Аттенуированной вакцины против краснухи
| Вид материала | Автореферат |
- Вакцинация против гриппа Почему вакцины против гриппа каждый год разные?, 389.79kb.
- Вакцинация. Прививки, 68.12kb.
- Лекция №3. Тема: профилактика туберкулеза, 67.13kb.
- Активизирующий опросник "За и против", 392.33kb.
- Название вакцины, 17.17kb.
- Встатье данной статье представлен подробный отчет об этапах разработки, испытаний, 472.34kb.
- Текст с ошибками "Александр Невский". Задание: Найдите в данном тексте ошибки и укажите, 20.96kb.
- Разработка и внедрение технологии промышленного производства и системы управления качеством, 660.17kb.
- Д-р Марк Сиркус Ртуть, вакцины и медицина, 266.55kb.
- Создание унифицированной системы управления эпидемическим процессом кори, краснухи, 666.42kb.
Положения, выносимые на защиту:
1. Вакцинный штамм вируса краснухи «Орлов-В» идентифицирован как вирус генотипа 2с, эндемичный для территории РФ, и генетически более близок к циркулирующим на территории России изолятам вируса краснухи, чем вакцинный штамм Wistar RА27/3. Вакцинопрофилактика краснухи вызывает филогенетические изменения возбудителя.
2. Выбор диплоидной линии клеток фибробластов кожно-мышечного лоскута эмбриона человека «М-22» для получения штамма «Орлов-Д» обусловлен чувствительностью указанной культуры клеток к вакцинному штамму вируса краснухи, аналогичной чувствительности клеточной культуры ППК, использованной для аттенуации штамма «Орлов», а также наличием банка посевных клеток «М-22», рекомендованных ГИСК им. Л.А. Тарасевича для производства вакцинных препаратов. Данная культура клеток является технологичным субстратом и пригодна для промышленного выпуска краснушной вакцины.
3. Аттенуация штамма «Орлов» вируса краснухи в первичной культуре клеток ППК сопровождается значимой мутацией в структуре гена Е1. В процессе многократного пассирования штамма «Орлов-Д» в диплоидной культуре клеток «М-22» сохраняется его генетическая стабильность.
- Доклиническое изучение штамма «Орлов-Д» на обезьянах макака –
резус специфической безопасности, специфической активности и иммунологической безопасности свидетельствует о его пригодности для получения вакцины против краснухи.
Внедрение результатов исследования в практику:
1. Вакцинный штамм вируса краснухи «Орлов-В». Депонирован в ГКМВ (№
2326 от 04.04.1995 г.); свидетельство об аттестации штамма в ГИСК им.
Л.А. Тарасевича № 01-33/8 от 29.03.95 г.
2. Штамм вируса краснухи «Орлов-Д». Депонирован в ГКМВ (№ 2347 от
29.12.1998 г.).
3. Штамм вируса краснухи «Лебедев». Депонирован в ГКМВ (№ 2365 от
17.12.2004 г.).
4. Изоляты вируса краснухи, выделенные на территории Пермского края.
Депонированы в коллекцию Международного генетического банка
Национального центра биотехнологической информации (Национальный
институт здоровья, США) (№№ EF210064 - EF210075 от 21.04.07 г.).
5. Патент на изобретение РФ № 2081912 «Вакцинный штамм вируса краснухи
Орлов-В». Приоритет от 22.05.1995 г.
6. Патент на изобретение РФ № 2173344 «Вакцинный штамм вируса краснухи
«Орлов-Д» и способ получения вакцины против краснухи». Приоритет от 28.06.1999 г.
- Инструкция по изготовлению и контролю живой культуральной краснушной вакцины. Рассмотрена и одобрена Ученым Советом ФГУ «Санкт-Петербургский НИИЭМ имени Пастера Министерства здравоохранения Российской Федерации» (протокол № 10 от 14.11.2001г.) и утверждена директором Института 14.11.2001 г.
