Достижения в изучении методов лечения мышечной дистрофии Дюшенна
| Вид материала | Документы |
- «Пепдиатрия», 101.82kb.
- Ель этого проспекта – помочь больным и их родственникам получить информацию о гидроцефалии, 260.23kb.
- Лекция 3 30. 09. 96. Тема: Мезенхимальные дистрофии (продолжение), 75.77kb.
- Но универсальных методов лечения, направленных на запуск компенсаторных механизмов,, 108.65kb.
- Патогенетические обоснования стратегии и тактики лечения миастении 14. 00. 16 патологическая, 781.52kb.
- Приказ №51-о от 11. 05. 2010 исполнители, 1077.82kb.
- Каждый базовый курс курортологического лечения включает: Первичный визит к врачу, уточнение, 180.96kb.
- Аутогенная тренировка, 527.73kb.
- Урок 6/33 Тема : Современные достижения и роль астрономии, 284.3kb.
- Всвязи с этим приобретает значение разработка физических методов лечения, обеспечивающих, 21.9kb.
У этих собак отмечались мутации в месте сплайсинга экзона 7 гена дистрофина, которая вызывала делецию экзона 7 в мРНК и сдвиг рамки считывания, с быстрым преждевременным достижением стоп-кодона. Пропуск двух, расположенных рядом, экзонов 6 и 8 может восстановить рамку считывания.
В первом исследовании местного введения, исследователи вводили различные дозы смеси трех АОН "морфолино", два их которых были направлены против экзона 6, а третий - против экзона 8, в переднюю большеберцовую мышцу молодых взрослых собак GRMD. Через две недели выполнялась биопсия тканей, окружающих место инъекции, которые содержали во всех мышечных волокнах новый и укороченный дистрофины, с почти нормальной структурой. В дополнение к запланированному выключению экзонов 6 и 8, также выключался экзон 9; однако это не приводило к сдвигу рамки считывания. В предварительных экспериментах на культуре ткани, экзоны 6, 8, и 9 пропускались при использовании морфолинов, предназначенных только для экзона 6, но этого не происходило при непосредственном введении морфолинов в мышцы; смесь морфолинов против экзонов 6 и 8 использовалась для пропуска трех экзонов в мышцах живых лабораторных животных. Таким образом, пропуск экзонов в культуре тканей не является полноценной моделью, отражающей состояние мышц лабораторных животных и человека.
Исследование системного введения было выполнено совместно с Др. Shin'ichi Takeda в Главном центре лабораторных исследований в Токио, собакам в возрасте трёх месяцев выполнялось введение трёх АОН в вены нижних конечностей, что также приводило к пропуску трёх экзонов 6, 8, и 9. После двух месяцев, большая часть скелетных мышц животных вырабатывала укороченный дистрофин в необходимых количествах, выработка белка носила дозозависимый характер. В миокарде вновь синтезированного дистрофина не выявлялось, что соответствовало данным выполненных ранее исследований о том, что АОН морфолино не проникают в сердечную мышцу.
На основании оценки нескольких мышц, физическое состояние собак стабилизировалось на уровне, который был до начала лечения, в то время, как у собак, не получавших лечение, отмечалось значительное ухудшение. Таким образом, создавалось впечатление, что системное введение препарата снижало скорость дегенерации мышц. Оценка структуры мышц проводилась по данным ядерно-магнитно-резонансной томографии (ЯМР). Эта неинвазивная методика показала при оценке мышечной ткани информативность, сходную с биопсией. Это представляет важность для проведения клинических исследований в группе мальчиков, страдающих болезнью Дюшенна, поскольку при их проведении требуется минимизация количества биопсий.
Таким образом, АОН морфолино показали эффективность при лечении крупных животных, сходных по морфологическим признакам с человеком. Препараты нетоксичны и не вызывают иммунной реакции. Однако, в связи с нестойким эффектом, препараты требуют повторного введения, также возможен перерыв в терапии при развитии осложнений. Препараты эффективны только в тех тканях, в которых ген дистрофина транскрибируется в пре-мРНК, например, в мышечной ткани. В скором времени ожидается публикация подробностей этих обнадёживающих результатов.
