Достижения в изучении методов лечения мышечной дистрофии Дюшенна
| Вид материала | Документы |
- «Пепдиатрия», 101.82kb.
- Ель этого проспекта – помочь больным и их родственникам получить информацию о гидроцефалии, 260.23kb.
- Лекция 3 30. 09. 96. Тема: Мезенхимальные дистрофии (продолжение), 75.77kb.
- Но универсальных методов лечения, направленных на запуск компенсаторных механизмов,, 108.65kb.
- Патогенетические обоснования стратегии и тактики лечения миастении 14. 00. 16 патологическая, 781.52kb.
- Приказ №51-о от 11. 05. 2010 исполнители, 1077.82kb.
- Каждый базовый курс курортологического лечения включает: Первичный визит к врачу, уточнение, 180.96kb.
- Аутогенная тренировка, 527.73kb.
- Урок 6/33 Тема : Современные достижения и роль астрономии, 284.3kb.
- Всвязи с этим приобретает значение разработка физических методов лечения, обеспечивающих, 21.9kb.
| Проект для родителей Мышечные дистрофии Сообщество помощи лицам, страдающим мышечной дистрофией Дюшенна |  |  |  |
Достижения в изучении методов лечения
мышечной дистрофии Дюшенна.
Дополнено в марте-апреле 2008
Это новый вид исследовательского отчёта, который автор статьи, Günter Scheuerbrandt, немецкий биохимик, подготовил для вас, мальчики и юноши, страдающие мышечной дистрофией Дюшенна, и ваших близких, всех кто хочет узнать о работе учёных и врачей в многочисленных исследовательских лабораториях по всему миру над созданием эффективных методов лечения мышечной дистрофии Дюшенна.
В моих ранних сообщениях, и особенно в последним из них, подготовленном к конференции в Цинциннати в июле 2006, в Лондоне в 2006 и в Филадельфии 2007 (ссылка скрыта), приводится более подробная информация о результатах исследований, обнародованных на этих научных мероприятиях. Но поскольку результаты отдельных исследований, выполненных ранее, не освещались на этих научных мероприятиях, автор обобщил их в своём сообщении, дополнив новой информацией, прежде всего с конференции ActionDuchenne’s, которая проходила в Лондоне в ноябре 2007, а также включил данные из недавних публикаций. Ссылки на отдельные наиболее важные публикации приводятся в конце некоторых разделов.
Информация в основном тексте соответствует состоянию на март-апрель 2008. При поступлении новой информации, я планирую обновление документа, в первую очередь после конференции Parent Project <Проект для родителей> в Филадельфии в июле 2008; через несколько месяцев информация будет доступна на английском, испанском и немецком. Как сообщалось ранее, все мои публикации, в том числе и та, которую Вы читаете, это не научные обзоры с большим количеством непонятных слов, поскольку я пытался написать понятным для вас языком о том, что происходит в лабораториях.
Это сообщение, как и предыдущие, включает только данные научных исследований. Однако, я попытаюсь также включить в последующие редакции сообщения информацию о новых медицинских манипуляциях и видах социальной помощи с учётом данных более поздних публикаций.
В разделах "выводы", я привожу только имена и фамилии руководителей лабораторий, однако, у них есть коллеги, постдоки и студенты, работающие в одной команде вместе с ними над проектами, описанными здесь, однако, перечислить их всех невозможно. Все руководители лабораторий, работы которых описаны в сообщении, имели возможность оценить посвящённые им разделы и внести в них исправления, что было крайне важным, почти все они воспользовались этой возможностью. Таким образом, удалось достигнуть снижения количества ошибок или совсем избежать их.
Свои вопросы об исследованиях направляйте в письменном виде на английском, французском и немецком по электронной почте. Я попытаюсь ответить на них, но только на английском или немецком.
