Аттенуированной вакцины против краснухи
| Вид материала | Автореферат |
| Для определения параметров репродукции штамма «Орлов-Д» Третье положение |
- Вакцинация против гриппа Почему вакцины против гриппа каждый год разные?, 389.79kb.
- Вакцинация. Прививки, 68.12kb.
- Лекция №3. Тема: профилактика туберкулеза, 67.13kb.
- Активизирующий опросник "За и против", 392.33kb.
- Название вакцины, 17.17kb.
- Встатье данной статье представлен подробный отчет об этапах разработки, испытаний, 472.34kb.
- Текст с ошибками "Александр Невский". Задание: Найдите в данном тексте ошибки и укажите, 20.96kb.
- Разработка и внедрение технологии промышленного производства и системы управления качеством, 660.17kb.
- Д-р Марк Сиркус Ртуть, вакцины и медицина, 266.55kb.
- Создание унифицированной системы управления эпидемическим процессом кори, краснухи, 666.42kb.
Для определения параметров репродукции штамма «Орлов-Д» в указанном тканевом субстрате проводили сравнительное изучение динамики репродукции вируса краснухи в диплоидной культуре клеток «М-22» и первичной культуре клеток ППК при использовании оптимальной МИ, равной 0,01 ТЦД50/клетка. Средние показатели репродукции вируса краснухи в указанных культурах клеток, представлены на рисунке 2.
Инфицирование вирусом краснухи клеток ППК характеризовалась выраженным цитодеструктивным действием вируса на клетки, что завершалось круглоклеточной дегенерацией клеточного пласта через 15 -18 суток после заражения и снижением количества инфекционных вирусных частиц до концентрации 3,0 lg ТЦД50/0,5 мл. Репродукция штамма «Орлов-Д» в культуре клеток «М-22» не сопровождалась лизисом клеток и характеризовалась более интенсивной динамикой накопления инфекционных вирусных частиц. В период с 5-ых по 18-ые сутки после инфицирования клеток «М-22» каждые 2 – 3 суток удавалось получить полезные вирусные сборы с инфекционной активностью не менее 3,5 lg ТЦД50/0,5 мл. В целом, ОВС, полученный при соединении в одну производственную емкость полезных вирусных сборов, при заражении культуры клеток «М-22» в два раза превышал соответствующий объем, полученный при использовании первичной культуры ППК при равном количестве зараженных клеток ППК и «М-22». Характер репродукции вируса в клетках-продуцентах оказывал влияние на содержание белка в ВСЖ, полученной с первичных и диплоидных клеток: в ОВС, полученных при инфицировании первичной клеточной культуре ППК, его количество достигало 500 - 780 мкг/мл; при инфицировании диплоидных клеток «М-22» – от 100 до 230 мкг/мл.
В условиях промышленного производство вакцины сохранение биологической активности вакцинного и производственного штамма на протяжении длительного периода времени имеет важное значение. Для определения устойчивости вариантов вакцинного штамма «Орлов» к условиям длительного хранения проводили контроль инфекционной активности лиофилизированных препаратов из штаммов «Орлов-В» и «Орлов-Д». Препараты хранили при температуре минус 20 о С в течение десяти (штамм «Орлов-Д») - тринадцати (штамм «Орлов-В») лет. Инфекционную активность обоих вариантов штамма «Орлов» определяли ежегодно титрованием 2 –3 ампул лиофилизированных препаратов в перевиваемой культуре клеток RK-13.
За время наблюдения не отмечали существенных (более чем на 0,5 lg ТЦД50/0,5мл) колебаний инфекционной активности вирусов.
Таким образом, чувствительность клеток «М-22» к полученному варианту штамма «Орлов» аналогична чувствительности клеток ППК, к которой был адаптирован исходный вирус; указанная диплоидная линия клеток способна поддерживать стабильный уровень инфекционной активности штамма «Орлов-Д» на протяжении не менее пятнадцати пассажей линии в фазе активного роста; клетки устойчивы к криоконсервации. Характер репродукции штамма «Орлов-Д» в клетках «М-22» позволяет получить удвоенное количество полезных вирусных сборов с содержанием остаточного белка в конечном продукте в 4-5 раз меньшим, чем при использовании первичной культуры клеток. Полученный на диплоидной линии клеток «М-22» штамм «Орлов-Д» характеризуется стабильными показателями инфекционной активности на протяжении 10 лет хранении при температуре – 20 о С (срок наблюдения). Клетки «М-22» поддерживают также репродукцию вирусов кори и эпидемического паротита. Наличие банка посевных клеток «М-22» и перечисленные выше факторы создают условия для многолетнего производства препарата.
