Научные основы биотестирования с использованием инфузорий 03. 00. 23 биотехнология

Вид материала

Автореферат

Содержание Общая характеристика работы Цель и задачи исследования. Научная новизна. Практическая ценность. Апробация работы. Colpoda steinii Colpoda steinii Объем и структура работы. Содержание работы Тест-реакция и тест-критерий Colpoda steinii Colpoda steinii Paramecium caudatum Paramecium caudatum Воздействия на тест-систему Colpoda steinii Colpoda steinii Colpoda steinii Paramecium caudatum Colpoda steinii ... Полное содержание

Подобный материал:

• Научно-образовательный комплекс специальности 050701 «Биотехнология» опорные конспекты, 386.71kb.
• Научно-образовательный комплекс по специальности 6N0701 «Биотехнология» учебно-методический, 704kb.
• Общая биология и микробиология, 206.6kb.
• Научно-образовательный комплекс по специальности 050701 «Биотехнология» учебно-методический, 837.91kb.
• Комплекс дисциплины «Молекулярная генетика» образовательных профессиональных программ, 309.22kb.
• Научные основы технологий хлеба с использованием ржаной муки на заквасках с улучшенными, 1053.55kb.
• Рабочая программа по дисциплине «Основы научных и инженерных исследований» Направление, 83.71kb.
• Примерная программа наименование дисциплины «Вирусология и биотехнология» Рекомендуется, 844.41kb.
• Директор Инженерной Академии Док вет наук, проф. Е. Б. Никитин 2009 г. Автор: преподаватель, 952.2kb.
• Рабочая программа по дисциплине сд. 03 «Основы электрохимической технологии» подготовка, 399.82kb.

На правах рукописи


ВИНОХОДОВ Дмитрий Олегович


НАУЧНЫЕ ОСНОВЫ

БИОТЕСТИРОВАНИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИНФУЗОРИЙ


03.00.23 – биотехнология


АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук


Санкт-Петербург – 2007

Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Санкт-Петербургском Государственном технологическом институте (техническом университете)

Научный консультант: доктор химических наук, профессор

Гинак Анатолий Иосифович

Официальные оппоненты:	доктор биологических наук Михайлова Наталья Павловна
	доктор биологических наук Сухинин Александр Александрович
	доктор химических наук Орлов Антон Иосифович

Ведущая организация: Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия.

Защита диссертации состоится 19 октября 2007 г. в 13-00 в аудитории №61 на заседании Диссертационного Совета Д 212.230.04 при Санкт-Пе­тербургском Государственном технологическом институте (техни­чес­ком университете).


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петер­бург­ского Государственного технологического института (технического уни­верситета).

Замечания и отзывы по данной работе в 1 экземпляре, заверенном печатью, просим направлять по адресу:

190013, С.-Петербург, Московский пр., 26, Санкт-Петербургский Го­сударственный технологический институт (технический университет), Ученый Совет.

Автореферат разослан 3 сентября 2007 г.


Ученый секретарь

Диссертационного Совета

Д 212.230.04, к. т. н., доцент Т. Б. Лисицкая

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ


Актуальность проблемы. Одним из важных направлений прикладной биотехнологии является разработка эффективных биологических методов оценки состояния разнообразных объектов внешней среды, загрязнение которых токсичными веществами в настоящее время приобрело комплексный характер. Даже если бы было возможно определить содержание всех ксенобиотиков в объекте ис­следования, такая информация была бы недостаточна для каких-либо прогнозов, так как токсикометрические параметры установле­ны лишь для незначительной части этих веществ. Кроме того, результат комби­нированного действия двух и более токсич­ных веществ, имеющихся в исследуемом образце в небольших количествах, предсказать достаточно сложно. Соединения нетоксичные при изолированном действии могут вызывать значительный патологи­ческий эффект при комбинированном влиянии. Поэтому для оценки токсичности природных вод, промышленных сбросов, почвы, кормов и прочих объектов окружающей среды, а также новых химических веществ и внутренних сред организма человека и животных используют тесты на различных живых организмах. Предоставляя мало информации о природе поллютанта, биотестирование дает возмож­ность с большой степенью достоверности определить степень интегральной токсичности объекта исследования.

