На правах рукописи

Вид материала

Автореферат

Содержание Рисунок 9 - Электрофоретический анализ V антигенов после термообработки и обработки 2-меркаптоэтанолом. Изучение иммуногенной активности препаратов V антигена Y. pestis Рисунок 10 - Титры анти-LcrV антител (IgG) в крови мышей, иммунизированных различными структурными вариантами рекомбинантного V Таблица 2 - Протективная активность препаратов рекомбинантного LcrV Y. pestis По теме диссертации опубликованы следующие работы Светоч Т.Э.

Подобный материал:

• Печатная или на правах рукописи, 21.09kb.
• Удк 796/799: 378                                                                           , 770.24kb.
• На правах рукописи, 399.58kb.
• На правах рукописи, 726.26kb.
• На правах рукописи, 1025.8kb.
• На правах рукописи, 321.8kb.
• На правах рукописи, 552.92kb.
• На правах рукописи, 514.74kb.
• На правах рукописи, 670.06kb.
• На правах рукописи, 637.26kb.

Рисунок 9 - Электрофоретический анализ V антигенов после термообработки и обработки 2-меркаптоэтанолом. Линии: 1, 2, 9, 10, 11, 12, 21, 22 – полипептид LcrV(W113) из штамма E. coli BL21(DE3)/pETV C582; 3, 4, 7, 8, 13, 14, 19, 20 – полипептид LcrV(G113) из штамма E. coli BL21(DE3)/pETV I3455; 2, 4, 7, 9, 12, 14, 19, 21 – антигены прогреты перед иммунизацией при 45 C в течение 20 ч; 7, 8, 9, 10, 19, 20, 21, 22   пробы содержат 2-меркаптоэтанол, 1 – маркеры молекулярных масс; 15 – бычий сывороточный альбумин; А – 12 % ПААГ с додецилсульфатом натрия; Б – 7 % ПААГ не содержит додецилсульфат натрия.

Изучение иммуногенной активности препаратов V антигена Y. pestis

с различной аминокислотной последовательностью


По данным компьютерного моделирования, только одно местоположение выявленных нами замен (в позиции 113) может вносить серьезный вклад в формирование локальной структуры и изменение биологических свойств LcrV – замена триптофана на глютаминовую кислоту (штамм I-2359) или глицин (штамм I-3455) (рис. 4).Оценивая влияние полиморфизма аминокислотной последовательности V антигена на его биологические свойства, мы изучили способность препаратов рекомбинантного V антигена с различной аминокислотной последовательностью индуцировать продукцию антител. Для этой цели мы выбрали препараты V антигена, выделенного из штаммов-продуцентов E. coli BL21 (DE3)/pETV I3455, BL21 (DE3)/pETV I2359 и BL21 (DE3)/pETV C582, отличающиеся по аминокислоте в позиции 113.

Способность препаратов рекомбинантного LcrV индуцировать образование анти-LcrV антител (рис.10) после двукратной иммунизации мышей определяли методом твердофазного ИФА. Наибольшую антигенную активность показал полипептид LcrV_(G113) из штамма I-3455, титры антител к которому достигали 1 : 254000 (рис. 10). Титры антител к белкам LcrV_(W113) из штамма C-582 и LcrV_(E113) из штамма I-2359 не превышали 1 : 15600, то есть они обладали значительно более низкой способностью индуцировать продукцию антител.

Напряженность иммунитета, создаваемого препаратами V антигена с различной аминокислотной последовательностью, определялась по их способности предохранять от гибели белых мышей линии BALB/c после заражения массивной дозой вирулентной культуры Y. pestis 231 и выражалась в LD₅₀ и индексе иммунитета (табл. 2).



Рисунок 10 - Титры анти-LcrV антител (IgG) в крови мышей, иммунизированных различными структурными вариантами рекомбинантного V антигена. Измерение проводили при длине волны 492 нм. LcrV_(W113), LcrV_(G113), LcrV_(E113) - V антиген с триптофаном, глицином и глютаминовой кислотой в положении 113.