Пропуск экзонов с пептидными нуклеиновыми кислотами. Как сообщалось выше, в клинических исследованиях с участием мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, используется два вида антисмысловых нуклеотидов, которые вызывают пропуск экзонов, 2’O-метилфософоротинатов (2’O-метилы) в Нидерландах и морфолины в Великобритании. Также исследовалась способность индуцировать пропуск экзонов у другой группы АОН, пептид-нуклеиновых кислот (ПНК). Рибонуклеиновые кислоты (РНК) и пептид-нуклеиновые кислоты имеют различную основу: основу РНК составляет цепочка чередующихся остатков фосфорной кислоты и рибозы, в то время, как основу ПНК составляет цепочка аминокислот. Ввиду низкой полярности химической связи, -CO-NH-, между аминокислотными остатками, РНП обладают электро-нейтральными свойствами. Они растворимы в воде, очень химически устойчивы, могут быть легко модифицированы для того, чтобы нести на своей поверхности обычные ДНК и РНК правильной пространственной структуры с любой желаемой последовательностью. Таким образом, в настоящее время в экспериментах с пропуском экзонов используются, короткие антисмысловые цепочки РНК, состоящие из 20 - 30 оснований, такие как два других типа АОН.
Др. Matthew Wood и его сотрудники в Оксфордском Университете начали работу с антисмысловой РНК, созданной из субъединиц, кодирующих самую простую аминокислоту, глицин, для пропуска экзона 23 у мышей линии mdx. Эксперименты в клеточной культуре и с использованием введения в отдельные берцовые мышцы молодых и старых живых мышей линии mdx, показали, что через три недели после однократного введения многие мышечные волокна содержали новый дистрофин, который сохранял стабильность в течение восьми недель.
Для улучшения поступления в мышечную ткань, “конъюгированные” ПНК прикрепляются к другим пептидам и белкам, таким как синтетические пептиды, содержащие большое количество аргинина, для трансдукции домена TAT протеина ВИЧ , и функционального домена оболочечного белка ААВ. Положительные результаты пропуска экзонов при использовании РНК-конъюгатов могут быть улучшены, по крайней мере, в клеточной культуре, при использовании антисмысловой РНК, основа которой состоит из изменяющихся субъединиц аминокислоты пролина и других аминокислот, которые так же, как и пролин, имели в своём составе пятичленный цикл.
Результаты этого исследования не опубликованы, поэтому автор не может привести подробности эксперимента. Они поразительны и позволяют надеяться, что использование препаратов с антисмысловыми последовательностями даст эффективный инструмент для индукции пропуска экзонов.
Введение гена дистрофина
Введение гена дистрофина с использованием вирусных векторов.
Введение модифицированного гена дистрофина с использованием аденовирусов (ААВ) в качестве векторов (переносчиков генов) в мышечные клетки является одним из подходов к лечению мышечной дистрофии Дюшенна. Успешные эксперименты на мышах и собаках, страдающих дистрофией, оказали помощь в разработке препарата Biostrophin™ биологической наночастицы компанией Asklepius в Чапел Хилл, Северная Каролина, вектора ААВ, серотипа 2.5 сначала для клинических исследований этого метода генетической терапии.
Эти достаточно небольшие вирусные частицы теряют способность к раздражениям в клетке, поскольку большинство их генов удалено. В результате этого освобождается место для последовательностей терапевтического гена, размер которого не должен превышать 5,000 пар оснований. Поэтому, векторы, которые используются в этом исследовании, переносят сконструированный ген дистрофина без интронов (кДНК), включающий отдельные части экзона 17, а все экзоны от 18 до 59 и от 70 до 79 удалены. Трансфекция такого микрогена не приводит к излечению мышечной дистрофии Дюшенна, а только трансформирует заболевание в более доброкачественную форму Беккера с более мягким течением. Ожидаемая длина нового дистрофина, встречающегося при мышечной дистрофии Беккера приблизительно равна трети длины нормального белка. В 1990 году данная форма укороченного дистрофина была выявлена в мышечной ткани у 61-го летнего пациента, страдающего мышечной дистрофией Беккера, который сохранял способность ходить. Результаты использования метода сходны с лечением, основанным на пропуске экзонов, его действие связано с видом мутации: после завершения разработки метода трансфекции гена будет возможно его использование для лечения всех пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна.