В целом, полученные результаты характеризуют диплоидную линию клеток «М-22» как пригодную (по изученным параметрам) для использования в качестве тканевого субстрата в производстве моно- и ассоцированных вакцин для профилактики краснухи.
ТРЕТЬЕ ПОЛОЖЕНИЕ
Аттенуация штамма «Орлов» вируса краснухи в первичной культуре клеток ППК сопровождается значимой мутацией в структуре гена Е1. В процессе многократного пассирования штамма «Орлов-Д» в диплоидной культуре клеток «М-22» сохраняется его генетическая стабильность.
Учитывая, что процесс производства живой вакцины предусматривает многократное культивирование вакцинного вируса в тканевом субстрате (вакцинный штамм→ производственный штамм→ посевной вирус→ серия вакцины), контроль генетической стабильности аттенуированного вируса в процессе культивирования в системе клеток-продуцентов - необходимый этап оценки его пригодности для использования в качестве вакцинного штамма.
Известно, что даже единичные пассажи вируса в иной системе хозяйских клеток могут привести к гиператтенуации или реверсии патогенных свойств вакцинного штамма [Бойчук и др. 1968, Жилова и др. 1969].
Для понимания значимости тех или иных изменений вирусного генома при адаптации вируса к иной системе клеток хозяина, необходимо иметь сведения о том, какие именно нуклеотидные и аминокислотные замены приводят к изменению уровня вирулентности вируса для человека. Наиболее адекватной моделью для такого рода исследований являются так называемые «промежуточные варианты» вакцинных штаммов с документированным уровнем реактогенности для людей, полученные в ходе аттенуации исходных вирусов.
При получении вакцинного штамма вируса краснухи «Орлов» клиническим испытаниям на волонтерах были подвергнуты шестнадцатый («Орлов»-16) и тридцать шестой пассаж вируса («Орлов»-36) в культуре клеток ППК. Первый из испытанных вариантов («Орлов»-16) вызывал 30% клинических реакций средней тяжести. Снижение реактогенных свойств штамма до допустимого нормативным документом уровня (2% клинических реакций средней тяжести) было достигнуто проведением дополнительных 20 пассажей вируса в той же системе клеток [Мешалова и др., 1979]. Для определения генетических маркеров аттенуации штамма «Орлов» были использованы промежуточные варианты, полученные после проведения 14, 17, 23 пассажей выделенного от больного «дикого» вируса в первичной культуре клеток ППК и вакцинный штамм «Орлов-В» (39 пассажей вируса в ППК). Из таблицы 5 видно, что в процессе аттенуации вируса, между 15 и 17, а также 18 и 23 пассажем произошли незначимые замены нуклеотидного состава гена, кодирующего неструктурный белок NS1: С → G. А также, между 18 и 23 пассажем, – значимые замены в структуре гена Е1. Последнее событие привело к замене в структуре поверхностного белка Е1 (пятьдесят седьмой аминокислотный остаток) V → I (валин на изолейцин).
Таблица 5
Нуклеотидные и аминокислотные замены в структуры вириона вариантов вакцинного штамма вируса краснухи «Орлов»
| № нуклеотида /ген | **AA замены | № пассажа штамма «Орлов» в культуре клеток ППК /нуклеотидные замены | |||
| 14 | 17 | 23 | 39 | ||
| 728MatPet1 | - | С | С | Т | Т |
| 3854MatPet1 | - | С | Т | Т | Т |
| 8419 Е1 | V-I | С | С | Т | Т |
| 9186 Е1 | - | С | С | Т | Т |
| 9342 Е1 | - | С | С | G | G |