Апробация работы и публикации:
Основные результаты исследовательской работы доложены и обсуждены на 18 научных форумах и конференциях: на юбилейной конференции НИИЭМ им. Пастера «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (г. Санкт-Петербург, 1995 г.) ; на Международной конференции «XXXI Dani preventive medicine» (Nis, 1997 г.), на Международной конференции «Modern Vaccinology»» (г. Уфа, 1996 г.); на II Международной научной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (г.Санкт-Петербург, 1998 г.); на Международной конференции «XXXII Dani preventive medicine» (Nis, 1998 г.), на научной конференции с международным участием, посвященной 80-летию со дня рождения академика В.Д. Белякова «Достижения отечественной эпидемиологии в XX веке. Взгляд в будущее» (г. Санкт-Петербург, 2001 г.); на Международной научной конференции «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней – прогресс и проблемы» (г. Санкт-Петербург, 2003 г.); на научно-практической конференции «Вакцинопрофилактика в XXI веке (Пермь, 2000 г.); на Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы вакцинно-сывороточного дела в XXI веке» (г. Пермь, 2003 г.); на Всероссийской научной конференции с международным участием «Перспективные направления использования лабораторных приматов в медико-биологических исследованиях» (г. Адлер, 2006 г.); на Международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в опытах на обезьянах» (г. Адлер, 2007 г.); на IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации» (г. Москва, 2007 г.); на Международном конгрессе «48th Annual Meeting of the Eurohean Society for Pediatric Research» (г. Прага, 2007 г.), на Международном Российско-Норвежском семинаре «Совершенствование системы эпидемиологического надзора, диагностики и профилактики врожденной краснухи» (г. Санкт-Петербург, 2007 г.); на 3 заседаниях Санкт-Петербургского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (г. Санкт- Петербург, 2003, 2005, 2007 г.г.); на заседании Ученого Совета ГУ ИПВЭ им. М. П. Чумакова РАМН (Московская область, 2007 г.).
Диссертационная работа была апробирована на заседании проблемной комиссии по вирусологии (25.09.08 г.) и заседании Ученого Совета (02.10.08 г.) ФГУН «НИИЭМ имени Пастера» Роспотребнадзора.
Научные положения, изложенные в диссертации, опубликованы в 31 печатной работе в период с 1995 по 2008 г.г., включая монографию «Краснуха» (Пермь – Санкт-Петербург – Москва, 2002), аналитический обзор «Инфекционная заболеваемость в Северо- Западном федеральном округе России. Закономерности и особенности эпидемического процесса в современный период» (СПб., 2007) и 8 работ в журналах, которые рекомендованы ВАК для публикации основных научных результатов диссертаций на соискание ученой степени доктора наук. По материалам исследования получено два патента РФ на изобретение.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 328 страницах машинописного текста, состоит из введения, главы обзора литературы, главы материалов и методов, трех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка использованной литературы и приложений. Список литературы включает 297 работ, из них 113 отечественных и 184 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 4 рисунками и 20 таблицами.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Исследование выполнено в ФГУН «НИИЭМ имени Пастера» Роспотребнадзора с 1995 по 2007 гг. в комплексе с ООО диагностический центр научно-производственная фирма (НПФ) «Хеликс» (г. Санкт-Петербург), ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Пермском крае» (г. Пермь); ГУ НИМП РАМН (г. Адлер-Сочи).
В работе использованы следующие группы вирусов:
1. Варианты вакцинного штамма вируса краснухи «Орлов», полученные в ходе его аттенуации в культуре клеток ППК. Использованы 14, 17, 23 пассажи вируса в указанной культуре клеток. Штаммы получены из коллекции музейных вирусов лаборатории детских вирусных инфекций ФГУН «НИИЭМ имени Пастера» Роспотребнадзора.
2. Вакцинные штаммы вируса краснухи:
- Wistar RA27/3 (в составе вакцины Rudivax);
- «Орлов» (36 пассажей в культуре клеток ППК; получен из ГКМВ, г. Москва);
- «Орлов-В» - получен нами проведением трех дополнительных пассажей штамма «Орлов» в культуре клеток ППК. Всего штамм «Орлов-В» прошел 39 пассажей в указанной культуре клеток.
3. Штамм вируса краснухи «Лебедев», выделенный нами в 2001 г. от ребенка с СВК на перевиваемой культуре клеток BHK-21; в работе использован 3 – 4 пассаж вируса в указанной культуре клеток.
4. В ходе работы получен аттенуированный штамм вируса краснухи «Орлов-Д».
5. Вакцинные штаммы вируса кори Л-16 и вируса эпидемического паротита Л-3.
6. Вирусы ВВС, ВБН, ВЭМ.