Это сообщение подготовлено как часть работы TREAT-NMD, организации Европейского Союза со штаб-квартирой в университете Ньюкасал-апон-Тайн, Великобритания, двух головных организаций по изучению болезни Дюшенна PPMD в Миддлтауне, Огайо, США, и ActionDuchenne в Лондоне, Великобритания.
Введение
Как гены вырабатывают белки. Гены являются функциональными единицами генетического материала дезоксирибонуклеиновой кислоты, ДНК. Структура этой молекулы, похожая на скрученную лестницу, двойная спираль. Каждое звено лестницы состоит из четырёх различных молекул небольшого размера, нуклеотидных оснований: аденина, гуанина, тимидина, и цитозина (A, G, T, C). В связи со структурными особенностями, звенья могут содержать только два вида комбинаций, пары оснований A-T и G-C. Если, например, GGCTTAATCGT - последовательность этих оснований является одной стандартной последовательностью, противоположной ей является последовательность CCGAATTAGCA, таким образом обе последовательности комплементарны друг другу:
-GGCTTAATCGT-
|||||||||||
-CCGAATTAGCA-
Эта последовательность оснований, генетический код, является генетической информацией для развития и поддержания жизнедеятельности живого организма, которая передаётся из поколения в поколение.
Большинство генов являются инструкцией по биосинтезу белка. В ядре клетки, структура активных генов экспрессируется, она копируется- происходит транскрипция - <перезапись> на другой носитель генетической информации, пре матричную рибонуклеиновую кислоту или пре-мРНК, которая также называется транскриптом. Большинство генов состоит из активных или кодирующих областей, экзонов, которые хранят информацию о белках, и которые значительно длиннее интронов, которые содержат не только “генетический баласт”. Предполагается, что они несут важную информацию о регуляции активности генов. После транскрипции, интроны удаляются из пре-мРНК, а экзоны сшиваются с образованием матричной РНК, мРНК, которая образует комплекс с рибосомами, структурами, находящимися в цитоплазме клетки, основная функция которых — биосинтез белка. В состав рибонуклеиновой кислоты, РНК, входит основание U, урацил, вместо сходного основания T <тимин> ДНК. Местами сплайсинга являются отдельные последовательности, находящиеся внутри экзонов, на границах экзонов и интронов, которые имеют важность для правильного удаления последовательностей, не несущих информации, которая используется в биосинтезе белка - интронов в пре-мРНК. Процесс сплайсинга осуществляется сплайсосомами, комплексами, состоящими из нескольких белков и низкомолекулярной РНК. В матричной РНК, каждые три последовательных основания, за исключением трёх, кодоны, триплеты или «генетические слова», соответствуют одной из 20 различных аминокислот, согласно генетическому коду. Между кодонами нет промежутков. В рибосомах информация генетического кода матричной РНК считывается и переводится в язык белков, которые состоят из аминокислот, их строительных блоков, чаще нескольких тысяч. Этими тремя упомянутыми исключениями являются UAA, UAG и UGA, которые служат стоп-кодонами, отвечающими за прекращение синтеза белка на рибосомах.
Ген и белок дистрофина. Мышечные дистрофии Дюшенна и Беккера вызываются мутациями или повреждением гена дистрофина, несущего информацию о различных формах белка - дистрофина. Ген состоит из 2,220,223 оснований, это самый большой из известных генов человека. Только 11,058 оснований, 0.5%, в 79 экзонах гена дистрофина участвуют в кодировании последовательности из 3,685 аминокислот, образующих нормальную структуру дистрофина в мышечных клетках.
