Новые бактериальные патогены в пищевых продуктах: экспериментальное обоснование и разработка системы контроля с применением методов микробиологического и молекулярно-генетического анализа 14. 02. 01 гигиена
| Вид материала | Автореферат |
- Чичило Олег Сергеевич Обоснование лечения пародонтита на фоне артрита с применением, 308.22kb.
- Antonio Valverde Университет Альмерии, Испания содержание метод валидации и процедуры, 785.5kb.
- Экспериментальное обоснование методов подготовки агентов для вытеснения вязкой нефти, 366.85kb.
- Обоснование и разработка эффективных методов лекарственного обеспечения на уровне высокоспециализированной, 3030.03kb.
- Научно-производственное объединение «Химавтоматика» Новый измерительный комплекс для, 111.73kb.
- Введение в курс. Цели и задачи семинара 15-10. 50 Тема №1 «Организация системы внутреннего, 55.66kb.
- Грант нш-197. 2008. 4 Роль организации и экспрессии генетического материала в наследственной, 23.51kb.
- Задач и эффективная их экспансия в новые экономические приложения, 49.14kb.
- Лекция: Этапы проектирования ис с применением uml: Основные типы uml-диаграмм, используемые, 209.83kb.
- Программа предусматривает проведение семинарских занятий, на которых проводится обсуждение, 15.08kb.
Характеристика штаммов энтеробактерий, выделенных из различных объектов
| Объекты исследования | Количество выделенных культур (%) | В том числе: | |||
| Лактозопо-ложительных | Цитратассимилирующих | Образующих индол | С ß-глюкуро-нидазой | ||
| Пищевые продукты | 66 (41.2%) | 61 | 38 | 14 (21.2%) | 10 (15,1%) |
| В том числе | |||||
| Молоко и молочные продукты | 12 (7,5 %) | 10 | 3 | 5 | 4 |
| Мясопродукты | 8 (5,0 %) | 5 | 3 | 2 | 7 |
| Продукция обществ. питания | 33 (20,6 %) | 31 | 26 | 5 | 7 |
| БАД к пище | 17 (10,6%) | 15 | 5 | 2 | 2 |
| Объекты внешней среды | 12 (7,5%) | 8 | 2 | 5 | 5 |
| Клинический материал | 82 (51,2 %) | 61 | 13 | 55 (67,1%) | 51 (62,2) |
| ВСЕГО: | 160 | 130 (81,2%) | 53 (33%) | 71 (44.3%) | 67 (42%) |
Количество штаммов E.coli, типичных по культурально-биохимическим признакам, в том числе обладающих способностью к образованию индола, не превышало 45% от общего числа исследованных штаммов. Из 70 исследованных штаммов эшерихий 3 были отнесены к серогруппе О157; эти культуры были выделены из клинического материала (при анализе на дисбактериоз и из мочи), а также из одного образца кисломолочного продукта – йогурта.
Большинство выделенных штаммов E.coli характеризовались высокой степенью патогенности, что подтверждалось наличием одного или нескольких факторов агрессии (токсинообразование, антилизоцимная, антиинтерфероновая активность, антибиотикорезистентность). Было установлено, что частота обнаружения штаммов E.сoli, обладающих антиинтерфероновой и антилизоцимной активностью, была более чем в 2 раза выше при исследовании клинического материала, нежели при анализе продуктов питания. Вместе с тем привлекает внимание факт проявления вышеназванных признаков патогенности не только эшерихиями, но и культурами родов Klebsiella и Enterobacter. Однако в этом случае штаммов с выраженной аггрессивностью обнаруживалось больше в продуктах питания (Klebsiella – 50%, Enterobacter – 24%). Результаты серологического типирования выделенных штаммов свидетельствовали о возможной контаминации пищевых продуктов энтерогеморрагическими эшерихиями, которые при определенных условиях могут способствовать развитию заболеваний, связанных с пищевым путем передачи.
Campylobacter spp. Учитывая значительную распространенность и циркуляцию в природе кампилобактеров, большое внимание исследователей уделяется частоте обнаружения этих микроорганизмов в различных объектах. Они присутствуют в окружающей среде как комменсалы или патогены в организме домашней птицы или животных, и могут персистировать длительное время при неблагоприятных условиях. В первую очередь C.jejuni рассматривается как нормальный комменсал кишечника птиц. Степень бактерионосительства у домашней птицы очень высока и достигает 90% [Куликовский А.В., 2004]. В содержимом кишечника кур количество C.jejuni может достигать 106 КОЕ/г.