В числе организмов, на которых проводят биотестирование, присутствуют представители подцарства простейших. История применения Protozoa в качестве тест-организмов насчитывает не одно десятилетие. В то же время, развитие иных методов токсикологического анализа, таких как химические, физико-химические, иммунологические, а также использование биологической оценки на организмах из других систематических групп не снижают актуальности биотестов на простейших. Об этом говорит значительное число методических разработок, рекомендаций и публикаций, постоянно появляющихся в специализированных изданиях, а также их широкое использование на практике. Эти методы обладают высокой чувствительностью, экспрессностью, надежностью, универсальностью и малой себестоимостью. Они просты в проведении, поддаются инструментализации и автоматизации, а их результаты легко интерпретируемы. В отличие от химических и физико-химических методов анализа, биотестирование на инфузориях позволяет прогнозировать интегральное воздействие изучаемого объекта на живые организмы, поскольку реакция биологической тест-системы зависит не только от отдельных токсичных соединений, содержащихся в объекте исследования, но и от их взаимодействия между собой, а также от присутствия веществ, обладающих ярко выраженным влиянием на токсичность указанных соединений. А по сравнению с биотестами на высших животных оно обладает значительными преимуществами в экономической, методической и этической сферах.

Хотя в рассматриваемой области накоплен богатый фактический материал, в биологической науке до сих пор отсутствует единая концепция, описывающая биотестирование на инфузориях. Определения основных используемых терминов не получили точных и исчерпывающих формулировок, недостаточно изучена культура инфузорий, как система, по реакции которой производится оценка объекта внешней cреды, не выявлены закономерности ее реакции на неблагоприятные воздействия, не сформулированы принципы выбора тест-организмов. Как следствие, отсутствуют единые методы подготовки проб и культуры инфузорий как тест-системы к проведению анализа.

Недостаточность теоретического описания биотестирования на инфузориях влечет за собой разнообразные проблемы в практическом воплощении конкретных методик. Тест-организмы зачастую подбираются без учета их биологических особенностей, инфузории культивируют на нестандартных средах и в произвольных условиях, во многих методиках процесс подготовки тест-системы к анализу отсутствует как таковой, уровень чувствительности наблюдаемых тест-реакций далеко не всегда соответствует поставленным задачам, используемые для оценки степени проявления тест-реакции критерии в ряде случаев имеют малую информативность по сравнению с альтернативными. Все это приводит к огрублению результатов, неверной их интерпретации, снижению объективности выводов, а зачастую и к дискредитации биотестирования, как метода научного исследования.

По этим причинам в настоящее время особую важность приобретает вопрос о комплексном подходе к биотестированию. В первую очередь необходим глубокий теоретический анализ этой группы методов. Создание единой концепции оценки свойств объектов окружающей среды по реакции культуры инфузорий должно способствовать развитию, стандартизации и унификации уже разработанных методов, а также созданию новых, более совершенных.

Таким образом, можно заключить, что исследования в указанной области являются актуальными и имеют важное теоретическое и прикладное значение.

Цель и задачи исследования. C учетом вышеизложенного в работе ставилась цель: на основе теоретического осмысления и критического анализа литературных данных и результатов собственных исследований сформировать научные основы биотестирования на инфузориях как метода научного исследования.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1 Обобщить и систематизировать накопленный опыт в области оценки свойств различных объектов по реакции организмов группы Protozoa;

2 Сформулировать определения основных терминов, используемых в биотестировании;

3 Сформировать научное представление о культуре инфузорий как диагностической тест-системе и выявить основные закономерности процесса ее взаимодействия с объектами исследования;

4 Разработать принципы выбора тест-организмов и методы подготовки культуры инфузорий к проведению биотеста применительно к конкретным задачам биотестирования различных объектов окружающей среды;

5 Сформировать комплекс мер для стандартизации процесса биотестирования и управления основными параметрами тест-систем;

6 Разработать эффективный, экспрессный, недорогой биотест с использованием инфузорий, отвечающий сформулированным требованиям, опробировать его в производственных условиях и внедрить в практику.