Согласно полученным данным, двукратное подкожное введение препарата V_(G113)/I-3455 обеспечивало 100%-ную защиту животных от подкожного заражения тест-штаммом Y. pestis 231 в дозах от 1 до 10⁷ м.к. Препараты V_(W113)/С-582, V_(W113)/А-1728, V_(E113)/I-2359 и V_(w113)/EV НИИЭГ не обладали протективной активностью. LD₅₀ вирулентного штамма Y. pestis 231 для мышей, иммунизированных данными препаратами, не отличалась от LD₅₀ вирулентного штамма для двух контрольных групп мышей (неиммунизированных или после введения гидроокиси алюминия). Индекс напряженности иммунитета препарата V_(G113)/I-3455 превышал аналогичный показатель для препаратов V_(W113)/С-582, V_(W113)/А-1728 и V_(E113)/I-2359 и V_(w113)/EV НИИЭГ на 5 порядков.


Таблица 2 - Протективная активность препаратов рекомбинантного LcrV

Препарат V антигена / штамм Y. pestis - источник lcrV	LD50 Y. pestis 231 для мышей, иммунизированных LcrV, КОЕ	Индекс иммунитета (LD50 для иммунизированных / LD50 для интактных животных)
V(W113) / С-582	15 (4-59)	5
V(W113) / А-1728	5 (1-19)	1,6
V(E113) / I-2359	15 (4-59)	5
V(G113) / I-3455	1,7 × 106 (1,0 × 106-3,2 × 106)	5,7 × 105
V(w113) / EV НИИЭГ	7 (1-20)	2,3
Контроль 1 (AL(OH)3)	3 (1-12)	1
Контроль 2 (интактные)	3 (1-12)	1

Полученные данные свидетельствуют о перспективности использования препарата V_(G113)/I-3455 в качестве компонента субъединичных чумных вакцин нового поколения.


ВЫВОДЫ

1. Генетический и структурно-функциональный анализ V антигена Y.pestis позволил выявить пять типов структурных вариантов белка LcrV (три типа впервые), которые отличаются по группо-специфичному полиморфизму в четырех «горячих точках» аминокислотных последовательностей. В состав отдельных аминокислотных типов входят варианты LcrV с дополнительным штаммо-специфичным полиморфизмом аминокислотных последовательностей.
   
2. Показано, что вариантные структуры LcrV свойственны лишь части “полевочьих” штаммов возбудителя чумы, а LcrV типа D, наиболее близкий по структуре к LcrV возбудителя псевдотуберкулеза, характерен для основного эпидемически значимого подвида и для наиболее филогенетически древних “полевочьих” штаммов.
   
3. Установлено, что изменчивость структуры V антигена не является причиной избирательной вирулентности “полевочьих” штаммов возбудителя чумы.
   
4. На основании компьютерного моделирования трехмерной структуры теоретически предсказано, что пять из выявленных нами вариантов аминокислотных замен в V антигене Y. pestis, не приводят к изменению локальных химических свойств белка (гидрофобности, гидрофильности, амфипатичности, заряда) и, вероятно, оказывают минимальное влияние на его структуру. Замена триптофана в позиции 113 на глютаминовую кислоту либо глицин должна оказывать значительное влияние на региональную структуру и, возможно, на функции LcrV возбудителя чумы.
   
5. Сконструирован набор продуцентов различных структурных вариантов V антигена, проведены выделение и очистка рекомбинантных белков.
   
6. Экспериментально показано, что замена в аминокислотной последовательности V антигена триптофана на глицин в положении 113 сопровождается повышенной способностью к олигомеризации (агломерации), коррелирующей с усилением протективной активности белка на пять порядков.
   

По теме диссертации опубликованы следующие работы:


а) статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК

1. Anisimov A.P., Panfertsev E.A., Svetoch T.E., Dentovskaya S.V. Variability of the protein sequences of LcrV between epidemic and atypical rhamnose-positive strains of Yersinia pestis // Adv. Exp. Med. Biol. – 2007. – V. 603. – P. 23-27. (4 цитирования по данным Web of Science®, 5 цитирований по данным oogle.com на 22.01.2011 г.).