Размер гена и белка дистрофина. Длина двойной спирали гена дистрофина составляет 0.75 мм. Наряду с другими, по меньшей мере, 20,488 генами человека, она находится в клеточном ядре, диаметр которого около 0.01 мм, что возможно только благодаря плотной укладке генетического материала. Молекула белка дистрофина при полной его длине значительно короче гена, её длина составляет 125 нанометров (= 0.000125 мм), если 8,000 молекул выстроить в прямую линию друг за другом - получится цепочка длиной один сантиметр. А в одном грамме мышечной ткани содержится 114 миллиард молекул дистрофина. Это может помочь в понимании задачи учёных: для того, чтобы остановить или замедлить течение заболевания, восстановить более или менее нормальное функционирование мышц, необходимо восстановить около 30% нормального количества дистрофина, выработка которого нарушается при повреждении гена. Новый белок не обязательно должен иметь форму, полностью соответствующую оригинальному белку, он может быть короче, но должен обладать необходимыми функциональными характеристиками. После чего миллиарды и миллиарды новых молекул дистрофина возвращаются в каждый грамм мышечной ткани, которой у ребёнка несколько килограмм!
Роль дистрофина. Дистрофин необходим для обеспечения механической стабильности мышечных клеток. Он расположен на внутренней поверхности мембран миоцитов. Один из его концов, C-концевая часть, связанна с группой других белков мембраны, образуя дистрофин-гликопротеиновый комплекс, а другой конец, N-концевая часть, контактирует со структурами, участвующими в мышечном сокращении, находящимися внутри мышечной клетки. Центральная часть дистрофина, основной домен, состоит из складчатых последовательностей аминокислот, которые несколько раз меняют свое направление. Если длина молекулы дистрофина меняется под действием мышечного сокращения, её складчатая структура играет роль пружины, которая может поглощать энергию. Таким образом, дистрофин передаёт механическую энергию, которая образуется при сокращении актин-миозиновых комплексов на мембраны миоцитов и структуры, находящиеся за их пределами, соединительные ткани и сухожилия, и служит структурой, позволяющей не подвергать их избыточной механической нагрузке.
У дистрофина также есть несколько других функций: он формирует сложную структуру дистрофин-гликопротеиновых комплексов и место для нахождения многих других белков. Он также регулирует сложные процессы, такие как поддержание необходимого количества кальция в клетках и контроль роста мышц. Многие детали этого интересного взаимодействия между различными компонентами живых клеток остаются неизученными.
У мальчиков, страдающих болезнью Дюшенна, снижено количество дистрофина в мышечных волокнах или полностью отсутствует. При потере защитного и структурного действия белка, мышечное сокращение приводит к повреждению мышечных мембран, что приводит к поступлению больших количеств кальция к мышечным волокнам. Избыточное количество кальция активирует отдельные белки, такие как кальпаин, и другие протеазы, которые разрушают белки мышечной ткани и запускают программы гибели клеток - апоптоз. Последствия данной цепи патофизиологических механизмов, такие как воспаление и активация фибробластов, приводят к развитию фиброза, образованию рубцовых изменений, что замедляет регенерацию мышечной ткани и обуславливает характерную клиническую картину поздних стадий болезни Дюшенна.
У мальчиков с более медленно прогрессирующей мышечной дистрофией Беккера количество дистрофина меньше нормы, кроме того, длина белка меньше нормальной. Белок сохраняет свои функции, но не может работать также эффективно, как его нормальный аналог.
Снижение количества дистрофина нарушает работу не только скелетных мышц, но и гладкой мускулатуры, и миокарда. Поражение сердечной мышцы приводит к развитию кардиомиопатии, слабость гладких мышц приводит к многочисленным последствиям, в том числе к снижению способности кровеносных сосудов к расслаблению, что приводит к дыхательным и другим нарушениям, а также нарушается работа желудочно-кишечного тракта вследствие снижения его моторики. Таким образом, поражение только одного гена может приводить к нарушением в различных системах организма.
Мутации гена дистрофина. Существует три распространённых вида мутаций, которые нарушают функции гена дистрофина: делеции, когда отсутствуют один или более экзонов гена, редупликации, если части гена повторяются, и точечные мутации, если изменяются, включаются в генетический материал или удаляются отдельные пары оснований. Другими видами мутаций являются инверсии и изменения интронов, которые изменяют нормальный характер сплайсинга.
