Geum.ru

«Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им акад. И. П. Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Вид материалаАвтореферат

Содержание


Содержание работы
Подобный материал:
1   2   3

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ


Материалы и методы исследования

На первом этапе исследования нами было проведено обследование 406 посетителей молодежных консультаций Санкт-Петербурга, в котором приняли участие 281 женщина и 125 мужчин в возрасте 15–35 лет. Все пациенты ответили на вопросы специально разработанной анкеты. Оценка факторов риска развития ИППП была произведена у 406 человек. Всем пациентам был проведен осмотр и взятие биологического материала для исследования с целью выявления Mycoplasma genitalium. Клиническое обследование проводилось в молодежных консультациях Красногвардейского района (заведующая МК Т.Е. Трубецкая), молодежной консультации «Охта» Красногвардейского района (заведующая МК С.Ю. Синча), в молодежном консультативно-диагностическом центре Петроградского района (заведующая центром М.Ф. Ипполитова).

На втором этапе исследования нами было обследовано 218 пациентов (113 женщин и 105 мужчин) Ленинградского областного кожно-венерологического диспансера с установленным диагнозом уретрита у мужчин и цервицита у женщин. На третьем этапе исследования для оценки эффективности антибактериальной терапии уретрита и цервицита, ассоциированных с Mycoplasma genitalium джозамицином (Астеллас-фарма,Япония) нами было проведено лечение 33 пациентов (12 мужчин и 21 женщины) Ленинградского областного кожно-венерологического диспансера.

Микроскопические исследования и молекулярно-биологические исследования были выполнены в лаборатории микробиологии Института акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН (зав. лабораторией д.м.н., профессор А.М. Савичева) совместно со старшим научным сотрудником лаборатории микробиологии ГУ НИИ АГ им. Д.О. Отта РАМН канд. биол. наук Е.В. Шипицыной.

Всем пациентам, включенным в исследование, было предложено заполнить анкету с вопросами, касающимися пола, возраста, социально-материального положения, эпидемиологического анамнеза, полового поведения, курения, употребления алкоголя и наркотиков, а также знаний относительно профилактики ИППП/ВИЧ. Материалы анкеты использовались для выявления предрасполагающих условий риска развития инфекций, передаваемых половым путем. Ответившим на вопросы проводились лабораторные исследования с целью обнаружения C. trachomatis, N. gonorrhoeae, T. vaginalis и M. genitalium. У женщин материалами для лабораторных исследований служили соскобы эпителия цервикального канала, отделяемое влагалища и первая порция свободно выпущенной мочи для исследования методом ПЦР. Для микроскопического исследования использовали соскобы эпителия мочеиспускательного канала, цервикального канала и отделяемое влагалища. У мужчин материалом для лабораторных исследований были соскобы эпителия мочеиспускательного канала и первая порция свободно выпущенной мочи, как для микроскопического исследования, так и для исследования методом ПЦР.

Микробиологические исследования включали микроскопический и молекулярно-биологический методы.

Для исследования материалов, полученных из уретры, влагалища, цервикального канала у женщин и из уретры у мужчин, использовали метод окрашивания препаратов 1% спиртовым раствором метиленового синего (по Леффлеру). При микроскопическом исследовании влагалищных мазков, окрашенных метиленовым синим, одновременно с поиском трихомонад, дрожжеподобных грибов оценивали клеточный состав (лейкоциты, клетки эпителия), фагоцитарную активность полиморфноядерных лейкоцитов в препарате, характер (морфотип) и количество микроорганизмов.

При проведении прямого микроскопического исследования окрашенных препаратов из цервикального канала выявлялись и анализировались следующие морфологические объекты: цервикальная слизь, цилиндрический эпителий цервикального канала, полиморфноядерные лейкоциты, внутриклеточные диплококки, другие микроорганизмы. Диагноз цервицита устанавливался при наличии объективных признаков цервицита (гиперемия, обильные выделения) и концентрации полиморфноядерных лейкоцитов более 10-20 в поле зрения при увеличении микроскопа ´1000 раз при просмотре не менее пяти полей зрения. При проведении микроскопического исследования окрашенного метиленовым синим препарата, полученного из уретры у мужчин, выявляли следующие морфологические объекты: слизь, цилиндрический/кубовидный эпителий уретры, полиморфноядерные лейкоциты, внутриклеточные диплококки, другие микроорганизмы. Диагноз уретрита у мужчин подтверждался нахождением более 4 лейкоцитов в поле зрения при увеличении микроскопа ´1000 (при просмотре не менее пяти полей зрения).