Частота обнаружения бактерий рода Campylobacter у других видов сельскохозяйственных животных и птицы, а также в полученном от них сырье свидетельствует о значительном распространении этих микроорганизмов и о возможной контаминации вырабатываемых пищевых продуктов По данным различных авторов частота выделения кампилобактеров при обследовании мясного скота колеблется от 43 до 83%, молочных животных - 6 -64%, свиней – 50 - 69%, овец – 18 – 44%. Уровень обсеменения мяса домашней птицы достигает в отдельных случаях 100%, в среднем % положительных проб при исследовании тушек кур, индеек и уток составляет 58 -78% [Т. Humphrey et al., 2007]. Установлено, что при сравнительно высокой частоте обнаружения этих бактерий в разных видах мясного сырья наибольший риск для здоровья человека связан с употреблением куриного мяса, поскольку его удельный вес в структуре питания населения очень велик.
Результаты проведенных исследований показывают, что обсемененность Саmpylobacter spp. сырых птицепродуктов составила 37% (42 из 113), при этом Саmpylobacter наиболее часто обнаруживали в мясе и полуфабрикатах птицы натуральных, а также в субпродуктах, обсемененность которых составила 40% и 35% соответственно.
Salmonella spp. Для большинства зоонозных инфекций, в том числе для сальмонеллеза и кампилобактериоза, первостепенное значение имеет загрязнение сырья интестинальным содержимым при его производственной разделке и обработке. При этом уровень вторичной контаминации готового продукта находится в прямой зависимости от интенсивности заражения и степени бактерионосительства птиц и животных. По данным ФДА частота выделения сальмонелл в США в среднем составляла 5% от общего количества (более 4000) исследованных проб пищевого сырья [Shao-hua Jhao et al., 2003, Foley S.L. et al., 2008]. Контаминированное куриное мясо идентифицируется как один из основных пищевых источников бактерий рода Salmonella. При исследовании более 200 цыплят – бройлеров сальмонеллы были выделены в 23% случаев, при изучении загрязненности куриного мяса – сырья было обнаружено, что более 19% тушек бройлеров обсеменено бактериями рода Salmonella, 32% проб - C.jejuni, и около 20% - L. monocytogenes [Whyte P. Et al., 2002, van Nierq W. et al., 2005].
Тем не менее, собственные исследования 48 образцов мяса кур и субпродуктов, отобранных на предприятиях оптового продовольственного комплекса Московского региона, показали отсутствие бактерий рода Salmonella (в 25 г продукта). В тех же образцах L.monocytogenes были обнаружены в 3,9% случаев, а C.jejuni – в более 50% проб.
Обобщение сравнительных данных о частоте выделения некоторых видов эмерджентных патогенных бактерий показывает, что они характеризуются высокой степенью распространения в продовольственном сырье, поскольку являются зоонозными микроорганизмами и могут присутствовать в организме сельскохозяйственных животных и птиц (табл. 5).
Таблица 5
Частота выделения некоторых видов эмерджентных пищевых патогенов, %
| Патогены | Навоз или содержимое ЖКТ крупного рогатого скота и птицы | Говядина и птица (сырье) | Молоко-сырье |
| Salmonella spp. | 5,0 | до 19 - 23 | 6,1 |
| Campylobacter jejuni | до 90 | 32,0 | 9,2 |
| Энтеротоксигенные E.coli | 1,6 – 8,5 | 4-16 | 3,8 |
| L.monocytogenes (Listeria spp) | - | 1,7-3.2 (20,0) | 4,6 |
Таким образом, проведенные исследования вышеназванных патогенов позволили выявить экологическое своеобразие этих возбудителей, которое определяется специфическими закономерностями их распространения, детерминированностью источников выделения, вариабельностью уровней контаминации и частоты выделения. Неудовлетворительные условия получения, первичной обработки и хранения сырья становятся основной причиной интенсивного накопления широкого спектра условно патогенной и патогенной микрофлоры, на фоне которого возможно присутствие наиболее опасных возбудителей пищевых инфекций, в том числе энтерогеморрагических E.coli, сальмонелл, C.jejuni, L.monocytogenes и др. Дальнейшая переработка такого сырья сопровождается перекрестной контаминацией и попаданием возбудителей в готовые продукты, обуславливая высокую степень риска даже при соблюдении технологических режимов производства и хранения пищевой продукции. В свою очередь имеющие место нарушения традиционной технологии и внедрение новых, порой недостаточно изученных способов переработки, упаковки и хранения продуктов и полуфабрикатов являются не менее важными факторами риска обнаружения новых патогенов.
