Аттенуированной вакцины против краснухи
| Вид материала | Автореферат |
- Вакцинация против гриппа Почему вакцины против гриппа каждый год разные?, 389.79kb.
- Вакцинация. Прививки, 68.12kb.
- Лекция №3. Тема: профилактика туберкулеза, 67.13kb.
- Активизирующий опросник "За и против", 392.33kb.
- Название вакцины, 17.17kb.
- Встатье данной статье представлен подробный отчет об этапах разработки, испытаний, 472.34kb.
- Текст с ошибками "Александр Невский". Задание: Найдите в данном тексте ошибки и укажите, 20.96kb.
- Разработка и внедрение технологии промышленного производства и системы управления качеством, 660.17kb.
- Д-р Марк Сиркус Ртуть, вакцины и медицина, 266.55kb.
- Создание унифицированной системы управления эпидемическим процессом кори, краснухи, 666.42kb.
* порядковый номер нуклеотида в нуклеотидной последовательности гена определялся по референс-последовательности NC_001545; ** аминокислотное замещение в белке Е1
Полученные результаты свидетельствуют о том, что замена в структуре белка Е1: валин → изолейцин (57 АА -остаток) привела к полной аттенуации реактогенного (30% клинических реакций средней тяжести) варианта вируса и получению ареактогенного вакцинного штамма «Орлов». Значимые замены нуклеотидов в процессе аттенуации штамма «Орлов» были определены только в гене, кодирующем поверхностный гликопротеин Е1. Исходя из этого, сравнение двух вариантов штамма «Орлов» - вакцинного штамма «Орлов-В» и штамма «Орлов-Д» - было проведено по нуклеотидной последовательности гена Е1. В анализе использован штамм «Орлов-Д» после проведения пяти дополнительных пассажей в культуре клеток «М-22», т.к., согласно рекомендациям ВОЗ, культивирование вируса от вакцинного штамма до серии вакцины не должно превышать пяти пассажей в клетках-продуцентах [WHO. Technical Report Series, 1988].
При секвенировании амплификатов, полученных в результате фланкирования нуклеотидной последовательности гена Е1 (1443 п.о.), была выявлена полная идентичность нуклеотидных последовательностей обоих вариантов. Генетическая стабильность штамма «Орлов-Д» при многократном (не менее 5 пассажей) культивировании в диплоидной линии клеток «М-22» была подтверждена также стабильным rct40 ±- фенотипом штамма «Орлов-Д» на уровне 1-го, 5-го и 10-го пассажа вируса в культуре клеток «М-22».
Полученные результаты характеризует штамм «Орлов-Д» как генетически стабильный и пригодный для производства вакцины.
ЧЕТВЕРТОЕ ПОЛОЖЕНИЕ
Доклиническое изучение штамма «Орлов-Д» на обезьянах макака-резус специфической безопасности, специфической активности и иммунологической безопасности свидетельствует о его пригодности для получения вакцины против краснухи.
Доклиническое изучение штамма «Орлов-Д» проведено на базе ГУН НИИ медицинской приматологии РАМН, г. Адлер-Сочи. Методология проведения доклинических испытаний новых МИБП представлена в нормативном документе «Государственные испытания и регистрация новых иммунобиологических препаратов» (СП 3.3.2.561 – 96) и использована в данном разделе исследования. Выбор в качестве лабораторной модели макаков-резусов обусловлен тем, что приматы и, в частности, низшие приматы – единственный вид лабораторных животных, у которых можно моделировать инфекционный процесс, вызванный вирусом краснухи, сходный с таковым у человека по показателям продолжительности инкубационного периода и вирусовыделения, наличия вирусемии, динамики формирования вирусспецифических антител. В исследовании использованы клинически здоровые животные в возрасте 3-5 лет, массой 4 – 5 кг, самцы. Перед началом эксперимента обезьяны были выделены из стада, изолированы, обследованы на отсутствие заболеваний вирусными гепатитами, SIV-инфекцией герпетическими инфекциями, туберкулезом; карантинированы в течение 45 суток.
Согласно СП 3.3.2.561 –96, (п. 5.1.7.) в опыте использованы препараты сравнения однонаправленного действия: краснушная вакцина Rudivax (производства Санофи-Пастер, Франция), действующее начало препарата – вакцинный штамм Wistar RA27/3 и отечественный вакцинный штамм вируса краснухи «Орлов-В».