Сбор образцов, выделение ДНК, анализ и интерпретация результатов проводились согласно инструкциям фирм-производителей. Цервикальные, вагинальные и уретральные пробы для исследования тест-системами ПЦР-эф-Дт, ПЦР-рв-Дт и ПЦР-эф-Л собирали с помощью дакроновых тампонов и помещали в 200 мкл реагента ДНК-экспресс (фирма «ЛИТЕХ», Россия). Цервикальные, вагинальные и уретральные пробы для исследования тест-системами ПЦР-эф-ИЭ, ПЦР-рв-ИЭ и референс ПЦР собирали также с помощью дакроновых тампонов и помещали в 1 мл 2-SP среды (сахарозо-фосфатный буфер). Образцы мочи собирались в контейнеры объемом 25 мл и затем транспортировались при температуре окружающей среды в течение 1-4 часов в лабораторию микробиологии ГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН. После тщательного перемешивания на вортексе из каждого вагинального и уретрального образца были отобраны аликвоты объемом 200 мкл, из каждого образца мочи – аликвоты объемом 1 мл, которые в замороженном виде пересылались в Лабораторию Микоплазм Государственного Серологического института (Копенгаген, Дания) для анализа с помощью референс ПЦР. Таким же образом исследовали вагинальные и уретральные пробы, для которых были получены дискордантные результаты. Для оценки пределов детекции и аналитической чувствительности исследуемых тест-систем использовалась контрольная зашифрованная панель включающая 58 проб ДНК, выделенной из 6 штаммов M. genitalium (G37, M30, M2288, M2300, M2321 и M2341), и 18 проб ДНК, выделенной из 14 остальных видов микоплазм.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием методов параметрической и непараметрической статистики. Методы описательной (дескpиптивной) статистики включали в себя оценку сpеднего аpифметического (M), сpедней ошибки сpеднего значения (m) - для признаков, имеющих непрерывное распределение; а также частоты встречаемости признаков с дискретными значениями.

Для оценки межгрупповых различий значений признаков, имеющих непрерывное распределение, применяли t-критерий Стьюдента, а при сравнении частотных величин - c2-критерий Пирсона, критерий Мак-Немара и точный метод Фишеpа (ТМФ). Анализ зависимости между признаками, а также соответствия между результатами отдельных методов лабораторной диагностики заболеваний, вызванных M. genitalium, проводили с помощью r-критерия Пирсона, rs-критерия Спиpмена и c2-критерия Пирсона.

Статистическая обpаботка матеpиала выполнялась с использованием стандаpтного пакета пpогpамм пpикладного статистического анализа (Statistica for Windows v. 6.0).

Кpитический уpовень достовеpности нулевой статистической гипотезы (об отсутствии значимых pазличий или фактоpных влияний) пpинимали pавным 0,05.


Результаты исследований и их обсуждение

Распространенность M. genitalium среди посетителей молодежных центров составила 9,5% (21 из 281) среди женщин и 9,6% (12 из 125) среди мужчин.

При проведении изучения социально-бытовых особенностей поведения и оценке уровня знаний о передаче ИППП/ВИЧ среди пациентов с урогенитальной патологией, ассоциированной с Mycoplasma genitalium у мужчин и женщин, нами было установлено, что уровень знаний является низким. Так, обращает на себя внимание тот факт, что только одна четверть молодых людей знали о том, что даже при отрицательном результате анализа на ВИЧ человек может передавать вирус другим людям, и только 72 (56,6%) пациента были информированы о том, что масла и вазелин нельзя использовать для смазки презервативов. Стоит также обратить внимание на то, что 24,8% от общего числа пациентов заявили, что не знают ответа на этот вопрос. Тревожным является тот момент, что отмечается увеличение более рискованного сексуального поведения, о чем свидетельствует достаточно большое количество пациентов, согласных с утверждением, что можно не заботиться о безопасном сексе, если партнер говорит, что не является ВИЧ-инфицированным (11,2%); пациентов, согласных подвергнуться риску заражения ИППП/ВИЧ ради получения удовольствия от секса - 1,8%; пациентов, не согласных с тем, что использование общественных туалетов повышает риск заражения ИППП/ВИЧ - 40,5%; и пациентов, сомневающихся в отказе от полового контакта в состоянии алкогольного или наркотического опьянения - 31,4%. Большая часть мужчин (91,7%) в течение года имела от 2 до 10 половых партнерш, только у 3 (5,5%) из 55 женщин имелся единственный половой партнер. Обобщая результаты опроса, нами было установлено, что пациенты с уретритом и цервицитом, ассоциированным с M. genitalium, находятся в возрастной группе от 16 до 20 лет, количество половых партнеров у них составляет от 4 до 10 за год, возраст начала половой жизни у большинства пациентов приходился на период до 16 лет.