Образцы крови, полученные на территории Пермского края в период 1999 – 2005 гг., от 13 пациентов с лабораторно подтвержденным диагнозом «краснуха».
Первичные (ППК), диплоидные (ДКЛЧ, ДКПЧ, «М-22»), перевиваемые (RК-13, ВНК-21, Vero, L-41, СПЭВ) культуры клеток.
Лабораторные животные: 130 беспородных взрослых и новорожденных мышей, 44 морские свинки, 75 взрослых и 1-3 дневных кроликов породы «Шиншилла», 35 обезьян макака-резус.
Для проведения исследования применялись вирусологические, молекулярно-биологические, иммунологические, морфологические, гистологические методы исследования.
Определение биологической (инфекционной) активности вирусов проводили титрованием на культуре клеток, используя десятикратные разведения образцов ВСЖ. Учет результатов производили по прямому ЦПД вируса на клетки или в реакции интерференции с рабочей дозой ВВС. Конечную концентрацию вирусов определяли по методу Рида и Менча.
Молекулярно-генетические исследования проводили на базе диагностического центра ООО НПФ «Хеликс». Для выделения РНК из сыворотки крови больных или из лиофилизированного штамма вируса краснухи использовали набор реагентов «Рибо-сорб», производства ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора (г. Москва) в соответствии с инструкцией по применению.
Для проведения реакции обратной транскрипции (ОТ-ПЦР) использовали набор реагентов «Revert AidTM First Stand cDNA Sintesis Kit» (Fermentas); реакцию проводили по стандартной схеме. Полученную кДНК использовали для проведения ПЦР. Для проведения ПЦР были подобраны 3 группы праймеров: 1. Для сравнительного генотипирования штаммов «Орлов-В», «Орлов-Д» и Wistar RA27/3 была использована пара праймеров, полностью фланкирующих ген Е1 и дающих амплификат размером 1443 п. о. (с 8292 по 9653 н): Forward: 5’- CAC TCA AGC ACC TGT CCC C– 3’; Reverse: 5’ – GCA CAG CAA GCG AGT AAG C- 3’. 2. Для генотипирования штаммов и изолятов вируса краснухи был использован участок гена Е1 размером 739 п.о. (с 8731 по 9469 н.), полученный в результате амплификации с другой пары праймеров: Forward: 5’- TCT GGG CTG TCA ACG CCT ACT CCT – 3’; Reverse: 5’ – ATC CAC TCG GGT ATT TCG – 3’. 3. Для сравнительного генотипирования пассажных вариантов штамма «Орлов» - 14 пар праймеров, амплификаты которых суммарно перекрывают весь геном Rubella (9755 п.о.) (таблица 1).
Таблица 1
Последовательности праймеров, использованных для секвенирования генома вируса краснухи
-
№
Последовательность
Ta *
(°С)
Размер продукта (нк)
1
2
3
4
1
CGGACCTCGCTTAGGACTC
58
778
2
CCGGCAGGACTTGGTAGAT
3
CACGCATCTACCAAGTCCTGC
61
678
4
GCACGGTGTCCAAGTGGC
5
ACCTGGATCGTCCACGCAG
65
641
6
GGCAGGTCACGCACCGAGA
7
CTCGGTGCGTGACCTGCC
63
769
8
CGCAGCAGACCAGCCGTAG
9
GCTGGTCTGCTGCGGAGTC
62
701
10
GCACCCGGCACTCGTGTAG
11
TACACGAGTGCCGGGTGC
63
719
12
GCGAGCGGTTTCGTCAGC
13
ATCAAGAACGCCGCCACC
64
716
14
TCTTGGGCCTCGGGGATG
15
CCGCACTCTGGAGGAGCT
58
704
16
TGGCGTTGGTGGTGTAATG
17
GGTGGCAGGCCCATTACA
60
762
18
TTAGTCGGCGTCGTGGAGA
19
CACGACGCCGACTAACGC
61
669
20
GCCCAGGTTGGTGAAATGC
21
TCACCAACCTGGGCACCC
66
723
22
CGGCGGTCGTGGAGTTCG
23
GCCGGCCTCAATGACAGC
62
649
24
CGCACGAGACATCAGTGGG
25
AGATCCCCACTGATGTCTCG
59
766
26
ATCCACTCGGGCATTTCG
27
AGTGCGGACTCCACATACG
57
718
28
GGGCAAGAACCTCATCTAGG
* Та – температура отжига
Последовательности праймеров группы 1, 2 и 3 были использовали для секвенирования соответствующих амплификатов.