2. Оценка роли L.monocytogenes как одного из наиболее значимых новых патогенов
На современном этапе одной из наиболее актуальных задач обеспечения микробиологической безопасности пищевых продуктов является снижение риска возникновения пищевого листериоза – заболевания, вызываемого бактериями Listeria monocytogenes. Решение данной проблемы связано с необходимостью совершенствования методологии выделения и идентификации возбудителя, разработки эффективных ускоренных способов обнаружения L. monocytogenes в пищевых продуктах, основанных на применении современных методов анализа.
Существующие данные об обнаружении листерий в пищевых продуктах весьма противоречивы и свидетельствуют как о разных частоте и уровнях выявления L. monocytogenes, так и о большой распространенности наиболее близких к ним по фенотипическому профилю бактерий L.innocua. При этом используются различные методические схемы идентификации листерий, что затрудняет сопоставление полученных данных и существенно усложняет анализ эпидемиологической ситуации.
2.1. Межвидовая дифференциация и изучение фенотипических свойств листерий
Начиная с 2000 года проведена многоплановая работа, включающая изучение свойств листерий, скрининг новых штаммов L.monocytogenes и создание коллекции отечественных культур, персистирующих в пищевых продуктах, сырье и объектах внешней среды продовольственных предприятий. Для накопления данных о циркуляции различных видов листерий на основных стадиях пищевой цепи выполнены исследования с использованием традиционных методов бактериологического и биохимического анализа, позволяющих проводить выявление и видовую дифференциацию выделенных штаммов путем оценки ключевых фенотипических свойств микроорганизмов рода Listeria.
Всего проанализировано свыше 200 культур, выделенных из мясного и молочного сырья, полуфабрикатов, готовых мясопродуктов, сыра, творога, и различных объектов внешней среды (смывы с оборудования, инвентаря, посуды и др.). По результатам родовой идентификации к листериям были отнесены 125 штаммов, которые имели типичные морфологические и культурально-биохимические свойства. Исследованные штаммы по комплексу изученных свойств были отнесены к 4 видам: L.monocytogenes – 48 штаммов, L.innocua – 69 штаммов, L.welshimeri – 6 штаммов , L.ivanovii – 2 штамма.
Все культуры L.monocytogenes обладали гемолитической активностью, формируя на поверхности кровяного агара зоны просветления, интенсивность которых варьировала в зависимости от свойств штамма (от очень слабого до умеренного или хорошо выраженного ß-гемолиза). У слабо гемолизирующих штаммов активность культур усиливалась после нескольких пассажей на кровяном агаре. Штаммы L.innocua и L.welshimeri не обладали гемолитической активностью, рост L.ivanovii на кровяном агаре сопровождался образованием широких зон лизиса диаметром 3 мм и более. Лецитиназная активность была четко выражена у всех штаммов L.monocytogenes и L.ivanovii, тогда как листерии видов L.innocua и L.welshimeri не проявляли этого признака при культивировании на хромогенных средах и в присутствии активированного угля.
Все изученные штаммы L.monocytogenes не сбраживали ксилозу, маннит, лактозу, сахарозу и арабинозу; ферментировали с образованием кислоты (без газа) рамнозу, глюкозу и галактозу (табл. 6). Гидролиз сорбита, лактозы и мальтозы был непостоянным и определялся индивидуальными особенностями штаммов. По совокупности изученных признаков была подтверждена наибольшая информативность ферментативных тестов в отношении 3 углеводов – ксилозы, рамнозы и маннита, позволяющая проводить видовую дифференциацию L.monocytogenes от непатогенных листерий. Некоторые отклонения в сахаролитической активности тех или иных культур, подвижности, степени выраженности гемолиза, а также способности диссоциировать в стареющих культурах нередко отмечаются различными исследователями и характерны для внутривидовой изменчивости штаммов [Hammer P. et al., 1989, Карликанова С., 1994].
