффективности препаратов системного и местного действия на морфо-функциональные характеристики суставов.
В эксперименте на крысах разработан способ снижения степени выраженности воспалительной деструкции суставных тканей при АА при сочетанном применении полиферментного препарата «Вобэнзим», хондропротектора «Дона» и антигипоксанта «Оксибутират натрия». Получен патент RU на изобретение № 2169560 «Способ лечения аутоиммунного артрита» (по заявке № 20000114852 от 13.06.2000, опубл. 27.06.01, Бюл. № 18), превосходящий результаты других исследователей, отличающийся более выраженной способностью тормозить процесс воспалительной деструкции тканей сустава и позволяющий оптимизировать процесс регенерации суставных структур.
Получены доказательства того, что в суставах при воспалении развиваются процессы деструкции, обусловленные разными механизмами развития, и поэтому недостаточно чувствительными к отдельным препаратам даже системного действия, в связи с чем для нормализации и восстановления функциональных возможностей суставов целесообразно применение комбинаций препаратов, точкой приложения которых являются разные мишени.
Положения, выносимые на защиту:
1. В результате раздельного применения полиферментного препарата «Вобэнзим», хондропротектора «Дона» и антигипоксанта «Оксибутират натрия» у крыс с АдА происходит нормализация уровня ГАГ в сыворотке крови.
2. Сочетанное использование вобэнзима и доны приводит к нормализации СОЭ, количества лейкоцитов в цельной крови и уровня ГАГ в сыворотке крови.
3. Комбинация вобэнзима и доны, вводимых энтерально, оксибутирата натрия внутрисуставно вызывает нормализацию накожной температуры, СОЭ, количества лейкоцитов в крови, содержания МДА в крови и уровня ГАГ в сыворотке крови.
4. Несмотря на положительный эффект от использования вышеуказанных средств как по отдельности, так и в описанных выше комбинациях, уменьшение уровня аутоиммунного воспаления, у экспериментальных животных с АдА длительно сохраняются морфологические признаки тканевого воспаления: уменьшение количества фибробластов в СО, появление большого количества гистиоцитов, лимфоцитов и плазмоцитов, усиление функциональной активности воспалительно-клеточных элементов, повреждение микроскопических структур СО и СХ.
Апробация работы
Результаты исследования доложены на 61 научной конференции молодых ученых и студентов СГМУ (Саратов, 2000), III съезде ревматологов России (Рязань, 2001), Межрегиональной конференции молодых учёных «Новые технологии в диагностике и лечении травм и заболеваний опорно-двигательной системы», посвящённой 100-летию Я.Н.Родина (Саратов,
2003), VI съезде аллергологов и иммунологов СНГ (Москва, 2006), Научно-практической конференции молодых учёных, посвящённой 80-летию профессора Н.П. Решетникова "Травматология и ортопедия XXI века" (Саратов, 2007), заседании Саратовского областного научно-практического общества травматологов-ортопедов (Саратов, 2000, 2007, 2008), II съезде травматологов-ортопедов Уральского федерального округа (Курган, 2008).
Работа выполнена в рамках основного плана НИР ФГУ Саратовский НИИ травматологии и ортопедии Федерального агентства по оказанию высокотехнологичной медицинской помощи
Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 221 отечественный и 71 зарубежный источник. Работа иллюстрирована 33 рисунками и 14 таблицей.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материал и методы исследований
Объектом исследования были 130 белых лабораторных крыс со средней массой 200,0±10,0 г. На первом этапе исследования основные морфофункциональные характеристики суставов, гистологические параметры были изучены у 20 здоровых животных, которые составили серию контроля .
Для оценки влияния естественных регуляторов метаболизма на морфофункциональные параметры в условиях аутоиммунного воспаления у 110 крыс воспроизведен АдА с однократным введением полного адъюванта Фрейнда (Чернух А.М., 1979).
В работе использовались следующие методы:
1. Общелабораторные методы включали в себя оценку общего состояния животных (потребность в еде, состояние шерсти, подвижность) и местные проявления артрита (объём движений в суставах, их болезненность при пальпации, окружность коленных суставов, накожная температура в подколенной области). Осуществлялся также общий анализ крови (Лиманский и др., 1984) - определение СОЭ по методу Панченкова, подсчет количества лейкоцитов, количества эритроцитов в счетной камере Горяева.