Научная новизна. Обобщены и систематизированы исследования в области изучения реакций инфузорий на экстремальные химические воздействия, а также по их использованию в биотестировании.

Разработана система терминов, используемых в области биотестирования. На основе комплексного представления о процессе биотестирования составлена его схема и рассмотрены основные факторы, влияющие на него.

Проведено систематическое исследование процесса взаимодействия токсичных веществ и их смесей с культурой инфузорий на модели тест-реакций гибели и хемотаксиса. Выведены универсальные зависимости, описывающие этот процесс, получены параметры, численно характеризующие токсические свойства химических веществ и их смесей, а также состояние тест-системы.

Показаны пути для оптимизации биотестирования и сформирован комплекс мер для его стандартизации и для управления основными характеристиками культуры инфузорий, как тест-системы.

Предложены принципы выбора тест-организмов. В соответствии с ними выделен и предложен для научно-исследовательских работ и для практического использования штамм инфузории Colpoda steinii. Разработан и внедрен препарат для исcледования кормов в сельском хозяйстве на основе данного штамма. Разработана технология приготовления и налажено производство препарата.

Все это позволило создать целостную концепцию биотестирования как метода научного исследования.

Практическая ценность. Выделен, всесторонне охарактеризован и депонирован в коллекции микроорганизмов НИИ Особо чистых биопре­паратов производственный штамм инфузории Colpoda steinii П-1.

Разработана и утверждена на уровне Министерства сельского хозяйства и продовольствия РФ, а также на уровне Министерства аграрной политики Украины научно-техническая документация на препарат "Культура Colpoda steinii сухая для эколого-токсикологических исследований": технические условия и наставление по применению.

Разработанный метод оценки токсичности зернопродуктов включен в Межгосударственный стандарт ГОСТ 13496.7-97 "Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма: Методы определения токсичности", Государственный стандарт Украины ДСТУ 3570-97 "Зерно фуражне, продукти його переробки, комбiкорми: Методи визначення токсичностi" и в Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ Р 52337-2005 "Корма, комбикорма, комбикормовое сырье: Методы определения общей токсичности" в качестве экспресс-метода.

Совместно с редакцией журнала “Архив ветеринарных наук”, Всероссийским обществом протозоологов при РАН, Санкт-Петербургским государственным университетом и Международной академией информатизации организована и проведена Международная заочная научно-практическая конференция "Инфузории в биотестировании", Санкт-Петербург, 1998 г. В конференции приняли участие свыше ста специалистов из семи стран мира.

Результаты исследований и теоретические обобщения, приведенные в диссертации, могут быть использованы в учебном процессе по учебным курсам, связанным с биотехнологией, экологией, зоологией беспозвоночных, протозоологией, производством сельскохозяйственных кормопродуктов и санитарией кормов.

Апробация работы. Материалы работы доложены на следующих съездах, конференциях и заседаниях:

- заседания Ветеринарного фармакологического совета при Главном управлении ветеринарии Министерства сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерации, Москва, в 1992 и 1999 гг.;

- Всероссийская конференция по совершенствованию мер про­филактики и борьбы с микотоксикозами птиц, Ломоносов, Все­российский научно-исследовательский ветеринарный институт пти­цеводства, 1992 г.;

- Международная конференция "Биотехнология-94", Санкт-Петер­бург, 1994 г.;

- заседание Всероссийского общества протозоологов, Санкт-Петербург, 1998 г.;