Поскольку трёхнуклеотидные последовательности информационной РНК считываются один за другим без перерывов, эта нормальная рамка считывания продолжает функционировать, если мутации связаны выпадением или дополнительным включением целого кодона. В этом случае, рамка считывания продолжает работать, но синтезируемый дистрофин может быть короче или длиннее нормальной молекулы. Если эти изменения захватывают участки дистрофина, не имеющие критического значения, функция белка может быть частично сохранена, что приводит к развитию мышечной дистрофии Беккера.
Однако, если мутация приводит к сдвигу рамки считывания вследствие повреждения одной или двух пар оснований, её функционирование нарушается. Это приводит к изменению правильной аминокислотной последовательности белка с места расположения мутации, что продолжается до достижения стоп-кодона. Неполная молекула дистрофина не может выполнять
функции этого белка, она разрушается, что приводит к развитию мышечной дистрофии Дюшенна.
Дистрофин в головном мозге. Дистрофин встречается не только в мышечных волокнах, но встречается и в других органах, таких как головной мозг или сетчатка глаза. Молекулярная масса дистрофина, входящего в состав мышечной ткани, составляет 420 Кд, килодальтон (в 420,000 раз тяжелее атома водорода) – это самая крупная из пяти изоформ (белков различного размера). В головном мозге встречается этот нормальный дистрофин, а также четыре его более мелкие изоформы, которые встречаются преимущественно в синапсах, структурах, которые служат для соединения нервных клеток, и в стенках кровеносных сосудов головного мозга, формирующих, так называемый, гематоэнцефалический барьер. Это значит, что дистрофины играют важную роль в соединении между нервами, а также в правильном функционировании гематоэнцефалического барьера, что позволяет поступать в головной мозг только тем веществам, которые необходимы для его нормального функционирования. Ген дистрофина включает семь промоторов, последовательностей, с которых начинается биосинтез белка. Первые три промотора находятся в начале гена, контролирующего синтез нормального белка, другие четыре находятся внутри гена. Наиболее близкий к концу гена промотор запускает синтез более короткой молекулы дистрофина. Это означает, что мутации, возникающие до этого промотора, не нарушают образование и структуру белка, которые синтезируется с участием этого промотора. Например, у мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна с мутациями в первой половине гена, продолжают синтезироваться более короткие изоформы дистрофина, которые встречаются в головном мозге, по сравнению с мутациями последующих участков гена, которые приводят также к развитию симптомов поражения головного мозга, в связи с отсутствием изоформ, специфичных для головного мозга. Этот факт служит объяснением, почему у отдельных мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, есть проблемы с поведением и обучением, а у других их нет.
Поскольку различные формы дистрофина встречаются в сетчатке глаза, местоположение мутации играет роль в развитии нарушения цветного зрения у отдельных мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна.
Совместно с проф. Francesco Muntoni, Королевский колледж Лондона.
Пропуск экзонов
Индукция пропуска экзонов не является лечением. Методика с пропуском экзонов используется как попытка замедлить скорость прогрессирования мышечной дистрофии Дюшенна, изменяя течение заболевания, делая его более похожим на доброкачественную дистрофию Беккера с более мягким течением. Это не исправляет мутации, но оказывает влияние на считывание и обработку отдельного гена. Пропуск экзонов не может рассматриваться как метод излечения мышечной дистрофии Дюшенна, этот метод может только снизить тяжесть симптомов заболевания, что является единственной целью терапии.
Если мутация, делеция, дупликация или точечная мутация, сдвигают рамку считывания матричной РНК, мРНК, и приводят к развитию мышечной дистрофии Дюшенна, рамка может быть восстановлена с помощью предотвращения включения в мРНК одного или более экзонов с антисмысловыми олигорибонуклеотидами, AOНами. Они являются короткими участками РНК, синтезированными искусственно, структура которых позволяет им присоединяться к комплементарной последовательности пре-мРНК внутри экзона и избирательно удалять только этот участок, не действуя на остальные. Таким образом, АОН оказывают влияние на механизм сплайсинга, препятствуя включению отдельного экзона или экзонов в мРНК, при этом они пропускаются.