Для изучения особенностей клинической картины уретрита и цервицита, ассоциированных с M. genitalium, нами были обследованы пациенты Ленинградского областного кожно-венерологического диспансера с установленным диагнозом – уретрит у мужчин и цервицит у женщин. У всех мужчин диагноз уретрита был установлен на основании клинических и лабораторных (количество ПМЯЛ >4 в поле зрения микроскопа при микроскопическом исследовании окрашенных препаратов) данных.

Спектр возбудителей, выделенных из клинических образцов, полученных от 125 мужчин, представлен на рисунке 1.

В 60,0% случаев из отделяемого уретры была выделена факультативно- анаэробная микрофлора (стафилококки, стрептококки, E. coli и др.), в 40% - возбудители ИППП. Наиболее частыми возбудителями уретрита среди возбудителей ИППП оказались C. trachomatis и M. genitalium, доля которых составила 34,0% и 24,0% , соответственно.




Рис. 1. Удельный вес выявленных микроорганизмов у мужчин с уретритом.

У всех женщин, участвовавших в исследовании, диагноз цервицита был установлен на основании данных клинического обследования (наличие слизистых или слизисто-гнойных выделений из цервикального канала) и микроскопического исследования окрашенных препаратов (ПМЯЛ > 10 в поле зрения микроскопа при ´1000).

Структура спектра выделенных возбудителей при обследовании 281 женщины с наличием цервицита представлена на рисунке 2. Среди возбудителей ИППП доля C.trachomatis составила 32,1%, M. genitalium – 19,8%.




Рис. 2. Удельный вес выявленных микроорганизмов у женщин с цервицитом.

Нами был произведено сравнение частоты выявления микроорганизмов, вызвавших уретрит и цервицит у обследованных пациентов. Данные приведены в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, спектр микроорганизмов, выявляемый у женщин с цервицитом и мужчин с уретритом, был примерно одинаковым, различия несущественны. C. trachomatis у мужчин и женщин выявлялись с частотой 13,6% и 12,1% соответственно; M. genitalium – 9,6% и 7,5%, соответственно. Группа пациентов с патологическими состояниями урогенитального тракта, вызванными M. genitalium, состояла из 33 человек (мужчин - 12, женщин - 21) в возрасте от 16 до 55 лет.

В качестве группы сравнения нами была выбрана группа пациентов с патологическими состояниями урогенитального тракта, вызванными С. trachomatis. Выбор такой группы был обусловлен широкой распростра-ненностью данного возбудителя среди обследованных нами пациентов, а также тем, что патологические состояния урогенитального тракта, вызванные N. gonorrhoeae и T. vaginalis, являются хорошо изученными и неоднократно описаны в литературе. Данная группа состояла из 51 человека в возрасте от 15 до 45 лет: 17 мужчин и 34 женщины.


Таблица 1

Частота выявления микроорганизмов у мужчин с уретритом и женщин

с цервицитом

Возбудитель
Всего

(n=406)
Мужчины (n=125)
Женщины (n=281)
c2
P

N
%
n
%

C. trachomatis
51 (12,6%)
17
13,6
34
12,1
0,07
>0,10

M. genitalium
33 (8,1%)
12
9,6
21
7,5
0,28
>0,10

T. vaginalis
28 (6,9%)
10
8,0
18
6,4
0,14
>0,10

N. gonorrhoeae
27 (6,7%)
9
7,2
18
6,4
0,01
>0,10

U. urealyticum
17 (4,2%)
2
1,6
15
5,3
2,15
>0,10

Прочие
250 (61,6%)
75
60,0
175
62,3
0,11
>0,10


По возрастному составу пациенты обеих групп не различались (c2=1,76; p>0,10). Причины обращения к врачу были одинаковыми в обеих сравниваемых группах пациентов как среди мужчин (c2=0,97; p>0,10), так и среди женщин (c2=4,65; p>0,10).

Признаки воспалительного заболевания у полового партнера встречались с одинаковой частотой в группах мужчин и женщин (c2=0,68; p>0,10).