- Международная заочная научно-практическая конференция "Инфузории в биотестировании", Санкт-Петербург, 1998 г.;

- заседание Международной молодежной научной школы "Биоиндикация-98", Петрозаводск, 1998 г.;

- I съезд токсикологов России, Москва, 1998 г.;

- Заочная научно-практическая конференция "Биотехнология в Федеральной целевой программе «Интеграция»", Санкт-Петербург, 1999 г.;

- семинар "Контроль качества кормов" в Ленинградской областной ветеринарной лаборатории, Санкт-Петербург, 2000 г.;

- III научно-техническая конференция аспирантов СПбГТИ(ТУ), Санкт-Петербург, 2000 г.;

- Всероссийская научная конференция, посвященная 45-летию науч-но-исследовательской лаборатории питания и водоснабжения Военно-медицинской академии, Санкт-Петербург, 2001 г.;

- Международная конференция молодых ученых "Химия и биотехно-логия биологически активных веществ, пищеваых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии", Тверь, 2002 г.;

- Межвузовская конференция "Микотоксины в экосистемах Санкт-Петербурга и Ленинградской области", Санкт-Петербург, 2002 г.;

- Всероссийская научно-практическая конференция "Гигиенические проблемы водоснабжения населения и войск", Санкт-Петербург, 2003 г.;

- VII Вишняковские чтения. Стратегия и тактика вузовской науки в регионе, Бокситогорск, 2004 г.;

- Всероссийская научно-техническая конференция "Успехи в специ-альной химии и химической технологии", Москва, 2005 г.;

- IV съезд Общества биотехнологов России имени Ю.А. Овчинникова, Пущино, 2006 г.

По пезультатам работы подготовлена и утверждена следующая научно-техническая документация:

- Временное наставление к экспресс-методу определения токсичности кормов, кормовых добавок, воды и органов павших и убитых животных с использованием культуры Colpoda steinii. Утверждено Государственным департаментом ветеринарии МСХиП РФ.

- Настанова по застосуванню культури Colpoda steinii (колпода) сухоi для еколого-токсикологiчних дослiджень об`ектiв зовнiшнього середовища тварин та птицi. Утверждена Гос. департаментом ветеринарной медицины МАП Украины.

- Культура Colpoda steinii сухая для эколого-токсикологических исследований: Технические условия. ТУ 9388-001-885-95. Утверждены Государственным департаментом ветеринарии МСХиП РФ.

- Культура Colpoda steinii суха для еколого-токсикологiчних дослiджень об`ектiв зовнiшнього середовища тварин та птицi: Технiчнi умови. ТУ У 46.15.243.-97. Утверждены Гос. департаментом ветеринарной медицины МСХиП Украины.

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в тридцати девяти работах, в том числе, монографии и четырнадцати статьях. По материалам работы получено четыре патента РФ.

На основе оригинального метода биотестирования разработано три государственных стандарта: ГОСТ 13496.7-97, ДСТУ 3570-97 и ГОСТ Р 52337-2005.

Объем и структура работы. Материалы диссертации изложены на 262 страницах машино­писного текста и включают в себя введение, обзор литературы, ма­териалы и методы исследований, результаты исследований, обсуж­дение, выводы и практические предложения. Материал иллюстри­рован 20 таблицами и 41 рисунком. Список основной исполь­зованной литературы содержит 319 наименование работ отечест­венных и зарубежных авторов.


СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Понятия и определения

Существенная часть нашей работы состоит в обсуждении вопросов терминологии, используемой в области биотестирования. Мы придаем этой проблеме особое значение, поскольку любая область науки, завершающая стадию формирования, должна получить связную и внутренне непротиворечивую систему понятий и определений.