Поскольку мРНК после пропусков короче нормальной, длина дистрофина также меньше, поскольку он содержит меньшее количество аминокислот. Если отсутствующие аминокислоты являются частью областей, не имеющих критического значения, таких как центрально-стержневые домены, более короткий белок может сохранять способность стабилизировать мембраны миоцитов. Вследствие этого, тяжёлые симптомы, характерные для мышечной дистрофии Дюшенна, могут трансформироваться в более мягкие, характерные для мышечной дистрофии Беккера.
В первых исследованиях пропуска экзонов использовалось два вида АОН, защищённых при помощи химических методов. Защита молекул требуется, поскольку это снижает темп их разрушения или полностью блокирует их инактивацию ферментами клетки, разрушающими нуклеиновые кислоты. Двумя типами АОН являются 2'O-метил-фосфоротиоаты, которые также называются 2’O-метилы и морфолины.
Пропуск экзонов: исследование в Нидерландах. Первое исследования метода пропуска экзонов, выполненное с участием людей, проводилось в Нидерландах с января 2006 по март 2007. Исследование преследовало цель только доказать состоятельность данного подхода к лечению, но не оценивало терапевтическую эффективность препарата у мальчиков, получавших лечение. В исследовании проводилась оценка небольшого участка одной мышцы, передней большеберцовой мышцы голени, в которую вводился 2’O-метил антисмысловой олигорибонуклеотид, комплементарный экзону 51, который называется PRO051. Этот тип АОН, защищённого химическими методами, использовался голландскими учёными при проведении доклинических исследований в течение нескольких лет, и позволял осуществлять пропуск экзонов дистрофина в мышечных волокнах, не только в клеточных культурах, но и у живых мышей и собак после местного и системного (в кровоток) введения.
До начала этого первого клинического исследования пропуска кодонов, были выполнены клинические и молекулярно-генетические исследования каждого мальчика для того, чтобы убедиться, что использование процедуры пропуска экзонов у этих мальчиков приведёт к синтезу более короткого дистрофина, структура которого сходна с белком, характерным для мышечной дистрофии Беккера. В исследовании принимали участие четыре мальчика, которые уже были прикованы к инвалидным креслам. Возраст участников находился в пределах от 10 до 13 лет, были верифицированы делеции экзонов дистрофина 50, 52, 48-50, и 49-50. Участники исследования получали лечение последовательно, назначение лечения последующему участнику исследования проводилось только после получения положительных результатов и отсутствия серьёзных побочных действий у участников исследования, которые получали лечение ранее. Каждому мальчику проводилось четыре инъекции по 0.2 мг PRO051, растворённого в 0.2 мл физиологического раствора (0.9% NaCl) под местной анестезией в область мышцы голени небольшого размера - участок передней большеберцовой мышцы длиной 1.5 см.
Через четыре недели выполнялась биопсия места введения препарата с последующей оценкой для выявления изменённой мРНК с пропущенными кодонами и укороченного дистрофина. Исследования показали, что через 4-недели введения препарата дистрофические волокна, содержащие вновь синтезированный дистрофин в мышечных волокнах выявлялись в 64%, 85%, 97%, и 73% случаях. По сравнению с этим, введение α2-ламинина, белка, который не вовлекается в дистрофический процесс, сопровождалось содержанием дистрофина 33%, 35%, 17%, и 25%. Это сравнение учитывает выраженность дегенеративных изменений мышечной ткани. Без этой поправки, у 13-летнего мальчика с высоким содержанием соединительной ткани и жира в мышцах, содержание нормального дистрофина составило 3% от нормального количества, в то время, как у мальчика с менее выраженным поражением эта доля составляла 12%. При помощи метода молекулярного секвенирования было доказано, что новый дистрофин при восстановлении рамки считывания сохраняет свою структуру. Было невозможно установить, является ли количество вновь синтезируемого дистрофина, достаточным для замедления прогрессирования заболевания в мышечной ткани всего организма, поскольку объём мышечной ткани, который оценивался в исследовании, был чрезвычайно мал.