После окончания оценки безопасности и токсичности вектора мини-дистрофина в исследованиях на лабораторных животных, было выполнено двойное-слепое исследование Ia Фазы с участием шести мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, в возрасте старше пяти лет, оно проводилось в 2006 и 2007 году под руководством проф. Jerry Mendell, в Национальном детском медицинском центре и в Государственном университете Огайо в Колумбусе, Огайо. Мальчики получали инъекции препарата в три точки, находящиеся на расстоянии 0.5 см одна от другой, эти точки располагались на бицепсе одной руки, в аналогичную мышцу на другой вводился физиологический раствор. Для каждой группы из трёх пациентов использовались различные дозы препарата. Образцы мышечной ткани из места введения препарата забирались при проведении биопсии, у четырёх мальчиков на четвёртой неделе, а у двух на двенадцатой неделе после введения препарата. Во время проведения исследования нежелательные явления генетической терапии не отмечались, что указывало на хорошую переносимость метода. Все результаты будут опубликованы сразу после их оценки.
У мальчиков-участников исследования не ожидалось развития эффекта от лечения во время первого исследования, основной целью работы было доказательство, что этот метод генетической терапии вызывает выработку нового дистрофина в скелетных мышцах не только мышей и собак, но и человека, а его использование не сопровождается развитием недопустимых побочных эффектов, таких как иммунологический ответ на новый мини-дистрофин или компоненты вектора.
Для подготовки к следующему шагу были выполнены следующие эксперименты на животных, в которых исследовались условия для проведения первого клинического исследования с внутрисосудистым введением препарата мальчикам, страдающим мышечной дистрофией Дюшенна: предполагалось введение векторов в региональный кровоток нижней конечности, поскольку возможности производства векторов были ограничены, это позволяло избежать их распределения по всему телу у мальчиков, при этом предполагалось, что использование методики сможет увеличить длительность самостоятельного передвижения у пациентов.
Однократное введение ААВ вектора 6 или 8 типа, обеспечивающего синтез микро-дистрофина во временно блокированный кровоток нижней конечности мыши линии mdx, приводило к выработке микро-дистрофина в более чем 80% волокон мышц нижней конечности и значительному улучшению их функции, которое отмечалось до одного года.
Эти эксперименты повторялись на макаках, морфологическое строение тела которых было сходным со строением тела маленьких детей. Но эти животные не страдали дистрофией, поскольку могли синтезировать собственный дистрофин. Векторы окрашивались зелёным флуоресцентным белком, это искусственная метка, которая легко определяется по флуоресцирующему свечению. Результаты снова были обнадёживающими: 60 - 80% волокон в мышцах нижних конечностей содержали зелёный флуоресцирующий белок.
Получив положительные результаты исследований на мышах и обезьянах, исследователи начали подготовку к так называемым вводным исследованиям или исследованиям Ib Фазы с участием мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, начало которых запланировано на 2008 или 2009 год. Ожидается, что изучаемая методика с введением препарата в региональный кровоток, позволит мальчикам, которые участвуют в исследовании, дольше сохранять способность ходить, чем при отсутствии лечения, что значительно улучшит качество их жизни.
Перенос гена при помощи плазмид. Компания Transgune, Страсбург, в сотрудничестве с Французской ассоциацией изучения мышечной дистрофии (AFM), в 1995 году начали изучение переноса гена дистрофина при помощи плазмидных векторов. В то время работа проводилась под руководством Др. Serge Braun, который в настоящее время является Директором по научным исследованиям AFM. Эта методика использовала 79 экзонов ДНК гена дистрофина, его кДНК, и структуры, которые их контролируют, которые включались в генетический материал плазмид. Плазмиды - это небольшие структуры, состоящие из кольцевидной ДНК без белков, депротеинизированной ДНК, находящиеся внутри бактерий; основное значение плазмид — обеспечение резистентности к антибиотикам.