ПЦР проводили по стандартной методике, адаптированной к соответствующей паре праймеров. Программа проведения ПЦР: 95° С – 3 мин + {94 ° С – 30 сек; 60 ° С – 30 сек; 72 ° С – 45 сек } х 35 циклов + 72 ° С – 5 мин. Амплификацию проводили на приборе «Терцик» (ДНК-Технология). Секвенирование в 4,25% полиакриламидном геле - на автоматическом секвенаторе ABI Prism 377 («Applied Biosystems», США) с использованием реагентов «BigDyeTM Terminator Kit v.2.0» (Appliied Biosystems) Полученные хромотограммы анализировали с помощью программы Chromas 2.3 «Technelysium Pty Ltd» (Австралия). Для построения филогенетического древа вируса краснухи использовали компьютерную программу MrBayes 3.1., в соответствии с рекомендациями ВОЗ (2005). Для определения степени эволюционной близости штаммов и изолятов вируса краснухи использовали показатель генетической дивергенции, который складывался из доли нуклеотидных замен между образцами (%) и индекс генетической близости, который рассчитывали, используя эволюционную модель случайных нуклеотидных замен [Kimura, 1980]. Межгрупповые генетические различия определяли, используя внутригрупповые консенсусные последовательности. Для анализа мутационных изменений генома штамма «Орлов» в процессе аттенуации в качестве референс-препарата использована референс- последовательность NC_001545 [Dominguez et al., 1990]. Для оценки генетических различий между вакцинными штаммами вируса краснухи Wistar RA27/3 и «Орлов-Д» использовали компьютерную программу «Vector NTI 10.0» (Invirtogen USA).
Доклиническое изучение штамма «Орлов-Д» проводили на базе ГУН НИИМП РАМН (г. Адлер-Сочи).
Контроль специфической безопасности штаммов вируса краснухи проводили определением остаточной нейровирулентности при интрацеребральном заражении серонегативных к краснухе обезьян макака-резус. Перед началом эксперимента животных погружали в глубокий наркоз, который достигался внутримышечным введением 10% раствора гексенала из расчета 1,0 мл на 1,0 кг массы животного. Вируссодержащий материал вводили в зрительный бугор каждого полушария головного мозга в дозе, 10000 ТЦД50/0,5 мл. Клиническое наблюдение за обезьянами проводили 30 суток, в течение которых отмечали наличие или отсутствие клинических симптомов поражения центральной нервной системы. По истечении периода клинического наблюдения у животных брали пробы крови для определения в сыворотке вирусспецифических АТ, после чего умерщвляли под глубоким гексеналовым наркозом, проводили аутопсию, морфологическое и гистологическое исследование тканей ЦНС и других внутренних органов обезьян.
Специфическую активность штаммов вируса краснухи определяли по критериям:
1. Иммуногенная активность – формирование вирусспецифических АТ через 28 суток после однократного внутримышечного введения серонегативным к краснухе обезьянам препаратов из исследуемых штаммов. Прививочная доза соответствовала 1 прививочной дозе для человека – не менее 1000 ТЦД50/0,5 мл. Определение титров АТ проводили в РТГА, используя «Диагностикум краснушный антигенный сухой для РТГА» производства ФГУН «НИИЭМ имени Пастера» Роспотребнадзора в соответствии с инструкцией по применению препарата.
2. Протективная активность - устойчивость иммунизированных животных к трехкратному интраназальному заражению патогенным штаммом вируса краснухи «Лебедев» в дозе 10000 ТЦД50/0,5 мл. Группу контроля при этом составляли не иммунизированные, серонегативные к краснухе обезьяны, зараженные по той же схеме. Развитие вирусемии регистрировали в ПЦР, исследуя сыворотки крови животных на разных сроках после заражения. Для выделения вирусной РНК использовали набор реагентов «АмплиСенс Rubella-302» производства ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора.
Контагиозность штаммов вируса краснухи оценивали после 28 суток тесного контакта (нахождение в одной клетке) иммунизированных и не иммунных макаков, определяя у последних наличие вирусспецифических АТ.