Полученные результаты указывают, что лечение с использованием пропуска экзонов, при появлении возможности его использования, должно начинаться, пока большая часть мышечной ткани не захвачена патологическими изменениями, непосредственно после выявления вида мутации дистрофина, которая вызывает сдвиг рамки считывания.
В настоящее время голландские исследователи начали клиническое исследование I/II Фазы для изучения эффективности, безопасности, переносимости и возможных побочных эффектов системного введения АОН PRO051 непосредственно в кровоток, чтобы препарат поступал во все типы мышечной ткани, включая гладкие мышцы лёгких и миокард. Исследование выполнено в сотрудничестве с Университетом Лувена в Бельгии, Лейденским университетским медицинским центром и Медицинским центром королевы Сильвии в Швеции. В настоящее время проводится набор пациентов.
Данные, полученные на мышах и обезьянах, при подкожном введении препарата, свидетельствуют о том, что данный путь введения способствует развитию пропуска экзонов без сопутствующих серьёзных побочных эффектов во всех исследуемых мышцах, а также сердца и диафрагмы, и позволяют рассчитывать на возможность использования этого пути, что позволит избежать частого посещения врача и госпитализации при необходимости повторных инъекций.
Эта техника инициации пропуска экзонов с использованием 2’O-метил АОН была разработана в Лейденском университете проф. Gertjan van Ommen, Др. Judith van Deutekom и их сотрудниками, но за организацию и проведение клинического исследования в настоящее время отвечает компания Prosensa B.V. в Лейдене, президентом которой является Др. Gerard Platenburg. Др. van Deutekom в настоящее время является директором по проведению исследований компании Prosensa.
Это исследование системного введения проводилось с участием 12 мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна в возрасте 5-15 лет, которым в течение пяти недель еженедельно проводились подкожные введения препаратов. Поскольку не была доказана безопасность использования у детей доз АОН, использованных в доклинических исследованиях, в начале исследования системного введения применялись очень низкие дозы, которые постепенно увеличивались до оптимального уровня с начальной дозы 0.5 мг/кг/ на инъекцию до максимальной 10 мг/кг.
В настоящее время Prosensa производит АОН для индукции пропуска экзона 51 в количестве, исчисляемом граммами, качество которого соответствует необходимому для использования в клинических исследованиях, для проведения данной работы. Также была оптимизирована структура АОН, приготовленных против экзонов 43, 44, 45, 46, 50, 52 и 53. Совокупность этих АОН, в том числе анти-51 АОН, позволит проводить лечение порядка 65% пациентов с делециями. Однако, по финансовым причинам, Prosensa в настоящее время разрабатывает только АОН против 44, 51, и 52, предназначенные для клинического использования и продажи.
Для разработки других АОН компании требуются дополнительные инвестиционные средства, компания с признательностью использует средства, полученные от организаций пациентов, таких как голландские и немецкие родительские проекты, французская ассоциация изучения мышечной дистрофии AFM и других.
Пропуск экзонов: клиническое исследование в Великобритании.
Другим клиническим исследованием пропуска экзонов было исследование, выполненное в Великобритании Консорциумом MDEX под управлением проф. Francesco Muntoni Королевского колледжа Лондона. Консорциум MDEX, финансируемый департаментом здравоохранения, объединяет девять исследователей, а также хартии: Компания по изучению мышечной дистрофиии, ActionDuchenne, и Группа поддержки родителей пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна.