2. Anisimov A.P., Dentovskaya S.V., Panfertsev E.A., Svetoch T.E., Kopylov P.Kh., Segelke B.W., Zemla A., Telepnev M.V., Motin V.L. Amino acid and structural variability of Yersinia pestis LcrV protein // Infect. Genet. Evol. – 2010. – V. 10 (1). – P. 137-145. (3 цитирования по данным oogle.com на 22.01.2011 г.).

б) патенты

3. Пат. № 2439155 С1 РФ, МПК С12N15/10, C07H21/00, C12N15/70, C12N1/21, C12P21/00. Hуклеотидная последовательность, кодирующая иммуногенный полипептид, вызывающий защитный иммунный ответ против; рекомбинантная плазмидная ДНК, кодируюшая иммуногенный полипептид; рекомбинантный штамм – продуцент иммуногенного полипептида; полипептид и способ его получения / Копылов П.Х., Бахтеева И.В., Анисимов А.П., Дентовская С.В., Иванов С.А., Киселева Н.В., Левчук В.П., Панферцев Е.А., Платонов М.Е., Светоч Т.Э., Титарева Г.М. – заявлено 02.06.2010; опуб. 10.01.2012.

в) тезисы научных конференций

4. Анисимов А.П., Панферцев Е.А., Светоч Т.Э., Копылов П.Х., Киселева Н.В., Левчук В.П., Дентовская С.В., Иванов С.А. Конструирование суперпродуцента V антигена Yersinia pestis // Санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях: Материалы VI-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ / Под ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева, В.В. Алексеева. Волгоград: Изд-во "Панорама". – 2005. - С. 174-175.

5. Panfertsev E.A., Svetoch T.E., Dentovskaya S.V. Sequencing of lcrV genes from representatives of different Yersinia pestis intraspecies groups // Abstracts of the 2^nd FEMS Congress of European Microbiologists (July 4-8, 2006, Madrid, Spain), P.VRL.38. - P. 184.

6. Панферцев E.A., Светоч T.Э., Дентовская С.В. Выявление пяти типов аминокислотных последовательностей белка LcrV Yersinia pestis // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита государств «группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств: Материалы VII-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (3-5 октября 2006 г., Оболенск, Московская обл.) / Под ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева, И.А. Дятлова. Протвино: Изд-во А-ПРИНТ ЗАО. - 2006. - С. 118-119

7. Panfertsev E.A., Svetoch T.E., Dentovskaya S.V. Sequence heterogeneity of the Yersinia pestis LcrV protein // Abstracts of the 9^th International Symposium on Yersinia (October 10-14, 2006, Lexington, Kentucky, USA) A116. - American Society for Microbiology, Washington, D.C. - 2006. - P. 75-76.

8. Киселева Н.В., Копылов П.Х., Панферцев Е.А., Светоч Т.Э., Дентовская С.В., Левчук В.П. Выделение LcrV Yersinia pestis, экспрессированного в клетках Escherichia coli // Материалы научно-практической конференции "Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на Юге России" (Ставрополь, 21-22 марта 2007 г.). - Ставрополь, 2007. – Ч. 1. – С. 172-173.

9. Dentovskaya S., Abbasova S., Bogatyrev V., Brovko F., Dykman L., Ivanov S., Kiseleva N., Kopylov P., Levchuk V., Laman A., Panfertsev E., Platonov M. , Shepelyakovskaya A., Sokolov O., Svetoch T. Pla and LcrV specific monoclonal antibodies for detection of Yersinia pestis // Program and abstracts of the 5^th International Conference on Emerging Zoonoses (Limassol, Cyprus, November 15-18, 2007). - P. 111.

10. Anisimov A.P., Panfertsev E.A., Svetoch T.E., Dentovskaya S.V., Segelke B.W., Zemla A., Motin V.L. Amino acid and structural variability of Yersinia pestis LcrV protein // Program and abstracts of the 5^th International Conference on Emerging Zoonoses (Limassol, Cyprus, November 15-18, 2007). - P. 112.