Интерфероновый статус и параметры клеточного иммунитета обезьян определяли, исследуя гепаринизированную кровь, взятую из локтевой вены животных; α- и γ- ИФН получали in vitro, используя различные индукторы (ВБН, Con-A). Титрование полученных цитокинов проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах, маркированных «для работы с культурой клеток» с 24-часовой культурой монослоя клеток-мишеней СПЭВ против 100 цитопатических доз индикаторного вируса (ВЭМ). Параметры клеточного иммунитета определяли в тесте розеткообразования эритроцитов барана, меченых моноклональными антителами против различных субпопуляций лимфоцитов, а также против маркеров молекул HLA-DR. Использовали диагностический набор «Диагностикумы стабильные на основе моноклональных антител» Витебского государственного медицинского института в соответствии с инструкцией. Все манипуляции с обезьянами проводили после в/м введения раствора калипсола из расчета 0,1 мл на 1 кг массы тела животного.
Статистическая обработка материала проведена методами параметрической и непараметрической статистики [3айцев, 2003] с использованием t-критерия Стьюдента для определения значимости различий между явлениями. Разность результатов считали статистически достоверной при р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
На основании проведенных исследований сформулированы и представлены к защите четыре основные положения:
ПЕРВОЕ ПОЛОЖЕНИЕ
Вакцинный штамм вируса краснухи «Орлов-В» идентифицирован как вирус генотипа 2с, эндемичный для территории РФ, и генетически более близок к циркулирующим на территории России изолятам вируса краснухи, чем вакцинный штамм Wistar RА27/3. Вакцинопрофилактика краснухи вызывает филогенетические изменения возбудителя.
На первом этапе работы представлялось важным определить генетическую принадлежность современных изолятов вируса краснухи, выделенных на территории России; их генетическую близость к вакцинным штаммам Wistar RA27/3 и «Орлов-В», полученным в 70-ые годы XX века.
Для этого, на основе нуклеотидной последовательности фрагмента гена Е1 размером в 739 п.о. (с 8731 по 9653 н.), в соответствии с рекомендациями ВОЗ по генотипированию «диких» штаммов вируса краснухи [WHO, Wkly epiod. Report, 2005] был проведен филогенетический анализ 13 изолятов вируса краснухи, идентифицированных на территории Пермского края в период с 1999 по 2005 гг. SLM17Perm-1999, SLM11Perm-2000, SLM13Perm-2000, SLM14Perm-2000, SLM16Perm-2000, SLM12Perm-2003, SLM3Perm-2003, SLM7Perm-2002, SLM8Perm-2002, SLM5Perm-2004, SLM9Perm-2004, SLM6Perm-2005, SLM15Perm-2005, а также упомянутых выше вакцинных штаммов вируса краснухи. В анализе использовали также имеющиеся в коллекции GenBank последовательности 4 штаммов вируса краснухи, циркулировавших в России в 1967- 1997 гг.. По результатам исследования все изоляты вируса краснухи, выделенные на территории Пермского края, а также вакцинный штамм «Орлов-В» и 4 российские штамма, выделенные в период 1967 – 1997 гг., отнесены к генотипу 2с (рис. 1).
Штамм Wistar RA27/3 отнесен к генетической линии 1. В ходе генетического анализа этого штамма было получено совпадение его положения в филогенетическом древе с установленным номером в GenBank, что подтверждает достоверность полученных результатов. Индекс генетической близости между современными изолятами вируса краснухи и вакцинными штаммами «Орлов-В» и Wistar RA27/3 составил 0,74 и 0,99 соответственно. Эти показатели свидетельствуют о более тесном генетическом родстве современных изолятов вируса, выделенных на территории Западного Урала, российских изолятов более раннего периода выделения с вакцинным штаммов «Орлов-В», чем со штаммом Wistar RA 27/3.
Полученные результаты коррелируют с данными ВОЗ, которая определяет РФ как территорию с эндемичной циркуляцией вирусов краснухи генотипа 2с [WHO, Wkly Epidemiol. Rec., 2005]. Своего рода уникальность вирусов краснухи генотипа 2с, связанная с их эндемичным распространением в России, может являться обоснованием, наряду с экономическим преимуществом, целесообразности использования в РФ вакцинного штамма, выделенного на данной территории.