В культуре нормальных и поражённых мышечной дистрофией Дюшенна миоцитов человека и не поражённых дистрофией миоцитов мышей, содержащих гены дистрофии человека, оценивались восемь различных антисмысловых олигонуклеотидов. Лучшие результаты были получены при использовании АОН морфолино H51A , разработанным проф. Steve Wilton, в Перте (Австралия); проф. Dominic Wells в Лондоне показал достаточную стабильность для длительного клинического использования. АОН морфолино для клинического использования был разработан компанией AVI BioPharma инк. в Портланде, Орегон, и носит название AVI-4658.
Три группы по три мальчика, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, в каждой, в возрасте от 12 до 18 лет, которые не могли самостоятельно передвигаться, получали три различные дозы: 0.09, 0.297, и 0.9 мг АОН морфолина в 0.9 мл физиологического раствора, которые разделялись на девять инъекций, проводимых непосредственно в короткий разгибатель большого пальца на наружной поверхности одной из стоп. Эта мышца была выбрана, поскольку она легко доступна и может быть удалена без серьёзных последствий при развитии серьезных побочных эффектов. В другие мышцы стопы вводился физиологический раствор для контроля. До начала исследования и через 30 дней проводились обширные клинические обследования, включая проведение биопсии.
После получения разрешения трёх регуляторных органов Великобритании в ходе длительной процедуры подготовки, первое введение АОН мальчику было выполнено 18 декабря 2007. Публикация окончательных результатов исследования ожидается в 2008 году.
Поскольку в первом исследовании были получены обнадёживающие результаты, будет начато исследование системного использования препарата, которое в настоящее время находится на стадии окончания планирования, в исследовании планируется проводить подкожное введение АОН AVI-4658, с целью поступления препарата в кровоток. Одним из наиболее важных экспериментов на животных было исследование, когда АОН вводился семь раз в неделю в вену хвоста мышей mdx, что приводило к образованию более чем 50% от нормального количества дистрофина в большинстве мышц и отмечалось как минимум в течение 14 недель.
В этом исследовании системного введения было запланировано лечение четырёх групп мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, которые могли передвигаться, препарат должен был вводиться в низкой дозе около 600 мг АОН, с повышением до 3 грамм, в расчёте на мальчика 10 лет. В выполненных ранее клинических исследованиях других заболеваний, АОН в дозах 300 мг/кг/сут хорошо переносились, таким образом, стартовая доза, использованная в исследованиях мышечной дистрофии Дюшенна, была крайне низкой. Целью исследования была оценка безопасности и переносимости, а также изменения функций мышц и их силы. Предполагается, что использование минимальной дозы может определить, вызывает ли препарат достаточную эффективность пропуска экзонов при хорошей переносимости у детей, без развития серьёзных побочных эффектов.
Подробное описание клинических исследований местного использования препаратов приводится на сайте ссылка скрыта
Пропуск экзона с переносом гена U7: исследователи института Gẻnẻthon в Эври в пригороде Парижа, проф. Luis García и Др. Aurélie Goyenvalle (в настоящее время Оксфордский университет) и их сотрудники попытались комбинировать терапию, направленную на пропуск экзонов и генную терапию, вызывая самостоятельную выработку антисмысловых олигорибонуклеотидов мышцами, что не требовало повторного введения препарата. Это могло быть достигнуто введением в мышцы, модифицированной U7-ня<низкомолекулярной ядерной>РНК, содержащей информацию о сборке АОН. U7-няРНК являются мелкими молекулами РНК, которые сходны по структуре с факторами сплайсинга. В рамках второй исследовательской программы, французские исследователи разработали новую, более общую методику пропуска экзонов, которая также основана на использование вирусной трансфекции генов U7.