Исследование штамма «Орлов-Д» включало определение: специфической безопасности (определение остаточной нейровирулентности, контагиозности); специфической активности (определение иммуногенной и протективной активности); иммунологической безопасности.
Для контроля остаточной нейровирулентности в опыте были использованы 10 серонегативных к краснухе обезьян, каждая из которых была заражена одним из трех препаратов: штаммом «Орлов-Д» – обезьяны №№ 33639, 33551, 33669, 33211; № 33421; штаммом «Орлов-В» – обезьяны №№ 33364, 33213, 33736, 33830; штаммом Wistar RA27/3 (в составе вакцины Rudivax) – обезьяна № 33776. Заражение, вскрытие, морфологическое и гистологическое исследование органов и тканей обезьян проведено проф. Л.А. Яковлевой.
Исследуемый материал вводили интрацеребрально в область зрительных бугров обоих полушарий головного мозга. По окончании периода клинического наблюдения у животных брали образцы крови для определения антител к вирусу краснухи, после чего животных умерщвляли под глубоким гексеналовым наркозом, производили аутопсию и гистологическое исследование тканей ЦНС, региональных лимфатических узлов, легкого, печени, селезенки
На протяжении периода клинического наблюдения у инфицированных животных ни в одном случае не отмечали пареза конечностей, нарушения типичных движений (прыжки, лазанье, захват предметов), координации; не отмечали также патологических реакций на внешние раздражители, каких-либо других нарушений со стороны ЦНС, нарушения аппетита и сна. При пальпировании мышц конечностей в спокойном состоянии и при сгибании-разгибании ни в одном случае не отмечали нарушения мышечного тонуса. Тремор и гиперкинезы не регистрировали.
Морфологическое исследование. На вскрытии мозговых оболочек, а также ткани головного и спинного мозга с поверхности и на разрезе, как и при осмотре серозных полостей и внутренних органов грудной и брюшной полости, никаких патологических изменений обнаружено не было. Также не было обнаружено заметных следов в области трепанации черепа, за исключением одного случая (макак № 33830), в котором в теменной области правой половины имелось припаивание оболочек мозга к внутреннему апоневрозу черепа.
Гистологическое исследование включало в себя исследование тканей: головного мозга – передняя центральная извилина, задняя центральная извилина, зрительный бугор, продолговатый мозг; спинного мозга – шейное и поясничное утолщение. А также лимфатических узлов: затылочных задне- шейных, подчелюстных. Тканей легкого, печени, селезенки.
В тканях головного и спинного мозга патологических изменений в нейронах и глиальных клетках в исследованных областях выявлено не было. Нервные клетки имели четкие контуры, светлое пузырьковидное ядро с крупной центрально расположенной нуклеолой и отчетливые глыбки нисслевского вещества в цитоплазме. В нервной ткани головного и спинного мозга, а также в их оболочках каких-либо признаков воспаления или гиперемии не обнаружено. У половины животных (№№ 33830, 33551, 33211, 33639, 33736) были обнаружены признаки умеренной активации подчелюстных лимфатических узлов, а также ткани селезенки (№№ 33669, 33830, 33551, 33213, 33736), в основном в В-клеточном звене (увеличение размеров и количества лимфоидных фолликулов; преобладание бластных элементов – центробластов и иммунобластов и увеличение количества митозов). В тканях печени и легкого ни в одном случае никаких патологических изменений не обнаружено.
При исследовании сывороток крови обезьян в РТГА с 4 ГАЕ краснушного антигенного диагностикума было установлено, что у всех обезьян, зараженных вакцинными штаммами вируса краснухи, через 30 суток после инфицирования, определялись вирусспецифические антитела в титрах от 1:160 до 1 : 1280.
Исходя из критериев, изложенных в нормативном документе, а именно: отсутствие у всех подопытных животных клинических проявлений поражения ЦНС; отсутствие вирусспецифических поражений нейронов и глиальных клеток при гистологическом исследовании тканей головного и спинного мозга; выработка вирусспецифических АТ не менее чем у 80% интрацеребрально зараженных животных, и на основании полученных результатов, можно сделать заключение об отсутствии остаточной нейровирулентности штамма вируса краснухи «Орлов-Д». Аналогичные результаты получены в отношении препаратов сравнения. Образование вирусспецифических антител у 100% интрацеребрально зараженных животных, подтверждает факт их инфицирования штаммами вируса краснухи.