Биотестирование как метод исследования используют специалисты различных областей науки: в экологической токсикологии для анализа вод и почв, в гуманитарной и ветеринарной медицине для исследования свойств внутренних сред высших организмов, в сельском хозяйстве для экспресс-тестирования кормов на общую токсичность, в химии для первичной оценки свойств новых веществ и так далее. При этом само понятие "биотестирование" зачастую истолковывают по-разному, приспосабливая этот термин к тому или иному узкому кругу задач и объектов, тем самым, обедняя его содержание и даже вкладывая в него различный смысл. Еще сложнее обстоит дело с производными терминами в этой области знания - они не только не имеют устоявшихся определений, но зачастую даже не являются общепринятыми. Комплексное рассмотрение биологических тестов позволило нам вычленить их общие черты и составить универсальную формулировку определения, в котором преодолены проблемы узости сферы использования биотестирования и адекватности описания биологической основы, на которой проводится тест. Итак, биотестирование - это оценка свойств изучаемого объекта по его воздействию на биоло­гическую тест-систему (далее - тест-систему) в стандартных условиях. Данная формулировка включает в сферу рассмотрения любые методы, в которых для изучения какого-либо явления используются биологические объекты. Это позволяет анализировать и сопоставлять биологические тесты, применяемые в разных областях, с единой точки зрения.

Введение в данное определение понятия “тест-система” не является случайным. Как правило, для обозначения живого элемента, на котором производится постановка биологического теста используют иные понятия, такие как “тест-организм” и “тест-объект”. Между тем в общем случае мы имеем дело не просто с отдельными организмами, а с биологической системой, имеющей внутреннюю структуру, определяемую связями между ее биологическими элементами и средой, в которой они находятся. Эта система может состоять из группы организмов одного вида, сооб­щества нескольких видов, целой экосистемы, или же может включать отдельные органы и ткани орга­низма, культуру клеток, изолированные органеллы, фермен­ты и т. д. Эти биологические элементы распределены в среде и за­ключены в определенном объеме. Именно тест-система, а не просто отдельные живые организмы, является центральным элементом процесса биотестирования, и уяснение сути этого термина дает ключ к научному пониманию процесса биотестирования, как такового, а следовательно, и к целенаправленному управлению им. Тест-система - это пространственно ограниченная совокупность чувствительных биологических элементов и среды, в которой они находятся.

Из этой формулировки следует, что понятие “тест-объект” является составной частью понятия “тест-система” и органично включается в нее. Мы определяем этот термин следующим образом. Тест-объекты - это чувствительные элементы, входящие в тест-систему. Они могут находиться в одном или различных физио­ло­гических состояниях, их пространственное распределение может быть равномерным, или же они могут концентрироваться в каких-либо областях (на дне сосуда, на его стенках, на твердом носителе, у скопле­ний пищи и т. д.).

Под термином же "тест-организм", который также достаточно часто используют специалисты, мы подразумеваем систематичес­кое наимено­вание тест-объекта вплоть до вида, штамма или клона.

Принцип, лежащий в основе биотестирования как процесса преобразования материального потока в информационный, мы представляем в виде схемы, показанной на рис. 1.



Рисунок 1 – Принципиальная схема биотестирования


Процесс постановки биологического теста начинается с того, что исследуемый образец переводят в состояние, удобное для проведения эксперимента, т. е. получают действующую форму, после чего осуществляют ее контакт с тест-системой. На тест-систему действует три группы факторов. Первая группа объединяет факторы исследуемого образца. К ним, например, относятся токсичные вещества, которые содержатся в исследуемом объекте. Воздействие факторов этой группы и подлежит оценке в процессе биотестирования, то есть является целевым. Вторая группа факторов объединяет различные посторонние воздействия и “шумовые” помехи. Это могут быть измене­ния темпера­туры, освещения и прочих условий, которые сказываются на состоянии тест-системы. Эти факторы не всегда удается учитывать и устранять, тем не менее необходимо стремиться к минимизации их воздействия. К третьей группе факторов относятся разнообразные воздействия, которые наносят на тест-систему намеренно с целью регулирования ее чувствительности. Эти воздействия играют роль физиологической нагрузки и их применение может повысить чувствительность тест-систем на один-два порядка.

