Новые бактериальные патогены в пищевых продуктах: экспериментальное обоснование и разработка системы контроля с применением методов микробиологического и молекулярно-генетического анализа 14. 02. 01 гигиена
| Вид материала | Автореферат |
- Чичило Олег Сергеевич Обоснование лечения пародонтита на фоне артрита с применением, 308.22kb.
- Antonio Valverde Университет Альмерии, Испания содержание метод валидации и процедуры, 785.5kb.
- Экспериментальное обоснование методов подготовки агентов для вытеснения вязкой нефти, 366.85kb.
- Обоснование и разработка эффективных методов лекарственного обеспечения на уровне высокоспециализированной, 3030.03kb.
- Научно-производственное объединение «Химавтоматика» Новый измерительный комплекс для, 111.73kb.
- Введение в курс. Цели и задачи семинара 15-10. 50 Тема №1 «Организация системы внутреннего, 55.66kb.
- Грант нш-197. 2008. 4 Роль организации и экспрессии генетического материала в наследственной, 23.51kb.
- Задач и эффективная их экспансия в новые экономические приложения, 49.14kb.
- Лекция: Этапы проектирования ис с применением uml: Основные типы uml-диаграмм, используемые, 209.83kb.
- Программа предусматривает проведение семинарских занятий, на которых проводится обсуждение, 15.08kb.
Примечания:
«+» - 90-100% штаммов положительные; «(+)» – 21-89% штаммов положительные;
« - » - 0 - 9% штаммов положительные; «(-)» - 10-24% штаммов положительные.
Оценивая значение E. sakazakii как оппортунистического патогена для новорожденных, установлена вариабельность биологических свойств возбудителя и необходимость уточнения классификации на основе подробного анализа филогенетических связей выделяемых штаммов.
Общая направленность экспериментальных исследований по проблеме оценки риска возникновения E. sakazakii –ассоциированных заболеваний у новорожденных определялась и интерпретировалась в свете новейших данных о таксономическом положении возбудителя. С использованием последней (альтернативной) классификации E. sakazakii как пяти отдельных видов в составе нового рода «Cronobacter» были изучены и заново типированы штаммы E. sakazakii и Pantoea spp., выделенные при посеве 85 образцов продуктов, предназначенных для питания детей первого года жизни (табл. 12).
Таблица 12
Результаты типирования штаммов, выделенных из детских смесей
| Исследованные штаммы | Источник выделения | Тесты идентификации | Видовая принадлежность по классификации рода Cronobacter | ||||
| Сбраживание дульцита | Индол | Утилизация малоната | Сбраживание метил –α-D- глюкозида | утили-зация сорбита | |||
| E.sakazakii № 1M | Сухая смесь | - | - | - | + | - | Cronobacter sakazakii subsp. sakazakii |
| E.sakazakii № 4/2 | Сухая смесь | - | - | + | + | - | Cronobacter sakazakii subsp. malonaticus |
| Референс-штамм E.sakazakii | | - | - | - | + | - | Cronobacter sakazakii subsp. sakazakii |
| Pantoea spp. №1/1 | Сухая каша | + | - | + | + | - | Cronobacter turicensis |
| Pantoea spp. № 2/5 | Сухая смесь | - | - | + | + | - | Cronobacter sakazakii subsp. malonaticus |
| Pantoea spp. № 4/5 | Сухая каша | + | - | + | + | + | Не соответствует роду Cronobacter |
| Pantoea spp. № 8/2 | Рисовая мука | + | - | + | + | + | Не соответствует роду Cronobacter |
| Buttiauxella agrestis№ 84/1 | Сухая смесь | - | - | + | - | - | Не соответствует роду Cronobacter |
С учетом полученных развернутых биохимических профилей все выделенные штаммы, идентифицированные как E.sakazakii, соответствовали характеристикам вида Cronobacter sakazakii (subsp. sakazakii и subsp. malonaticus). Наиболее часто выделяемые микроорганизмы рода Pantoea, которые не входят по традиционной классификации в группу колиформных бактерий и не учитываются при оценке безопасности детских инстантных продуктов, по результатам проведенных исследований были отнесены к роду Cronobacter: два из четырех изученных штаммов были реклассифицированы как Cronobacter turicensis и Cronobacter sakazakii subsp. malonaticus.
Установлено, что виды Cronobacter sakazakii subsp. sakazakii, Cronobacter sakazakii subsp. malonaticus и Cronobacter turicensis ассоциируются с неонатальными инфекциями, в то время как штаммы, идентифицированные как Cronobacter muytjensii и Cronobacter dublinensis, были выделены из асептически полученного клинического материала (костной ткани и крови). Введение новых таксономических единиц упрощает включение вышеназванных потенциальных патогенов в систему контроля на наличие E.sakazakii, поскольку схемы идентификации, предложенные для этого вида микроорганизмов, могут быть распространены на весь род Cronobacter.