Иммуногенную активность штамма «Орлов-Д» оценивали по двум показателям: количеству сероконверсий и напряженности поствакцинального иммунитета в ответ на однократную иммунизацию вакцинным препаратом в дозе, составляющей не менее одной прививочной дозы для человека, то есть не менее 1000 ТЦД50. Параллельно проводили контроль контагиозных свойств исследуемого вируса.
В опыте были использованы 23 серонегативных к краснухе обезьяны, разделенные на три группы, каждая из которых была иммунизирована: препаратом из штамма «Орлов-Д» - 12 обезьян (№№ 34411, 36481, 34455, 34766, 36157, 34654, 35108, 35095, 34815, 34057; 32834, 32937); препаратом из штамма «Орлов-В» - 4 обезьяны (№№ 33385, 33309, 32923, 33238); вакциной Rudivax (Wistar RA27/3) – 3 обезьяны ( №№ 33719, 33730, 34469). Для контроля контагиозности штамма «Орлов-Д» были использованы 3 серонегативные обезьяны, каждая из которых на протяжении 28 суток наблюдения находилась в одной клетке с привитым животным.
В ходе эксперимента установлено, что однократная иммунизация сопровождалась 100% сероконверсией. В то же время, по окончании периода наблюдения (28 суток) в сыворотке крови контактных животных специфические антитела не определялись, что свидетельствует об утрате контагиозных свойств штаммом «Орлов-Д». Напряженность иммунитета во всех трех группах привитых животных характеризовалась высокими показателями: титры антигемагглютининов регистрировали на уровне 1: 160 и выше. При этом СГТ АТ во всех трех группах привитых практически совпадала (таблица 6).
Таблица 6
Показатели напряженности иммунитета у животных, привитых вакцинными штаммами вируса краснухи
| Вводимый материал | Инфекционная активность препарата | СГТ титров АТ в обратных величинах/lg2 |
| «Орлов-Д» | 3,5 lg ТЦД50/0,5 мл | 1: 388 / 8,57 |
| «Орлов-В» | 3,3 ТЦД50/0,5 мл | 1: 362 / 8,49 |
| Wistar RA27/3 | 4,1 ТЦД50/0,5 мл | 1: 388 / 8,57 |
У 5 привитых животных удалось оценить поствакцинальный иммунитет спустя 4 года после иммунизации (период наблюдения). Уровень антигемаггютининов составлял, в основном, 1: 80, (в одном случае 1:40) и существенно превышал защитный титр антител (1 : 20).
Протективную активность определяли в группе из 13 животных, иммунизированных: штаммом «Орлов-Д» – 8 макаков (№№ 34411, 36481, 34455, 34815, 34654, 35108, 35095, 36157); штаммом «Орлов-В» – 2 макака (№№ 33385, 33309); штаммом Wistar RA 27/3 (в составе вакцины Rudivax) – 3 макака (№№ 33719, 33730, 34469). Группу контроля составили 6 серонегативных к краснухе животных, которым патогенный штамм вводили по той же схеме, что и иммунизированным обезьянам. Поскольку низшие приматы переносят краснушную инфекцию в бессимптомной форме, наличие инфекционного процесса определяли по развитию у зараженных животных вирусемии, которую регистрировали в ПЦР в интервале от 4 до 24 суток после инфицирования. Результаты представлены в таблице 7 и свидетельствуют о том, что иммунизация как штаммом «Орлов-Д», так и препаратами сравнения защитила животных от проникновения вируса в кровяное русло; в то время как в контрольной группе обезьян в ответ на заражение патогенным штаммом “Лебедев” в 100% случаев в период с 4-7 по 17-20 сутки регистрировалась вирусемия, что свидетельствует о развитии краснушной инфекции.