После успешных экспериментов с культурами мышечных клеток, на мышах и собаках, страдающих дистрофией, в конце 2000 года было начато первое клиническое исследование с участием 9 пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна и Беккера, в возрасте старше 15 лет, поскольку требовалось подписание пациентами информированного согласия. Раствор, содержащий плазмиды, вводился в одну из мышц предплечья. В мышечных волокнах, расположенных вокруг места введения, отмечалось повышение количества отдельных видов нового дистрофина полной длинны, величина которого составляла до 25%. Не было выявлено признаков развития иммунных реакций ни на плазмидные частицы, ни на вновь образованный дистрофин. Таким образом, в этом исследовании I Фазы была показана безопасность введения гена с депротеинизированной ДНК.
После этого, французские учёные начали совместную работу с группой исследователей Др. Jon Wolff компании Mirus в Мадисон/ Висконсин, который вводил сходные плазмидные конструкции в кровоток отдельных конечностей мышей, крыс, собак и обезьян под давлением. Давление создавалось кратковременным прекращением кровотока в конечности с использованием манжетки медицинского тонометра.
Клиническое исследование новых систем доставки с участием пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, будет проведено сразу после создания достаточного количества векторов, содержащих генетический материал, необходимый для синтеза дистрофина; подход с использованием плазмид, содержащих генетический материал, кодирующий синтез дистрофина полной длины, может использоваться у пациентов, для лечения которых невозможно использовать методы, основанные на пропуске экзонов.
Введение миогенных клеток. Проф. Jacques Tremblay и его коллеги в Университете Лавал в г. Квебек, Канада, продолжают работать над методиками введения фибробластов, которые называются в настоящее время трансплантацией миогенных клеток.
В клиническом исследовании с участием 9 мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, авторам удалось показать, что у 8 пациентов после введения миогенных клеток родственников, отмечалось усиление синтеза нового нормального дистрофина до 26%. Клетки вводились в небольшой участок голени, в область передней большеберцовой мышцы, с небольшим расстоянием между местами введения - 1 - 2 мм.
Ожидается, что этот способ введения клеток будет иметь несколько преимуществ, к ним относятся следующие: (1) новый дистрофин будет иметь нормальную длину, а его синтез будет находиться под контролем нормальных последовательностей генов; (2) положительный эффект может отмечаться длительно; (3) эта методика может сочетаться с фармакологическим лечением; и (4), что наиболее важно, метод может использоваться для лечения пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, более старшего возраста.
Требуется выполнение около 100 инъекций на квадратный сантиметр области мышцы, впервые методика была опробована на нескольких обезьянах, при этом не было серьёзных осложнений, после этого метод использовался для лечения пациентов, в возрасте старше 18-ти лет, страдавших мышечной дистрофией Дюшенна. Обоим пациентам выполнялось введение клеток в одну или несколько мышц под местной анестезией. Возраст одного из пациентов на момент проведения лечения составлял 26 лет. Восемнадцать месяцев спустя, при биопсии, в 34% мышечных волокон отмечалась экспрессия дистрофина донорского типа. У этого пациента трансплантация миогенных клеток позволила увеличить вдвое силу мышц, отвечающих за движения в большом пальце (эти мышцы были единственной группой, которая сохраняла способность сокращаться). Однако, поскольку пациенту было известно, что клетки вводятся в эту мышцу, не исключается влияние эффекта плацебо. Возраст второго пациента составлял 18 лет, миогенные клетки вводились только в запястье. Отмечалось небольшое повышение силы мышц через 3, но не через 6 месяцев. Через 6 месяцев у этого пациента не было выявлено мышечных волокон, содержащих дистрофин, однако определялись признаки разрушения клеток. Оба пациента без колебаний выразили согласие продолжить введение препарата в другие мышцы.
Группа исследователей Др. Tremblay с коллегами в настоящее время исследуют использование миостатина в комбинации с трансплантацией миогенных клеток, они также разрабатывают методику, повышающую иммунологическую толерантность, позволяющую избежать длительного приёма иммунодепрессантов.