Результаты экспериментальных исследований доказали возможность неполного выявления патогенных представителей вида E.sakazakii (Cronobacter) при использовании общепринятых систем и тестов биохимической идентификации энтеробактерий. Поэтому в целях дальнейшего совершенствования дифференциации бактерий рода Cronobacter от других представителей семейства Enterobacteriaceae, включая новые недостаточно изученные группы бактерий с неясным таксономическим положением (Enterobacter turicensis, Enterobacter helveticus, Buttiauxella agrestis, Kluyvera spp., Leclercia adecarboxylata, Hafnia alvei и др.), предложена новая схема идентификации Cronobacter spp, включающая основные биохимические тесты – маркеры (образование желтого пигмента; α-глюкозидазная активность; способность к утилизации цитратов; реакция Фогес-Проскауэра; наличие аргинин дегидрогеназы; ферментация раффинозы и сахарозы).
Проведенные исследования позволили сформулировать новый подход к контролю сухих инстантных смесей для питания детей раннего возраста (в том числе для недоношенных и новорожденных детей), включающий количественный учет бактерий семейства Enterobacteriaceae и расширенную биохимическую идентификацию всех культурально - морфологических типов изолятов для исключения возможного присутствия E. sakazakii и других новых патогенов кишечной группы.
Обнаружение E. sakazakii в 300 г инстантных молочных продуктов, предназначенных для детей раннего возраста, должно рассматриваться как присутствие патогенных бактерий в исследуемых образцах, и служить основанием для запрета использования такой продукции с принятием соответствующих мер, направленных на обеспечение безопасности продуктов детского питания.
Новый микробиологический показатель безопасности (отсутствие E. sakazakii в 300 г продукта) послужил отправной точкой при пересмотре действующих нормативов с целью ужесточения требований в отношении продуктов для питания детей раннего возраста. Этот показатель включен в проект Санитарных правил «Дополнения и изменения к СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов», дополняющий требования безопасности продуктов детского питания микробиологическим нормативом «Патогенные микроорганизмы Enterobacter sakazakii».
Для практической реализации нового подхода к контролю детских продуктов разработаны и введены в действие Методические указания МУК 4.2.2428-08 «Метод определения бактерий Enterobacter sakazakii в продуктах для питания детей раннего возраста». Методическая схема определения E. sakazakii представлена в табл.13. Таблица 13
Схема исследования сухих детских смесей на наличие E.sakazakii
| Этап | Время инкубации, ч | температура |
| 1. Неселективное инкубирование пробы массой 100 г в фосфатном буферном растворе (ФБР) в соотношении 1:10 | 18-24 | 36оС |
| 2. Посев 10 см3 проинкубированной суспензии в селективный питательный бульон (1:10) для выделения бактерий семейства Enterobacteriaceae (среда Кесслер с глюкозой или бульон Мак-Конки с глюкозой или бульон с желчью, бриллиантовым зеленым и глюкозой) и инкубация | 18-24 | 36оС |
| 3. Пересев 0,1 см3 проинкубированного бульона для выделения Enterobacteriaceae на поверхность фиолетово-красного желчного агара с глюкозой (VRBG agar) или агара Эндо | 18-24 | 36оС |
| 4. Отбор 5 подозрительных на E.sakazakii колоний и пересев на триптон-соевый агар с дрожжевым экстрактом (TSYEA) и инкубация | 48-72 | 25оС |
| 5. Отбор колоний с желтым пигментом, микроскопия по Граму и подтверждение их видовой принадлежности | | |
| 6. При обнаружении в 100 г продукта бактерий семейства Enterobacteriaceae - посев 3 проб по 100 г в соответствии с п.п.1 -4 для выявления или подтверждения отсутствия E.sakazakii по п.5 | | |
| 7.При необходимости - подсчет наиболее вероятного числа (НВЧ) по количеству положительных проб в каждой из навесок продукта | | |
4. Значение некоторых потенциально патогенных микроорганизмов в возникновении эмерджентных пищевых токсикозов
Новые данные о появлении среди известных токсических метаболитов бактерий и грибов так называемых «суперантигенов» и других модуляторов системных иммунных реакций (в результате длительного селекционного давления, в том числе в окружающей среде) требуют углубленного изучения свойств этих микроорганизмов и их потенциальной роли в возникновения эмерджентных пищевых токсикозов. К ним относятся заболевания, вызываемые токсигенными штаммами S.aureus, пищевые отравления смешанной этиологии, вызываемые S.aureus в сочетании с B.cereus, протеем, E.coli и другими условно патогенными бактериями, а также микроскопическими грибами – продуцентами новых видов микотоксинов. Появление новых токсигенных штаммов и усиление вирулентных свойств продуцируемых ими метаболитов обуславливают необходимость проведения микробиологических и токсикологических исследований в этой области применительно ко всем аспектам безопасности питания.