2. Биохимические методы исследования включали:
а) определение состояния процессов ПОЛ по уровню МДА, общепринятого маркёра ПОЛ (Коробейникова Э.Н., 1989);
б) определение состояния метаболизма ПГ, характеризующего степень деструкции соединительной ткани (по содержанию ГАГ в сыворотке крови (Карякина Е.В., Косягин Д.В., 1982).
3. Для оценки степени выраженности иммунопатологических процессов изучали содержание циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) (Гриневич Ю.А., Алферов А.И., 1984).
4. Морфологические исследования включали оценку состояния макропрепарата и микроструктуры тканей коленного сустава (СО и СХ).
Гистологические препараты изучали следующими методами:
а) морфологический - окраска тканей сустава гематоксилином-эозином и пикрофуксином по Ван Гизону для изучения их структуры в целом (Меркулов Г.А., 1961);
б) гистохимический - окраска толуидиновым голубым для выявления ГАГ, как основного структурного компонента суставного хряща и пиронином по Браше для выявления рибонуклеотидов (показателя функциональной активности клеток);
в) морфометрический - количественная и качественная характеристика клеточных элементов (гистиоцитов, лимфоцитов, плазмоцитов и фибробластов) и морфологических проявлений патологических изменений суставных тканей - СО и СХ.
Морфологические признаки имеющихся изменений количественно определяли с помощью морфометрического анализа по 5 основным признакам поражения синовиальной оболочки: пролиферация синовиоцитов, отложение фибрина, воспалительная клеточная инфильтрация, пролиферация фибробластов, очаговый фиброз и 5 признакам поражения суставного хряща: убыль ГАГ, узурация поверхностного слоя, дистрофия хондроцитов, потеря хондроцитов, разволокнение матрикса.
Степень выраженности ПП тканей оценивалась с помощью окулярной измерительной сетки (Автандилов Г.Г., 1984) как по клеточному составу СО (соотношение фибробластов, гистиоцитов, лимфоцитов и плазмоцитов в %%), так и в баллах. Функциональная активность воспалительно-клеточных элементов определялась по пиронинофилии лимфоцитов и плазмоцитов (Шехтер А.Б., Крель А.А., Расщупкина З.П., 1985).
Для обоснования эффективности применения естественных регуляторов метаболизма у крыс с экспериментальным АдА изучали различные по своим механизмам действия субстанции - полиферментный препарат, хондропротектор и антигипоксант.
С этой целью, кроме 1-ой серии из 20 интактных крыс, составившей серию контроля и после обследования выведенной из эксперимента, сформированы следующие группы: 2-я серия - 20 животных с индуцированным адъювантным артритом, не получавших никаких препаратов (1-я серия сравнения); 3-я - 20-ти животным с воспроизведённым артритом (2-я серия сравнения, плацебо-контроль) ежедневно в течение 16 дней, в равных количествах, вводили внутрижелудочно плацебо в виде взвеси талька в воде; 4-я - 20-ти животным осуществлялось ежедневное (16 дней) внутрижелудочное введение вобэнзима ( 42,85 мг/кг массы тела); 5-я - 10 животных, которым ежедневно, так же 16 дней внутрижелудочно вводилась дона (21,4 мг/кг); 6-я - 10-ти животным внутрисуставно вводился оксибутират натрия 2 раза в неделю (5,7 мг/кг); 7-я - 20 животных получали ежедневно, внутрижелудочно, вобэнзим и дону (42,85 мг/кг и 21,4 мг/кг соответственно); 8-я - 10-ти животным проводилось внутрижелудочное введение вобэнзима и доны, с одновременным введением 2 раза в неделю внутрисуставно оксибутирата натрия (42,85мг/кг, 21,4 мг/кг и 5,7 мг/кг соответственно).
В работе были использованы следующие субстанции:
1. Полиферментное средство «Вобэнзим (WOBENZYM)» фирмы MUCOS Pharma GmbH & Co. (Германия), представляющее собой смесь протеолитических энзимов: панкреатина, трипсина, липазы, амилазы, химотрипсина, бромелаина, папаина, а также рутина.
2. Хондропротектор «Дона (DONA)» фирмы Rottapharm (Италия), содержит глюкозамина сульфат.
3. Антигипоксант «Оксибутират натрия» (Россия), натриевая соль гамма оксимасляной кислоты.
4.Тальк (силикат магния) - индифферентный наполнитель для приготовления паст и таблеток был использован в качестве плацебо.