Группой ученых [Frey et al., 1998, Zheng et al. 2003] было высказано предположение о том, что возрастающая изменчивость штаммов вируса краснухи является следствием введения в практику широкомасштабной вакцинации в разных странах мира. Очевидно, что надзор за краснушной инфекцией должен предусматривать наблюдение за эволюцией вируса в период вакцинопрофилактики. C этой целью были исследованы изоляты вируса краснухи, выделенные на территории Пермского края, где, вакцинопрофилактика краснухи проводится с 1995 г. За десятилетний период в крае были использованы две стратегии: селективной вакцинации девушек и женщин репродуктивного возраста; массовой вакцинации детей 1-2 года жизни.
В ходе исследования была выявлена низкая популяционная изменчивость современных изолятов по отношению к референс-штаммам вируса краснухи, которая варьировала в интервале 0 – 1 %. Также несущественными оказались генетические различия между изолятами вируса краснухи, полученными в период селективной иммунизации на фоне эпидемического подъема заболеваемости (1999 – 2000 гг. и 2003 г.) и в межэпидемический период 2003 г. - показатель генетической дивергенции не превышал 0,6 – 2% (р > 0,05).
Рис. 1. Генетическая характеристика изолятов вируса краснухи, циркулирующих на территории Пермского края в 1999–2005 гг.
Изоляты: 5-SLM5Perm-2004, 6-SLM6Perm-2005, 7-SLM7Perm-2002, 8-SLM8Perm-2002, 9-SLM9Perm-2004, 11-SLM11Perm-2000, 12-SLM12Perm-2003, 13-SLM1ЗPerm-2000, 14-SLM14Perm-2000, 15-SLM15Perm-2005, 16-LM16Perm-2000, 17-SLM17Perm-1999. Референсные штаммы генного банка - AY 247015, AY 247016, AY 247017, AY 247019 (Россия, 1967-1997 гг.). Вакцинные штаммы вируса краснухи: «Орлов-В»; Wistar RA27/3 в составе вакцины Rudivax.
Напротив, массовая туровая иммунизация детей 1 – 2 года жизни в течение 4-х лет применения, при пороге привитости, равном 460,0 на 1000 детского населения (расcчитан на все население г. Перми в возрасте от 1 до 17 лет) привела к достоверному увеличению показателя генетической дивергенции с 1,15 % в 2000 – 2002 гг. до 3,14 % в 2004 – 2005 гг. (r = 0,76; t = 4,58 p<0,01 значимость F = 0,08, вероятность 92,0% р<0,05). Полученные результаты свидетельствуют о воздействии вакцинопрофилактики краснухи на свойства взаимодействующих популяций макро- и микроорганизмов, и ее влиянии на биологический фактор эпидемического процесса; и, тем самым, корреспондируются с предположением Т. Frey и др. о влиянии специфической профилактики на генетическую дивергенцию вируса краснухи. Выявленные нуклеотидные замены в гене Е1 под влиянием вакцинации не были значимыми, ни в одном случае не вызвали изменения аминокислотного состава белка Е1, но дальнейшие исследования по воздействию вакцин, используемых при прививках, на молекулярно-генетические и фенотипические свойства вируса краснухи представляют несомненный научный и практический интерес.
В соответствии с задачами исследования, следующий этап работы был связан с получением варианта вакцинного штамма «Орлов» - штамма «Орлов-Д».
Для получения штамма «Орлов-Д» первоначально была проведена работа по определению способности различных видов диплоидных линий клеток эмбриона человека поддерживать репродукцию вируса краснухи. В экспериментах были использованы: 4 линии клеток ДКЛЧ – 175/312, 275/6, 776/14, 780/25; 3 линии клеток ДКПЧ – 882/25, 1182/12, 1182/8. В числе других, была использована линия диплоидных клеток фибробластов кожно-мышечного лоскута эмбриона человека, «М-22», любезно предоставленная автором линии, профессором Л.Л. Мироновой (получена на уровне 19 пассажа). Максимальный уровень инфекционной активности вируса (4,9 -5,3 lg ТЦД50/мл), в 10 раз превышавший показатель его репродукции в клетках ППК, регистрировали при использовании фибробластов легкого эмбриона человека (линии клеток ДКЛЧ); минимальный: 3,1-3,2 lg ТЦД50/мл – в клетках фибробластов почки эмбриона человека (линии клеток ДКПЧ). Линия клеток «М-22» занимала промежуточное положение по чувствительности к вирусу краснухи. Тем не менее, средние показатели инфекционной активности вируса в клетках ППК и «М-22» практически совпадали и составили 3,9 lg ТЦД50/мл и 4,2 lg ТЦД50/мл, соответственно.