Таблица 7
Выявление РНК вируса краснухи (в ПЦР) в сыворотке крови обезьян после заражения патогенным штаммом вируса
| Коли- чество обезьян (номер) | Вакцин-ный штамм | Наличие РНК* вируса в сыворотке крови через …суток после заражения патогенным штаммом вируса краснухи | ||||||
| 4 | 7 | 11 | 14 | 17 | 20 | 24 | ||
| 2 | Орлов-В | - | - | - | - | - | - | - |
| 8 | Орлов-Д | - | - | - | - | - | - | - |
| 3 | RA27/3 | - | - | - | - | - | - | - |
| 1/34089 | н/и** | ± | ± | + | + | + | + | - |
| 1/33559 | н/и | - | + | + | + | ± | - | - |
| 1/32763 | н/и | - | + | + | + | ± | ± | - |
| 1/32985 | н/и | ± | + | + | + | ± | ± | - |
| 1/35595 | н/и | - | + | + | + | + | + | - |
| 1/35194 | н/и | ± | ± | + | + | + | - | - |
* « + » более 1000 копий /мл; « ± » 100 – 1000 копий /мл; « - » менее 100 копий /мл
** - не иммунизировали
В целом, полученные результаты характеризуют штамм «Орлов-Д» как аттенуированный вирус с высокой специфической активностью, не менее выраженной, чем у препаратов сравнения – вакцинных штаммов Wistar RА27/3 и «Орлов-В».
Определение иммунологической безопасности штамма проводили, контролируя изменения в системе иммунокомпетентных клеток иммунизированных животных. Согласно нормативному документу, неспецифическое влияние вакцинного препарата на иммунную систему должно удовлетворять следующим требованиям:
- продолжительность изменений иммунологических показателей не должна превышать 45 дней с момента введения вакцины;
- изменение величины показателя численности и функциональной активности иммунокомпетентных клеток не должны отличаться более чем в 1,5 раза от исходных показателей и аналогичного показателя в группе, получавшей плацебо и обследованной в те же сроки (СП 3.3.2.561 – 96, п. 12.2.4.).
Влияние иммунизации на факторы клеточного иммунитета и уровень ИНФ изучали в группе из 9 животных: 5 - привитых штаммом «Орлов-Д» (№№ 34455, 35108, 35095, 34411, 36157); 2 – штаммом Wistar RA 27/3 (№№ 34469, 34467); 2 – контрольные обезьяны: №№ 36481, 34766 (группа плацебо).
Количественные характеристики CD-антигенов (АГ) подсчитывали до иммунизации, через 7, 14, 28 и 45 суток после введения препаратов. Значительные колебания исходных величин каждой субпопуляции лимфоцитов у опытных и контрольных животных не позволили провести статистическую обработку результатов. Тем не менее, спустя 7 – 28 суток после иммунизации у всех привитых животных определилась тенденция к активации натуральных киллеров (CD-16); маркеров В-клеточного звена иммунитета (CD-19, CD-22), ответственных за выработку специфических антител; маркеров молекул ГКГ (HLA-DR). Так, в отдельных случаях количество натуральных киллеров (CD-16) повышалось в 3 – 4 раза (№№ 34467, 34469), количество CD-19 АГ превышало исходные показатели в 8 раз (№ 35095), CD-22 – в 10 раз (№ 34411), HLA-DR – в 4-6 раз (№№ 34455, 34411, 34467, 34469). Что касается маркеров молекул Т-клеточного звена иммунитета, то первичная встреча с вирусным антигеном не оказала существенного влияния на уровень Т-лимфоцитов, но привела, по-видимому, к премированию Т-клеток, о чем можно судить по активации маркеров молекул ГКГ (HLA-DR), принимающих участие в этом процессе. Через 45 суток после иммунизации количественные показатели активности иммунокомпетентных клеток возвращались к исходным величинам и не отличались от них более чем в 1,5 раза. ИФН-статус определяли регистрацией уровня α-ИФН, γ- ИФН. Уровень цитокинов контролировали до иммунизации, через 14 и 28 суток после нее. Через 14 суток после вакцинации у всех иммунизированных животных, включая обезьян, получивших препарат сравнения, отмечали не продолжительное 4-8- кратное снижении уровня α- и γ-ИФН. Исходный их уровень восстанавливался к 28 суткам после введения препарата.
Иммунологические сдвиги в системе врожденного иммунитета в контрольной группе не иммунизированных обезьян не наблюдались.
В целом, результаты свидетельствуют о иммунологической безопасности штамма «Орлов-Д».
Таким образом, доклиническое изучение полученного в ходе работы аттенуированного вируса краснухи показало (в пределах использованных методов), что по отсутствию остаточной нейровирулентности для приматов; высокой специфической активности, отсутствию контагиозности; иммунологической безопасности, не уступающим по вышеозначенным критериям препаратам сравнения, штамм «Орлов-Д» пригоден для получения на его основе вакцины против краснухи.