В результате действия всех этих факторов тест-объекты и вся тест-система в целом претерпевают некоторую дефор­мацию, что проявляется в изменении состояния тест-системы и появлении ряда реакций на различных уровнях ее функцио­нирования. Эти реакции различают­ся по чувстви­тельности, скорости проявления, легкости наблюде­ния и другим параметрам. Одну или несколько из этих реакций вы­бирают в качестве тест-реакции. Этот термин мы определяем следующим образом. Тест-реакция - это одна из закономерно возникающих ответных реакций тест-системы на воздействие комплекса внешних факторов, выбранная для анализа состояния этой тест-системы.

По степени проявления тест-реакции судят о свойствах исследу­емого образ­ца. Определение степени проявления тест-реакции производится по некоторому крите­рию. При этом одной реакции может соответство­вать несколько различных критериев. Например, исследуя тест-реакцию гибели организмов, можно регистрировать либо количество погибших особей за оп­ределенный проме­жуток времени, либо время, за ко­торое погибает определенная часть задействованных в опыте животных. Тест-критерий - это показатель, на основании которого прово­дят оценку изменения состояния тест-системы, находящейся под воздействием комплекса внешних факторов.

Таким образом, основной результат биотестирования, оценка свойств исследуемого объекта, зависит от ряда факторов: способа донесения действующего начала до тест-системы, характе­ристик самой тест-системы (вида тест-организмов, из которых со­стоит тест-система, их коли­чества, состояния в момент тестирова­ния и состава среды, в которой они находятся), комплекса посто­ронних воздействий, выбранной тест-реакции и способа ее наблюде­ния, тест-критерия и, наконец, от квалификации исследователя. Проведенные исследования позволили проанализировать эти факторы, а также составить рекомендации по стандартизации биологических тестов и целенаправленному управлению ими. Рассмотрим эти вопросы подробнее.

Тест-система

Для корректной постановки и адекватной интерпретации результатов биологического теста необходимо создавать тест-системы определенного состава и перед использованием приводить их в строго нормированное начальное состояние.

Говоря о составе тест-системы, в первую очередь необходимо упомянуть ее небиологическую составляющую - среду, в которой распределены тест-объекты. Ее химический состав оказывает заметное влияние на чувствительность организмов к внешним воздействиям. Одни вещества, такие как белки, антиоксиданты, гумины и некоторые микроэлементы могут оказывать протекторное действие на клетки в процессе интоксикации. Другие, например, поверхностно-активные вещества и некоторые органические растворители даже в незначительных концентрациях, напротив, способны многократно усиливать воздействие токсичных веществ на живые объекты. По этой причине мы считаем, что тест-системы должны включать лишь те среды, которые готовят на основе растворов с известным и постоянным химическим составом. В наших экспериментах хорошо зарекомендовал себя минеральный раствор Лозина-Лозинского, он пригоден для работы со всеми инфузориями, которые были использованы в наших опытах.

Правильный подбор тест-организма является не менее важным, чем использование стандартной питательной среды. В наших экспериментах мы использовали инфузорий четырех видов: Colpoda steinii, Paramecium caudatum, Tetrahymena pyriformis и Stylonychia mytilus. Существенные морфологические и физиологические различия этих организмов обуславливают разнообразие сфер их использования в биологической практике. И хотя до настоящего времени не сделано обоснованного выбора универсального тест-объекта, идеально пригодного для любых методик биотестирования, более того, существует мнение, что таковой не может быть найден в принципе, анализ индивидуальных особенностей перечисленных инфузорий, а также сравнение их чувствительности к ряду токсичных веществ позволили нам сформулировать общие требования, которым должны отвечать инфузории, рассматриваемые в качестве кандидатов на роль тест-организмов. Они таковы: идентификация вплоть до вида и штамма (клона); возможность обеспечения постоянства генетических и физиологических характеристик штамма (клона); простота культивирования; высокая чувствительность к основным поллютантам; наличие легко наблюдаемых тест-реакций.