Количество вводимых препаратов рассчитывалось на основании дозировок, рекомендованных в инструкциях по их применению.
Введение препаратов начинали на третьи сутки после моделирования артрита, когда появлялись его выраженные клинические признаки. Животных выводили из опыта после обследования методом декапитации под эфирным наркозом сразу после окончания введения препаратов. Кровь для исследования бралась из тела после декапитации. Коленные суставы забирались целиком для гисто-морфометрического исследования.
Все полученные данные обрабатывали общепринятыми методами статистического анализа. Первичная статистическая обработка проводилась методами вариационной статистики с вычислением средней арифметической (М), ее ошибки (m) , коэффициента достоверности (t), показателя вероятности (Р). Все расчеты проводились с применением пакета статистических программ STATISTICA 6.0.
Результаты исследований и обсуждение
Основные биологические показатели и морфо-функциональные параметры суставов здоровых животных
Здоровые крысы в начале эксперимента характеризовались обычным для данного вида поведением, животные были активны, проявляли любопытство, ели с аппетитом. Шерсть была гладкая, блестящая, чистая. Отсутствовали выделения из глаз и ушей. Движения в коленных суставах были свободные и безболезненные.
Окружность правого коленного сустава составляла 4,150,03 мм, накожная температура в подколенной ямке - 34,060,04С.
Гематологические показатели соответствовали норме. СОЭ составляла 3,000,02 мм/ч, в крови количество лейкоцитов - 12,600,04109/л, количество эритроцитов - 6,500,131012/л.
Уровень МДА в крови, характеризующий процессы ПОЛ у здоровых крыс, составлял 2,860,11 мкмоль/л. Количество ГАГ в сыворотке крови, отражающее состояние метаболизма ПГ, составляло 1,390,04 г10-2/л по уроновым кислотам и 3,580,05 г10-2/л по гексозам.
Содержание ЦИК в сыворотке крови соответствовало нормальной реактивности иммунной системы и составляло 8,251,18 усл.ед.
Клеточный состав СО здоровых крыс характеризовался значительным преобладанием фибробластов с единичными лимфоцитами, гистиоцитами и плазмоцитами. ПП СО и СХ у здоровых животных отсутствовали (сумма баллов ПП равна 0).
По окончании срока наблюдения (16 дней) у животных контрольной серии (1-я серия, здоровые крысы) не было выявлено изменений во внешнем виде и поведении. У них сохранялась, высокая двигательная активность, гладкая и блестящая шерсть, чистые глаза и уши. Подвижность в обоих коленных суставах, объём активных и пассивных движений оставалась такой же, как в начале эксперимента, болезненность при пальпации коленных суставов отсутствовала.
Окружность сустава оставалась неизменной. Также не обнаружено каких-либо изменений накожной температуры в области правого коленного сустава.
СОЭ оставалось на нормальных цифрах, отсутствовали изменения в количестве лейкоцитов и эритроцитов.
Биохимические показатели (уровень МДА и ГАГ) оставались такими же, как и в начале эксперимента.
Неизменным оставалось количество ЦИК в сыворотке крови.
Изменение биологических и морфо-функциональных характеристик у крыс при воспроизведении АдА
У всех 110 иммунизированных животных после введения под подошвенный апоневроз правой стопы полного адъюванта Фрейнда развивался артрит. Формирование АдА подтверждалось общеклиническими методами исследования. На 2-3-и сутки после иммунизации крысы становились вялыми, агрессивными, малоподвижными, шерсть становилась тусклой, взъерошенной. При движении они избегали наступать на больную конечность. У всех иммунизированных животных отмечалось снижение аппетита. На 2-3-и сутки после иммунизации развивались выраженные отёки мягких тканей стопы и припухлость в области поражённых суставов - межфаланговых, плюснефаланговых, голеностопного и коленного. Отмечалось значительное снижение объёма активных и пассивных движений в опытных коленных суставах и выраженная болезненность при их ощупывании (животное проявляло агрессивность и отдёргивало лапу). Максимальное увеличение окружности правых коленных суставов наблюдалось на 2-3 день после введения адъюванта и оставалось неизменным до конца эксперимента, составляя в среднем 3 мм. В табл.1-4 представлены основные изучаемые параметры у крыс с воспроизведенным АдА по сравнению со здоровыми животными.
Табл.1