Стволовые клетки
Регенерация мышц при использовании дифференцирующихся эмбриональных стволовых клеток. В процессе эмбрионального развития, предшественники скелетных мышц появляются на ранних стадиях в виде сомитов, производных мезодермы, расположенных с обеих сторон от зародышевой нервной трубки. Под влиянием факторов транскрипции (белков, контролирующих активность гена, – в частности Pax3), клетки сомитов дифференцируются (превращаются в более специализированные клетки) с образованием других структур, миотомы, на основании которого развиваются миобласты, мышечные трубочки и мышечные волокна. Если бы было возможно приготовить из сомитов, в которых нет дистрофических изменений, клетки для замены миотомов, их можно было бы размножить и использовать для восстановления пострадавших миоцитов, поскольку они содержат интактный ген дистрофина.
Проф. Rita Perlingeiro и её сотрудники, работающие в Северо-западном медицинском центре Техасского университета в Далласе, пытались выделить молодые клетки сомитов из эмбриональных стволовых клеток мыши в клеточной культуре. Они установили, что для того, чтобы получить миогенные (образующих мышцы) клетки, диффиренцирующиеся стволовые клетки нуждаются в факторе транскрипции Pax3, ген которого можно ввести в X-хромосому стволовых клеток с использованием методик генной инженерии. При использовании поточной цитометрии (метод сортировки клеток), исследователям удалось выделить миогенные клетки из эмбриональных стволовых клеток, которые дифференцировались в течение пяти дней под действием Pax3. Клетки с рецепторами PDGF-α, не вырабатывающие рецепторы Flk-1, являются группой клеток, которая дифференцируется в мышечные волокна без риска развития злокачественных опухолей.
Группа клеток, обладающих такими свойствами, была получена и использовалась для введения в область передней большеберцовой мышцы и в кровоток у мышей линии mdx. Новый дистрофин определялся в 11 - 16% всех мышечных волокон, что сопровождалось значительным повышением мышечной силы. Поскольку, по данным других исследований генетической терапии у мышей линии mdx, для развития значимого терапевтического эффекта не требуется, чтобы дистрофин содержался во всех волокнах мышечной ткани, клеточная терапия может быть эффективным методом лечения мышечной дистрофии Дюшенна.
Регенерация мышц с использованием мышечных стволовых клеток. Стволовые клетки, которые используются для лечения мышечной дистрофии Дюшенна должны обладать следующими свойствами: (1) Они должны легко выделяться из биологического материала, забранного у человека, например, из мышечной ткани; (2) клетки должны легко размножаться в лабораторных условиях, для получения достаточных количеств для лечения детей; (3) клетки должны быть пригодными для введения в них последовательностей “здоровых” генов дистрофина с использованием вирусных векторов; (4) необходимо, чтобы клетки могли использоваться для системного введения; (5) они должны сохранять способность к миграции из кровотока в мышцы; (6) они должны сохранять способность к размножению мышечной ткани, поражённой дистрофией с образованием большого количества миоцитов, содержащих дистрофин и функционирующих миосаттелиоцитов, и (7) их использование не должно сопровождаться развитием серьёзных побочных эффектов, особенно злокачественными опухолями. Два выделенных типа клеток, которые обладали такими свойствами, являлись зрелыми, а не стволовыми клетками: мезангиобласты и перициты, которые располагались снаружи от стенки сосудов, в мышечной ткани, из которой они могли быть выделены.
После получения положительных результатов экспериментов с мезоангиобластами на мышах с недостаточностью белка, α-сакрогликана, проф. Giulio Cossu со своими коллегами в Институте изучения стволовых клеток Клиники Св. Раффаэля в Милане, выделили сходные клетки, перициты, из стенки капилляров (мелких кровеносных сосудов) нормальной и поражённой дистрофией мышечной ткани человека, и использовали их для системного введения мышам линии mdx с инактивированной иммунной системой. До введения перицитов, полученных из ткани, поражённой дистрофией, они были обработаны вирусными векторами, содержащими гены, кодирующие мини-дистрофины. В обоих случаях большие количества мышечных волокон мышей линии mdx содержали новый дистрофин, и отмечалось функциональное улучшение.