В целях совершенствования системы микробиологического контроля пищевых продуктов выполнена работа по изучению условий накопления в них токсинов потенциально патогенными и токсигенными микроорганизмами с созданием методов их выявления, идентификации и количественного определения.
Установлена высокая степень контаминации сырого молока коагулазоположительными стафилококками (табл.14), продуцирующими энтеротоксины типов А и В, обладающими т-ДНКазной и лецитиназной активностью (в количестве 103 – 105 КОЕ/см3 – свыше 30% изученных проб). В 23,7% образцов «российского» сыра обнаружены S.aureus в количестве 45 – 500 КОЕ/г продукта. Показано, что молоко и сыр могут служить источником попадания в организм человека энтеротоксигенных стафилококков, способных стать причиной возникновения пищевых интоксикаций.
Таблица 14
Контаминация стафилококками сырого молока
| Показатель | Количество образцов | |
| Число | % | |
| Общее количество проб | 49 | 100 |
| Количество проб, обсемененных стафилококками | 48 | 97,9 |
| Количество проб с наличием коагулазоположительных стафилококков | 26 | 53,1 |
| В том числе с содержанием клеток в 1 см3: менее 1000 | 10 | 20,4 |
| от 1000 до 10000 | 12 | 24.5 |
| от 10000 до 100000 | 4 | 8,2 |
| Количество выделенных штаммов стафилококков | 57 | |
Проведен анализ культуральных и биохимических свойств 137 штаммов стафилококков, выделенных из молока и сыров, установлена высокая степень корреляции между способностью S.aureus продуцировать энтеротоксины и наличием ферментов коагулазы, термостабильной ДНКазы и другими факторами патогенности (рис.9).
| 1 – число исследованных штаммов; | 4 - коагулаза (+), т-ДНКаза (+), энтеротоксин (-) |
| 2 – коагулаза (-), т-ДНКаза (-), энтеротоксин (-) | 5 - коагулаза (+), т-ДНКаза (+), энтеротоксин (+) |
| 3 - коагулаза (+), т-ДНКаза (-), энтеротоксин (-) | 6 - коагулаза (-), т-ДНКаза (-), энтеротоксин (+) |
Рис.9. Факторы патогенности штаммов стафилококков, выделенных из молока и сыра
Изучены условия выживания энтеротоксигенных стафилокков при моделировании процессов производства и хранения плавленых сыров. Установлена возможность размножения S.aureus в сырной массе до плавления и накопления значительных доз энтеротоксина, устойчивого при термической обработке[Karlikanova N.R. et al., 1994].
Показано, что плавление сырной массы не приводит к инактивации энтеротоксинов, хотя их концентрация несколько снижается (на 23 - 42%). При малых исходных концентрациях (50 нг/г) в плавленом сыре выявлялись незначительные количества токсина – менее 3% от исходной дозы. В процессе хранения плавленого сыра в течение 30 и 45 суток существенных изменений в содержании энтеротоксинов не выявлено (рис.10).
Рис.10. Содержание энтеротоксина в модельных образцах плавленого сыра
Установлена возможность обнаружения стафилококковых энтеротоксинов в плавленых сырах при использовании сырья, обсемененного коагулазоположительными стафилококками, обладающими энтеротоксигенной активностью. Бактериальные клетки могут не обнаруживаться при микробиологическом контроле, тогда как накопившиеся в сычужных сырах или других пищевых компонентах энтеротоксины будут сохраняться после термообработки, достигая в готовом продукте значительного уровня, зависящего от исходной концентрации контаминанта и дозы токсина.
С целью создания метода выявления стафилококковых энтеротоксинов в пищевых продуктах проведена отработка оптимальных режимов и способов культивирования стафилококков, обеспечивающих накопление энтеротоксинов и других метаболитов S.aureus. Для получения концентрированных препаратов токсинов предложен метод выращивания культур на целлофане, помещенном на поверхность агаровой среды Хоттингера, обеспечивающий высокий выход энтеротоксина (50 – 100 мкг/см3). Для выявления низких концентраций токсинов в культуральных фильтратах стафилококков (0,5 – 1,2 нг/см3) рекомендовано использование ультрафильтрации через мембраны с диаметром с диаметром 0,70 и 0,45 нм, позволяющей сочетать концентрирование энтеротоксинов в ультрафильтрате с его обеспложиванием.