Таблица 6
Ферментативная активность выделенных штаммов листерий
| Виды листерий | Ферментация углеводов | |||||||||
| Ксилоза | Рамноза | Маннит | Арабиноза | Галактоза | Глюкоза | Лактоза | Мальтоза | Сахароза | Сорбит | |
| Выделенные штаммы | ||||||||||
| L.monocytogenes | - | + | - | - | + | + | ± | ± | - | ± |
| L.innocua | - | ± | - | ± | + | + | - | ± | - | ± |
| L.welshimeri | + | ± | - | - | - | + | - | + | - | ± |
| L.ivanovii | + | - | - | - | ± | + | ± | - | - | + |
| Коллекционные штаммы | ||||||||||
| L.monocytogenes 10527 | - | + | - | - | + | + | - | + | - | - |
| L.monocytogenes № 766 | - | + | - | - | + | + | - | + | - | + |
При тестировании выделенных культур листерий с использованием наборов для идентификации «API Listeria» ф.«BioMerieux» были подтверждены вышеописанные результаты типирования штаммов традиционными бактериологическими и биохимическими методами, при этом сходимость полученных данных в эксперименте превышала 95%.
На основе анализа зарубежного опыта и обобщения накопленных экспериментальных материалов разработаны и введены в действие Методические указания 4.2.1122-02 «Организация контроля и методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах» и ГОСТ Р 51921-2002 «Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes». Этими документами регламентируется применение вышеописанных бактериологических и биохимических тестов, позволяющих проводить выделение и идентификацию листерий по комплексу основных родовых и видовых фенотипических признаков.
2.2. Cовременный комплексный подход к идентификации листерий при микробиологическом контроле на предприятиях пищевой индустрии
Освоение высокоспецифичных комбинированных методов быстрой идентификации и типирования направлено на создание современных схем эффективного мониторинга за L. monocytogenes в продуктах питания на этапах их изготовления и хранения, получение более достоверных сведений о циркуляции этого возбудителя на предприятиях пищевой индустрии.
С этой целью проведена разработка методологии детекции патогенных листерий на основе комплексного применения традиционных и новых методов анализа. Работа включала подбор и сравнительную оценку стандартизованных микробиологических и биохимических методов в сопоставлении с молекулярно–генетическими методами. При этом изучали информативность и диагностическую значимость отдельных тестов идентификации листерий, определяли эффективность и чувствительность различных модификаций методов генотипирования и возможность их практического применения для экспресс-индикации L.monocytogenes.
Метод иммуномагнитной сепарации. Изучена возможность применения иммуномагнитной сепарации (IMS) при исследовании пищевых продуктов на наличие Listeria monocytogenes в различных вариантах предварительного обогащения проб с использованием тест-наборов «Listeria A-Beads» («Aureon Biosystems»).
В модельных экспериментах за счет IMS удавалось достигнуть 10-100 кратного концентрирования тест-микроорганизма, продолжительность процедуры при этом составляла 30-40 мин (табл.7).
Таблица 7
Выявление L. monocytogenes в суспензиях, обработанных методом IMS
| Расчетная концентрация тест-культур в пробах, lg КОЕ/см3 | Содержание листерий, выявленное микробиологическим посевом, lg КОЕ/см3 (n = 4) | ||
| L. monocytogenes | L.innocua | До сепарирования | После сепарирования |
| 1,0 | - | - | - |
| 2,0 | - | 0,9 + 0,3 | 1,6 + 0,51 |
| 3,0 | - | 2,60 + 0,27 | 3,36 + 0,33 |
| 4,0 | - | 3,61 + 0,44 | 5,15 + 0,79 |
| - | 3.0 | 3,09 + 0,55 | - |
| - | 4,0 | 4,08 + 0,35 | - |
Отмечено, что жизнеспособность клеток L. monocytogenes до и после сепарирования достоверно не изменялась. При оценке микро- и макроморфологии тест-штамма, а также скорости роста культуры установлено, что IMS не оказывает ингибирующего воздействия на L.monocytogenes и не меняет их культуральных свойств. Подтверждена специфичность метода: штаммы листерий вида L.innocua не взаимодействовали с индикаторными антителами, сенсибилизированными на магнитном носителе.