Обращает на себя внимание тот факт, что основной причиной и у тех, и у других явились активные жалобы. Жалобы на выделения из мочеиспускательного канала предъявляли 8 (66,6%) пациентов из основной группы. Эти жалобы сопровождались зудом в области наружных половых органов, наличием налетов на головке полового члена и гиперемией головки полового члена. Жалобы на болезненность при мочеиспускании были отмечены у 2 (16,7%) пациентов, а также у 2 (16,7%) – на наличие диспареунии. В связи с тем, что основной причиной обращения пациентов за медицинской помощью являлись выделения из половых путей, мы изучили их характер. У мужчин основной группы жалобы на слизистые выделения из половых путей встречались в 5 (62,5%) случаях, слизисто-гнойные выделения из половых путей отмечались у 3 (37,5%) пациентов. У пациентов с уретритом, вызванным C. trachomatis, жалобы на наличие слизистых выделений были такими же, как и у пациентов первой группы (45,4% и 37,5%, соответственно; (c2=3,62; p=0,41).

У женщин также превалировали жалобы на выделения из половых путей – 14 (67,7%) пациенток, у 7 (33,3%) причиной обращения к врачу были выделения, сопровождающиеся другими симптомами. При анализе характера выделений оказалось, что в подавляющем большинстве случаев выделения были слизистыми – 14 (66,7%), а наличие слизисто-гнойных отмечалось лишь у 7 (33,3%) пациенток. Среди пациенток с цервицитом, обусловленным C. trachomatis, у большей части также были отмечены слизистые выделения из половых путей – 26 (76,5%).

В таблицах 2 и 3 представлены данные объективного обследования мужчин и женщин основной группы и группы сравнения. Существенных различий между клиническими проявлениями заболевания не отмечалось.


Таблица 2

Данные объективного осмотра мужчин с наличием уретрита, вызванного

M. genitalium или C. trachomatis


Данные осмотра
Основная группа

(n=22)
Группа сравнения

(n=34)
P

n
%
N
%

Головка полового члена

Изменений нет
4
33,3
4
23,5
>0,10

Наличие налета
3
25,0
2
11,8
>0,10

Гиперемия в области наружного отверстия мочеиспускательного канала

8
66,7
11
64,7
>0,10

Мочеиспускательный канал

Выделения из мочеиспускательного канала

8
66,7
11
64,7
>0,10

Изменений нет
4
33,3
6
35,3
>0,10

Характер выделений

Слизистые выделения
5
62,5
8
72,7
>0,10

Слизисто-гнойные выделения
3
37,5
3
27,3
>0,10



Таким образом, пациенты с наличием уретрита у мужчин и цервицита у женщин, ассоциированных с M. genitalium, существенно не различались по возрасту, причинам обращения к врачу, жалобам. Следует отметить, что как мужчины, так и женщины с данными заболеваниями предъявляли в основном жалобы на выделения из половых путей, сопровождающиеся субъективными ощущениями в виде чувства зуда и жжения при мочеиспускании различной степени выраженности.


Таблица 3

Данные объективного обследования женщин с наличием цервицита,

вызванного M. genitalium или C. trachomatis



Данные осмотра
Основная группа

(n=22)
Группа сравнения

(n=34)

p

n
%
N
%

Вульва

Изменений нет
2
9,5
3
8,8
>0,10

Кондиломы
2
9,5
3
8,8
>0,10

Гиперемия

17
81
28
82,4
>0,10

Влагалище

Изменений нет
2
9,5
3
8,8
>0,10

Гиперемия стенок влагалища в сочетании с выделениями

19
90,5
31
91,2
>0,10

Цервикальный канал

Слизистые выделения
14
66,7
26
76,5
>0,10

Слизисто-гнойные выделения
7
33,3
8
23,5
>0,10



Нами впервые была проведена оценка диагностических характеристик методов амплификации нуклеиновых кислот (МАНК), предлагаемых для выявления М. genitalium в различных клинических образцах. Пять тестов на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) оценивались с использованием вагинальных образцов и проб мочи, полученных от женщин, и уретральных проб и образцов мочи, полученных от мужчин.

В качестве референс-метода была использована ПЦР в реальном времени, использующая в качестве мишени ген адгезина MgPa, положительные образцы были также подтверждены двумя ПЦР с электрофорезной детекцией, использующими в качестве мишени 16S rRNA и MgPa соответственно.

Для оценки пределов детекции и аналитической чувствительности исследуемых МАНК нами была использована контрольная панель, состоящая из разведений шести различных штаммов M. genitalium и 14 других видов микоплазм.

Результаты, полученные при помощи исследуемых тестов и референс-тестов, показали достаточно высокий уровень совпадения. Так, конкордантные результаты были получены для 279 из 281 (99,3%) вагинальных образцов, 274 из 281 (97,5%) образцов мочи у женщин, 122 из 125 (97,6%) для уретральных образцов у мужчин и 119 из 121 (95,2%) образцов мочи у мужчин (табл. 4) Таким образом, данные, представленные в таблице 4, показывают совпадение результатов, полученных при использовании оцениваемых и референс тестов.