В качестве следующего шага к использованию у человека, команда Др. Cossu провела лечение четырёх собак, страдающих дистрофией, с использованием системного введения стволовых клеток, выделенных из их собственной мышечной ткани (аутологичная трансплантация) в которые был введен ген человеческого микродистрофина, и шести собак с использованием клеток, полученных от здоровых собак (гетерологичная трансплантация) которые содержали нормальный дистрофин, при этом требовалась иммуносупрессия с использованием циклоспорина. Гетерологичная трансплантация была значительно более эффективна, чем аутологичная трансплантация. Одна собака, которой было выполнено введение клеток через катетер, установленный в аорту, достаточно хорошо передвигалась спустя пять месяцев после окончания пятинедельного курса лечения. Выздоровление других собак происходило медленнее.
В настоящее время повторяются исследования с использованием аутологичных стволовых клеток собак, содержащих более длинные последовательности гена дистрофина. Выполнено несколько контрольных экспериментов для оценки действия монотерапии циклоспорином, а также влияния миосаттелиоцитов на новые мышечные волокна. В ходе дальнейших длительных исследований, которые также проводились на собаках, и получения клеток с качеством, пригодным для клинического использования, будет начато клиническое исследование I Фазы с участием пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, для оценки безопасности и возможности синтеза, каких-либо видов нового дистрофина.
Регенерация мышц при использовании генномодифицированных стволовых клеток с пропуском экзонов. Исследовательская команда проф. Luis García института Généthon в Эври в пригороде Парижа и проф. Yvan Torrente в Лаборатории изучения стволовых клеток Университета Милана, совместно разрабатывали новый метод терапии мышечной дистрофии Дюшенна: они выделили стволовые клетки из мышечной ткани пациентов, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, восстановили ген дистрофина с использованием генетического метода, направленного на пропуск экзона, и вводили их мышам линии mdx, при этом отмечалась регенерация мышечных волокон со значительным снижением симптомов дистрофии.
Нижеприведённые данные являются очень упрощённым описанием очень сложной схемы исследования, для выполнения которой требуется большое количество экспериментов для контроля активности и биохимических показателей, а биологических тестов для оценки функции мышц.
Источником стволовых клеток, в основном миосаттелиоцитов, был материал, полученный при биопсии у мальчиков, страдающих мышечной дистрофией Дюшенна, у которых отмечалась делеция экзонов 49 и 50 гена дистрофина. Для своих экспериментов французско-итальянская группа исследователей использовала только около 1% клеток, содержащих на поверхности маркер - белок CD133: ранее было показано, что эти клетки могут замещать миоциты, образуя новые клетки мышечной ткани. CD133+ клетки выращивались в лабораторных условиях в клеточной культуре, после чего при помощи лентивирусного вектора в них вводились гены двух антисмысловых олигорибонуклеотидов, вызывающих пропуск экзона 51 по использованному ранее механизму (который описан на странице 5) генетического пропуска экзона 23 у мышей линии mdx.
За двадцать четыре часа до проведения эксперимента, с использованием мышей линии scid/mdx в возрасте двух месяцев, у которых не было дистрофина, и был угнетён иммунитет, животные подвергались действию стрессовых факторов виде плавания, для усиления выраженности процессов дегенерации-регенерации. Двадцать четыре мыши получили 20,000 - 40,000 генномодифицированных человеческих стволовых клеток, выделенных у мальчика, страдающего мышечной дистрофией Дюшенна; клетки вводились в виде трёх инъекций в переднюю большеберцовую мышцу. Шести другим мышам было выполнено системное введение 500,000 таких стволовых клеток в бедренную артерию нижней конечности. На 21 и 45 день после местного и системного введения выполнялись многочисленные оценки этой сложной генной терапии.
Результаты указывали на лучшую регенерацию мышц, дистрофин вырабатывался в большем, чем ожидалось, количестве в регенерировавших волокнах без аминокислотных последовательностей, которые определяются экзонами 49, 50 и 51, отмечено также улучшение морфологической структуры мышц, и существенное восстановление мышечной функции.
Эта методика основана на прямой индукции пропуска экзонов, как было показано на странице 5, она использует ту же систему U-7, что открывает путь для разработки новой стратегии для лечения мышечной дистрофии Дюшенна. Однако, для того, чтобы планировать проведение клинических исследований, необходимо установить точный механизм пропуска экзонов с использованием лентивирусных векторов, поскольку эти вирусы могут приводить к развитию случайных изменений генетического материала миоцитов, и, возможно, могут разрушать другие гены, или даже быть причиной развития опухолей.