Показана возможность использования способности большинства энтеротоксигенных S.aureus образовывать термостабильную ДНКазу для экспресс-контроля пищевых продуктов на обсемененность коагулазоположительными стафилококками и наличие стафилококковых энтеротоксинов.
Для обнаружения стафилококковых энтеротоксинов предложено применение иммуноферментного твердофазного «сэндвич»-метода, что потребовало методической проработки некоторых стадий постановки ИФА. В частности, при подборе способов экстракции разработана модифицированная схема экстракции, очистки и количественного определения стафилококков. Применение данного метода позволяет выявить количественные закономерности степени сорбции энтеротоксинов, возможность расчетным путем устанавливать их фактическое содержание в продуктах различного физико-химического состава. Так, при исходном содержании энтеротоксина 10-50 нг/г (см3) степень его выявления данным методом ИФА в молоке и твороге составляет 50-60%, в сыре – 30 - 40%, в мясном бульоне – 50 - 55%, в кремово-кондитерских изделиях – 30 - 40%, в суфле – 15 – 20%. Тем самым создается возможность коррекции результатов анализа и установление истинных количеств токсина в исследуемых образцах, что имеет практическое значение при расследовании вспышек пищевых отравлений стафилококковой этиологии.
Углубленное комплексное исследование свойств энтеротоксигенных стафилококков послужило основой для совершенствования микробиологического нормирования возбудителя, а также для разработки эффективных ускоренных методов контроля пищевых продуктов на наличие стафилококков и стафилококковых энтеротоксинов. Результаты проведенных исследований практически реализованы при разработке Методических указаний МУК 4.2.2429-08 «Методы определения стафилококковых энтеротоксинов в пищевых продуктах», внедренных с 2009 г в лабораториях Роспотребнадзора и других ведомств, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов.
Совместное вегетирование S.aureus c другими условно-патогенными и патогенными микроорганизмами в различных видах пищевой продукции регистрируется довольно часто, в том числе при вспышках отравлений. Эта проблема заслуживает особого внимания, поскольку закономерности формирования смешанных биоценозов изучены недостаточно, что обусловило более детальную ее проработку в плане исследования взаимовлияния токсигенных штаммов B.cereus, S.aureus, E.coli и др.
При изучении взаимодействия различных эмерджентных микроорганизмов проведены серии экспериментов по совместному культивированию стафилококков – продуцентов энтеротоксина А с наиболее распространенными условно-патогенными бактериями, в том числе споровыми аэробами B.cereus, бактериями рода Proteus и E.coli. Установлено, что при одновременном культивировании S.aureus и B.cereus отмечается определенное взаимное синергетическое воздействие, сопровождающееся активизацией процесса токсинообразования энтеротоксигенными штаммами S.aureus. Степень этого взаимовлияния в значительной мере определяется условиями культивирования, составом питательных сред и соотношением исходных уровней контаминантов.
Совместное вегетирование S.aureus и B.cereus приводило к более интенсивному накоплению стафилококковых энтеротоксинов как в среде культивирования, так и в модельных продуктах (рис. 11), тогда как выращивание S.aureus совместно с бактериями рода Proteus или с E.coli не оказывало потенцирующего эффекта на интенсивность продукции энтеротоксинов стафилококками.
Рис.11. Накопление энтеротоксинов (нг/г) в продуктах при их заражении S.aureus в смеси с B.cereus.
В связи с появлением новых продуцентов токсических метаболитов мицелиальных грибов проведены микологические исследования по изучению условий, способствующих загрязнению продовольственного сырья одним из малоизученных микотоксинов – цитринином. Результаты экспериментов, выполненных в модельных системах, имитирующих нарушения условий хранения зерна и зернопродуктов, показали возможность интенсивного накопления цитринина в зараженных токсигенными плесневыми грибами Рenicillium citrinum зерновых субстратах. Наиболее высокие уровни цитринина обнаруживали в результате роста P.citrinum в рисе (300-350 мг/кг) при хранении зерна в условиях повышенной влажности и при температуре 30оС (рис.12).
Установлена высокая частота обнаружения среди грибов рода Рenicillium токсигенных штаммов – продуцентов цитринина (5,9%), что указывает на значительную степень риска для здоровья по требителей контаминации продовольственного зерна этим достаточно широко распространенным видом микроскопических грибов. Для получения данных о частоте и уровнях загрязненности цитринином исследуемых субстратов предложено использовать метод твердофазного иммуноферментного анализа с применением тест-систем «Ридаскрин фаст цитринин».
Рис. 12. Влияние температуры на продукцию цитринина штаммом P. citrinum