Неоспоримым преимуществом линии клеток «М-22» перед другими исследованными линиями является наличие банка посевных клеток «М-22», сертифицированного в ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Это обстоятельство определило дальнейший ход исследования, в котором в качестве тканевого субстрата для разработки способа получения вакцины против краснухи была использована линия диплоидных клеток человека «М-22».
В ходе получения нового варианта штамма «Орлов» адаптация вируса к иному тканевому субстрату не потребовалась: стабильный уровень репродукции, стабильный rct40 ±-фенотип регистрировали с первого по десятый пассаж вируса в клетках «М-22». Этот факт определил возможность получения нового штамма «Орлов-Д» проведением одного дополнительного пассажа вакцинного вируса в диплоидной линии клеток.
Далее был проведен сравнительный генетический анализ штаммов Wistar RA27/3 и полученного аттенуированого штамма «Орлов-Д». Анализ проводили по полной протяженности гена Е1 (1443 п.о.) и кодируемого им полипептида, так как именно гликопротеид Е1 является наиболее иммунологически важным структурным белком вируса краснухи [Chayne et al., 1992]. В ходе исследования выявлено, что доля нуклеотидных замен в структуре гена Е1 исследованных штаммов составляет 6,7%. Треть нуклеотидных замен (34,3%) явилась значимой, определила различия в аминокислотном составе белка Е1 между штаммами. Наиболее важными представляются различия, установленные в высоко консервативной области белка Е1, а именно на участке от 208 до 239 аминокислотного остатка. В указанной области белка Е1 штамма «Орлов-Д» определяется аминокислотная последовательность, практически идентичная таковой у многих «диких» и аттенуированных штаммов вируса краснухи: Therien, Judith, M-33, HPV77 [Chay et al., 1992, Domingues et al., 1999, Yao et al., 1999]. Тогда как, согласно данным литературы [Zheng et al., 1989] и полученным результатам, в указанном сайте белка Е1 штамма Wistar RA27/3 регистрируется замена Y(тирозин)→ H (гистидин). Значимость данного участка белка Е1 для реализации иммуногенности вируса краснухи была показана в работе [Jerry et al., 1993] по получению пяти синтетических пептидов, полностью перекрывающих протяженность полипептида Е1, и моноклональных антител к ним. В отличие от четырех других, антитела к данному участку молекулы Е1 (пептид SP15) нейтрализовали в ИФА как все другие пептиды, так и вирус краснухи в целом.
Выявленные различия исследованных штаммов «Орлов-Д» и Wistar RA27/3 в высоко консервативном участке молекулы Е1, ответственном за поливалентность иммуногенной активности вируса, свидетельствуют о возможном преимуществе применения штамма “Орлов-Д” для профилактики краснухи в условиях популяционной изменчивости возбудителя краснухи. Полученные результаты послужили дополнительным основанием для разработки способа получения вакцины против краснухи на основе диплоидной линии «М-22» и штамма «Орлов-Д».
ВТОРОЕ ПОЛОЖЕНИЕ
Выбор диплоидной линии клеток фибробластов кожно-мышечного лоскута эмбриона человека «М-22» для получения штамма «Орлов-Д» обусловлен чувствительностью указанной культуры клеток к вакцинному штамму вируса краснухи, аналогичной чувствительности клеточной культуры ППК, использованной для аттенуации штамма «Орлов», а также наличием банка посевных клеток «М-22», рекомендованных ГИСК им. Л.А. Тарасевича для производства вакцинных препаратов. Данная культура клеток является технологичным субстратом и пригодна для промышленного выпуска краснушной вакцины.
Выбор в качестве тканевого субстрата для получения вакцины против краснухи диплоидной линии клеток человека обусловлен следующим: полуперевиваемые (диплоидные) линии клеток в стадии активного роста обладают стабильным кариотипом, легко культивируются, формируются в банки посевных и производственных клеток, позволяют получить конечный продукт с стандартизованными характеристиками; рекомендованы экспертами ВОЗ для производства МИБП, вводимых людям и используются для получения вакцинных препаратов. Наиболее известная из них – диплоидная линия фибробластов кожи и мышц эмбриона человека, штамм Wistar 38, - является субстратом для получения вакцины против краснухи, кори и ряда других вакцин.