11. Копылов П.Х., Киселева Н.В., Платонов М.Е., Светоч Т.Э., Комбарова Т.И., Иванов С.А., Левчук В.П., Дентовская С.В. Влияние аминокислотной последовательности LcrV белка Yersinia pestis на его протективную активность // Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников Содружества Независимых Государств: Материалы IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ: (30 сентября - 2 октября, 2008 г., Волгоград) / Под ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева, В.В. Алексеева. - Волгоград, 2008. - С. 95-96.

12. Платонов М.Е., Киселева Н.В., Копылов П.Х., Светоч Т.Э., Дентовская С.В. Протективная активность различных структурных вариантов V антигена Yersinia pestis // Биологическая безопасность в современном мире: Материалы научно-практической школы-конференции научно-исследовательских учреждений Роспотребнадзора (21-22 апреля 2009 г., Оболенск, Московская обл.) / Под ред. Г.Г. Онищенко, И.А. Дятлова. - Протвино: А-ПРИНТ ЗАО, 2009. С. 224-225.

13. Копылов П.Х., Киселева Н.В., Бахтеева И.В., Шайхутдинова Р.З., Светоч Т.Э., Дентовская С.В., Анисимов А.П. Протективная активность V и F антигенов Y. pestis // Сборник трудов III съезда военных врачей. - Санкт-Петербург, 2010. - С. 283.

14. Платонов М.Е., Иванов С.А., Копылов П.Х., Светоч Т.Э., Дентовская С.В., Анисимов А.П. Изучение протективной активности смеси V и F1 антигенов Yersinia pestis // Материалы научно-практической школы-конференции молодых ученых и специалистов научно-исследовательских организаций Роспотребнадзора (2011 г., Оболенск, Московская обл.) / Под ред. Г. Г. Онищенко, И. А. Дятлова. – Протвино, 2011. – С. 328-329.


Благодарности


Приношу искреннюю благодарность научным руководителям моей кандидатской диссертации д.м.н., проф. А.П. Анисимову (ГНЦ ПМБ) и к.м.н. С.В. Дентовской (ГНЦ ПМБ), осуществлявшим научное руководство и оказывавшим методическую помощь на всех этапах работы.

Считаю своим приятным долгом выразить благодарность всем моим соавторам, принимавшим участие в планировании и проведении экспериментов, обсуждении их результатов и оказывавшим помощь в оформлении диссертации (профессору В.Л. Мотину из Техасского Университета (США), Dr. B.W. Segelke и Dr. A. Zemla из Ливерморской Национальной Лаборатории (США), к.б.н. Ф.А. Бровко из филиала Института биоорганической химии им. ссылка скрыта и ссылка скрыта РАН (Пущино), сотрудникам ФБУН ГНЦ ПМБ к.м.н. Е.А. Панферцеву, к.б.н. П.Х. Копылову, к.х.м. Н.В. Киселевой, к.б.н. С.А. Иванову, к.б.н. М.Е. Платонову, к.м.н. Г.М. Титаревой, к.м.н. И.В. Бахтеевой, Т.И. Комбаровой.

Глубоко признательна директору Иркутского научно-исследовательского противочумного института Сибири и Дальнего Востока д.м.н., проф. С.В. Балахонову и директору Ставропольского научно-исследовательского противочумного института д.м.н., проф. А.Н. Куличенко за предоставленные штаммы Y. pestis.

Благодарю директора ФБУН ГНЦ ПМБ чл.-корр. РАМН, д.м.н., проф. И.А. Дятлова за предоставленную возможность защитить диссертацию в диссертационном совете Д 350.002.01 при ФГУН ГНЦ ПМБ.

Признательна и благодарна всем рецензентам настоящей работы за многочисленные замечания, вопросы и поправки, которые, по возможности, были учтены и, в ряде случаев, помогли уточнить, а иногда и пересмотреть некоторые положения и формулировки.