Получены сопоставимые результаты при использовании двух различных схем селективного обогащения L.monocytogenes при низком уровне контаминации (102 КОЕ/г) – 1-стадийной с последующей IMS и традиционной, предусматривающей двойное селективное обогащение посевов [Ефимочкина Н.Р. и др., 2003]. Включение в схему микробиологических исследований пищевых продуктов по показателю L. monocytogenes методики иммуномагнитной сепарации позволяет сократить время анализа до 4 суток в сравнении с классическим методом, продолжительность которого составляет не менее 6-7 суток. Данная схема может быть использована при разработке ускоренных методов определения L.monocytogenes в пищевых продуктах.
Метод ДНК-гибридизации. Исследована возможность определения L.monocytogenes в пищевых продуктах методом твердофазного гибридизационного метода ДНК-рРНК анализа с хемилюминесцентным детектированием в системе «LUMIProbe 24» (Франция). Мишенью в реакции ДНК - гибридизации являлась последовательность ДНК, кодирующая продукцию токсичного белка листериолизина.
Для оценки специфичности метода проведены исследования по видовой идентификации L. monocytogenes с использованием штаммов листерий как в монокультурах, так и смесях различных представителей рода. Результаты показали высокую специфичность (100%) и чувствительность метода. Данные были получены при анализе 11 штаммов L. monocytogenes и 14 штаммов листерий других видов - L. ivanovi, L. innocua, L. welshimeri. При оценке чувствительности метода с использованиием двух референс-штаммов L. monocytogenes было показано, что достоверная детекция возбудителя достигается при плотности бактериальной суспензии не менее 5х105- 1х106 КОЕ/см3. При меньших концентрациях клеток L. monocytogenes в испытуемых пробах величины люминесценции находились ниже или на уровне пороговой величины измерений.
Таким образом установлена возможность использования метода твердофазного ДНК-рРНК гибридизационного анализа с хемилюминесцентным детектированием для подтверждения видовой принадлежности штаммов L. monocytogenes, выделенных из пищевых продуктов и других объектов.
Для оценки эффективности метода ДНК-гибридизации при прямом выявлении L. monocytogenes в пищевых продуктах и объектах окружающей среды проводили экспериментальную контаминацию проб коллекционными штаммами L. monocytogenes. Контаминированные пробы инкубировали двукратно в течение 6 и 18 часов в бульоне Фрейзера и в RM Listeria бульоне, входящим в состав тест-наборов «LUMIProbe» и исследовали на наличие листерий (табл. 8).
Таблица 8
% открываемости проб продуктов, контаминированных L.monocytogenes
| Объекты исследования | Дозы контаминации, КОЕ/г (см3) | Результаты анализа,% (n=5) | |
| Методом ДНК - гибридизации | Бактериологическим методом | ||
| Рыбные продукты | 101 | 96,5 | 95,4 |
| 102 | 100 | 100 | |
| Салат «Столичный» | 101 | 85,0 | 85,0 |
| 102 | 100 | 96,7 | |
| 103 | 100 | 100 | |
| Фарш куриный | 101 | 84,7 | 84.7 |
| 102 | 100 | 90,0 | |
| 103 | 100 | 100 | |
| Молоко сырое | 101 | 85,8 | 85.8 |
| 102 | 96,7 | 86,0 | |
| 103 | 100 | 100 | |
| Кисломолочные продукты | 101 | 100 | 100 |
| 102 | 100 | 100 | |
| Сыры «адыгейский», «сулугуни», брынза | 101 | 67,0 | 67,0 |
| 102 | 100 | 100 | |
Анализ полученных данных показал, что метод ДНК-РНК гибридизации с наборами «LUMIProbe» позволяет определить наличие L. monocytogenes при уровнях исходной контаминации 10-100 КОЕ/г. Результаты исследований позволили разработать и впервые в России внедрить стандартизованный метод выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах на основе гибридизационного ДНК-анализа (МУК 4.2.1955-05).