Для оценки первого подхода, модифицированный ген U7-няРНК был сконструирован при помощи добавления комплементарных последовательностей ДНК к двум АОН, что необходимо для пропуска экзона 23 мышей линии mdx. Это короткие няРНК, такие же, как другие РНК, также "сделаны" из генов. Модифицированный ген U7, U7 SD23/BP22, с контрольными последовательностями, был введён в состав векторов AAV<аденоассоциированный вирус>-типа-2 и введён сначала местно в мышцы мышей линии mdx, а затем системно, в кровоток. Это сопровождалось появлением дистрофина без аминокислот, которые кодировались экзоном 23 в почти 80% волокнах мышц, в которые вводился препарат, этот новый укороченный дистрофин мигрировал в своё обычное положение в мембране клеток, и сохранял стабильность в течение более одного года без развития какой-либо иммунной реакции. Дистрофические процессы в мышцах мышей mdx, сопровождавшиеся ранее дегенерацией и регенерацией, были полностью остановлены. У мышей линии mdx, которым проводилось системное введение препарата, во время физической нагрузки при беге на тредмиле не развивалось повреждение мышечной ткани, характерное для мышей линии mdx, которым не вводился препарат.
Эта методика лечения с введением гена U7 была использована для лечения золотистого ретривера с клиническими признаками дистрофии GRMD <мышечная дистрофия золотистых ретриверов>. Для этих собак характерны мутации в месте сплайсинга экзона 7, которая может быть “исправлена” при помощи пропуска экзонов 6 и 8. Введение модифицированного вектора U-7, содержащего антисмысловые структуры к экзонам 6, 7, и 8, укорачивало дистрофин почти до нормального уровня в течение двух месяцев после однократного местного введения в мышцу. Региональное системное введение в нижнюю конечность с блокированной циркуляцией приводило к образованию большего количества дистрофина, которых продолжал выявлялся в течение шести месяцев.
Во втором подходе, основанном на переносе гена U7, пропуск экзона вызывался новым и почти “универсальным” U7няРНК вектором, который включал комплементарную последовательность ДНК в экзон и свободный конец, который служил местом связи разнородных ядерных рибонуклеопротеинов A1/A2 (ряРНП), белков, блокирующих сплайсинг всех экзонов. Последовательность, комплементарная перенесённому гену, считывается и синтезируется РНК небольшого размера, которая прикрепляется к экзону, который необходимо пропустить, и поскольку переносятся компоненты, прикреплённые к ряРНП, это вызывает пропуск экзонов, поскольку эти белки связываются с комплексом, осуществляющим сплайсинг, сплайсосомами, находящимися в конце этого экзона пре-мРНК. Таким образом, подобный вид пропуска экзона вызывается не обычными АОН, а “универсальными” белками, которые могут ингибировать сплайсинг всех экзонов. Эффективность использования этого метода была успешно оценена в лабораторных условиях для пропуска экзона 51 в миобластах, выделенных у пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна.
Обоснованием этого подхода было значительное сокращение продолжительности процедур регистрации, которые должны проводится в отношении многих, если не всех видов AON, которые используются для методик индукции пропуска экзонов, поскольку новый подход использует “универсальную” основную структуру, к которой присоединяется ДНК последовательность, комплементарная экзону, который необходимо "пропустить".
Пропуск нескольких экзонов у собак, страдающих дистрофией. Для лечения многих видов дистрофий Дюшенна, вызванных делециями, дупликациями и точечными мутациями, для восстановления рамки считывания требуется пропуск двух и более экзонов. Поскольку собакам, страдающим дистрофией, требуется пропуск двух экзонов, ожидается, что эти исследования откроют путь к разработке лечения при помощи пропуска нескольких экзонов, при более сложных, для коррекции, мутациях, приводящих к развитию дистрофии Дюшенна. На основании теоретических предположений ожидается, что одновременный пропуск 11 экзонов с 45 по 55 у 63% мальчиков с мышечной дистрофией Дюшенна, связанной с делецией, может перевести заболевание в мышечную дистрофию Беккера, для которой характерно более мягкое течение. Однако, попытки коррекции в течение двух лет указывают на невозможность выключения такого большого количества экзонов одновременно.
Проф. Terence