Возможность использования диплоидной линии клеток «М-22» в производственных целях оценивали, согласно действующему нормативному документу, МУ «Аттестация перевиваемых клеточных линий – субстратов производства и контроля медицинских иммунобиологических препаратов» (М., 1989 г.), регламентирующему порядок аттестации и использования диплоидных линий клеток.
Учитывая ограниченный срок жизни диплоидных клеточных линий и разные периоды жизнедеятельности (становления, активного роста, старения), чувствительность линии «М-22» к вирусу оценивали в диапазоне 20 – 41 пассаж культуры клеток, то есть в диапазоне культивирования производственной культуры. Заражение проводили в стационарных условиях при МИ=0,01 ТЦД50/кл. Средние результаты шести экспериментов представлены в таблице 2.
Таблица 2
Чувствительность клеток «М-22» к штамму «Орлов-Д» в зависимости от
количества пассажей диплоидной линии
| Количество пассажей куль-туры клеток «М-22» | Инфекционная активность вируса (lgТЦД50/0,5 мл) через … суток после инфицирования | ||
| 6 | 10 | 14 | |
| 20 | 4,0 | 4,4 | 4,2 |
| 22 | 3,8 | 4,3 | 4,5 |
| 25 | 4,0 | 4,1 | 4,5 |
| 29 | 3,9 | 4,5 | 4,3 |
| 31 | 4,0 | 4,2 | 4,2 |
| 35 | 4,0 | 3,8 | 3,5 |
| 41 | 3,0 | 3,3 | 2,5 |
Эксперименты показали, что на протяжении минимум 15-ти последовательных пассажей (c 20-го по 35-ый) линия клеток «М-22» обеспечивает стабильный уровень репродукции штамма «Орлов-Д», что является важным критерием пригодности клеточной культуры для ее использования в производственных целях.
Принимая во внимание преимущество использования единого тканевого субстрата для получения ассоциированных препаратов, и, в частности, трехкомпонентной вакцины корь-паротит-краснуха, была определена чувствительность диплоидной линии клеток «М-22» к вакцинным штаммам вируса кори Л-16 и вируса эпидемического паротита (ЭП), Л-3. Средние показатели инфекционной активности, полученные в пяти наблюдениях, представлены в таблице 3. Полученные результаты свидетельствуют о чувствительности диплоидной линии клеток «М-22» к репродукции обоих вакцинных штаммов. Стабильный уровень репродукции как вируса кори, так и вируса ЭП сохранялся в диапазоне с 20 по 35 пассаж культуры клеток.
Таблица 3
Чувствительность клеток «М-22» к вакцинным штаммам вирусов кори и ЭП
в зависимости от количества пассажей диплоидной линии
| Количество пассажей Культуры клеток «М-22» | Инфекционная активность (lg ТЦД 50/0,5 мл) вакцинных штаммов вирусов | |
| кори, Л-16 | ЭП, Л-3 | |
| 20 | 4,0 | 4,0 |
| 22 | 5,5 | 4,2 |
| 25 | 5,5 | 4,5 |
| 29 | 6,0 | 5,0 |
| 31 | 6,0 | 5,0 |
| 35 | 5,5 | 4,7 |
| 41 | 3,5 | 3,2 |
Поскольку применение диплоидных линий клеток в производстве МИБП основано на использовании банков клеток-продуцентов, важным условием пригодности клеточного субстрата для производственных целей является устойчивость клеточных пулов к криоконсервации. Для оценки диплоидной линии клеток «М-22» по данному критерию, клетки 20, 23, 27 пассажа подвергались глубокому замораживанию при температуре – 70 о С. Биологические свойства восстановленных после криоконсервации пулов клеток оценивали по индексу пролиферации и уровню инфекционной активности штамма «Орлов-Д» в клетках «М-22». Результаты экспериментов представлены в таблице 4 и свидетельствуют о сохранении биологических свойств линии клеток в заданных условиях.
Таблица 4
Устойчивость диплоидной линии клеток «М-22» к криоконсервации
| Количество пассажей культуры клеток | Индекс пролиферации | Средняя инфекционная акти- вность вируса (lgТЦД50/0,5 мл) |
| 20 | 3 | 4,0 |
| 23 | 3 | 4,1 |
| 27 | 3 | 4,1 |