При подборе вида инфузории для каких-либо специфических биологических тестов могут быть составлены и другие дополнительные требования, но указанные выше сохраняют свое значение.

Помимо вопроса о составе тест-системы, существенное значение имеет проблема нормирования ее начального состояния, которое зависит от физиологического состояния тест-объектов, входящих в нее, то есть от фазы роста культуры и стадии жизненного цикла каждой отдельной инфузории. Эти два параметра должны подвергаться стандартизации. В наших экспериментах было показано, что чувствительность культуры Colpoda steinii, находящейся на постцистной стадии развития, к мертиолату почти вдвое выше, чем в фазе экспоненциального роста. В то же время, по данным ряда авторов, чувствительность инфузорий Tetrahymena pyriformis, не имеющих в жизненном цикле стадии цисты покоя, в экспоненциальной фазе роста выше, чем в стационарной. Таким образом, можно заключить, что оптимальным для постановки биологического теста состоянием культуры инфузорий, с точки зрения чувствительности ответной реакции, является постцистная стадия жизненного цикла у цистобразующих видов и фаза экспоненциального роста у инфузорий, которые не имеют стадии цисты покоя.

Нормирование тест-системы по стадии жизненного цикла, входящих в ее состав инфузорий, может быть осуществлено с использованием разнообразных методов синхронизации. Как правило, применяют синхронизацию с помощью серии температурных шоков. Этот метод имеет высокую эффективность, но его практическое использование затруднено вследствие трудоемкости и значительных временных затрат на его проведение. Поэтому, хотя в ряде специальных биологических тестов шоковую синхронизацию продолжают применять, при проведении масштабного биотестирования от нее рекомендуют воздерживаться. В своих исследованиях мы использовали иной метод синхронизации. Он относится к группе механических или селективных методов и заключается в том, что заранее подготовленные цисты покоя инфузории Colpoda steinii подвергают индуцированному эксцистированию. Данный способ достаточно эффективен и весьма прост в использовании, его пригодность в практическом применении служит весомым аргументом при выборе тест-организма для постановки биологического теста.

В результате мы получали синхронизированную культуру инфузорий, но оценку степени ее синхронизированности проводили не по общепринятому методу, который заключается в наблюдении за процессом единовременного деления клеток культуры, а исходя из той физиологической характеристики, которая интересует нас в первую очередь - чувствительности клеток к токсичным веществам. Полученный нами индекс синхронизированности показывает, во сколько раз время гибели 100% клеток инфузорий превышает время гибели 50% клеток, и может служить характеристикой генетической и физиологической однородности тест-системы. Его вид будет обсуждаться ниже, сейчас лишь укажем, что на постцистной стадии жизненного цикла культуры Colpoda steinii его величина составляла 1,07. Это означает, что время, в течение которого погибают все клетки в культуре, превышает время гибели половины из них на 7%. Столь низкую величину индекса синхронизированности можно объяснить тем, что мы использовали специально выделенный штамм данного вида инфузории, а также тем, что макронуклеус Colpoda stei­nii на постцистной стадии жизненного цикла тетраплоиден, как и у только что разделившейся клетки. Индекс синхронизированности культуры инфузорий в экспоненциальной фазе роста составлял 1,24. То есть однородность такой культуры была значительно ниже, чем в синхронизированной культуре на постцистной стадии жизненного цикла. Соответственно, и ответная реакция тест-системы, в состав которой входят инфузории, взятые из культуры, находящейся в экспоненциальной фазе роста, на воздействие токсичного вещества оказывается растянутой во времени, менее однозначной и труднее интерпретируемой.

Таким образом, проблема нормирования первоначального состояния тест-систем, используемых в биотестировании, может быть решена с помощью регулирования двух параметров - фазы роста культуры и стадии жизненного цикла клеток, входящих в ее состав.