Методические рекомендации по выполнению лабораторного и научно-исследовательского практикума для студентов всех форм обучения специальностей 240901 «Биотехнология» и260204 «Технология бродильных производств и виноделие»

Вид материала

Содержание

3.9.2 Биосинтез эргостерина
3.9.3 Продуценты эргостерина
Methylococcus capsulatus
3.9.4 Условия образования эргостерина дрожжами
3.9.5 Промышленное получение и применение эргостерина
Candida quilliermondii
3.9.6 Сырье и реактивы для промышленного получения
Оценка эффективности культивирования

Подобный материал:

1 2 3 4 5 6

3.9.2 Биосинтез эргостерина

Стерины, каротиноиды, соединения групп Q-коферментов относятся к терпенам, синтезирующимся по «изопреновому правилу», по которому каротиноиды (политерпены), стерины (тритерпены), а также убихиноны и гиббереллиновая кислота синтезируются из изопреновых единиц в четыре стадии:

образование мевалоната из ацетил-КоА или лейцина;
дегидратирование и декарбоксилирование мевалонилпирофосфата с образованием «активного изопрена»  изопентенилпирофосфата и конденсация изопреновых звеньев с образованием ациклических терпенов разной длины;
циклизация ациклических структур;
дальнейшая модификация циклической структуры.

Интермедиатами синтеза стеринов являются ацетат, мевалоновая кислота, сквален, ланостерин. Сквален – общий предшественник стеринов растительного, животного происхождения и дрожжей, накапливается и при аэрации превращается в стерин. Первые две стадии синтеза стеринов схожи с синтезом каротиноидов, расхождение  на уровне фарнезилпирофосфата, который в случае стеринов димеризуется с образованием сквалена.

(

) Фарнезилпирофосфат  Сквален ()

Затем при циклизации и отщеплении протона образуется ланостерин, предшественник холестерина и эргостерина:

Сквален Ланостерин

Превращение ланостерина в эргостерин происходит в результате следующих стадий:

деметилирования ланостерина;
трансалкилирования с образованием 24(28)-метиленовой группы и одновременным восстановлением С-24(25)двойной связи;
десатурации боковой цепи с образованием С-22(23) двойной связи (предполагается участие монооксигеназной системы, содержащей цитохром Р-450);
изомеризации ⁸ ⁷;
дегидрогенирования с образованием ⁵;
восстановления 24(28)-метиленовой группы до метильной.

Последовательность реакций точно не установлена, но выделен ряд веществ, которые рассматривают как интермедиаты на пути от ланостерина к эргостерину. Предполагают, что ферменты, участвующие в поздних стадиях синтеза эргостерина, локализуются в микросомах дрожжей.

3.9.3 Продуценты эргостерина

Источниками эргостерина в природе являются фитопланктон, бурые и зеленые водоросли, особенно богаты эргостерином дрожжи и плесневые грибы, которые служат сырьем для его промышленного получения. Эргостерин – основной стерин дрожжей, на который приходится 60–90 % от других стеринов: содержание эргостерина составляет 0,20,5 % сухой биомассы дрожжей, иногда достигает 10 %. Культурные расы дрожжей всегда богаче стеринами, чем дикие; наибольшее количество стеринов содержат пивные и пекарские дрожжи. По эргостеролсинтезирующей способности при поверхностном культивировании дрожжи располагаются в следующий ряд (исходя из процентов эргостерола в абсолютно сухих дрожжах): Saccharomyces carlsbergensis (0,494,30); Saccharomyces ellipsoideus (1,21,5); Rhodotorula glutinis (0,70,9); Candida utilis (0,40,6); Candida tropicalis (0,20,3). В мицелии грибов Aspergillus и Penicillium содержание стеринов 1,21,4 % в расчете на сухой мицелий. Penicillium westlingtii содержат 2,20 %.

Бактерии синтезируют ничтожные количества стеринов. Содержание в их клетках стеринов и сквалена составляет 0,0010,1 мг/г сухой биомассы. Стерины обнаружены у Lactobacillus arabinosus, Lactobacillus pentosus, Escherichia coli, Azotobacter chroococcum, Micromonospora sp., Streptomyces griseus, Sphaerotillis natans, Rhodospirillum rubrum.

Большие количества сквалена синтезируют Halobacterium cutirubrum (1,0 мг/г сухих клеток) и Methylococcus capsulatus (5,5 мг/г сухих клеток). Сквален и его четыре гидроформы выделены из метанообра-зующей бактерии Methanobacillus kuzneceovii. В клетках Mycobacterium rubrum обнаружено холестерина 7,08,0 % от общего количества липидов.

3.9.4 Условия образования эргостерина дрожжами

Наиболее высокие количества стеринов синтезируют штаммы Saccharomyces carlsbergensis ИНМИ-101 и Saccharomyces carlsbergensis. Биомасса Saccharomyces carlsbergensis может содержать более 10 % эргостерина при условии хорошей аэрации в процессе культивирова-ния. В анаэробных условиях в клетках дрожжей накапливается предшественник эргостерина – сквален. Показано, что кислород индуцирует синтез стеринов, активируя эпоксидазу сквалена – превого фермента биосинтетического пути. Индукция синтеза эргостерина начинается при 0,03%-ном содержании О₂ в газовой фазе и достигает максимума при 2%-ной концентрации.

Для биосинтеза стеринов дрожжами важно, чтобы среда содержала большой избыток углеводов и мало азота. Пекарские дрожжи, богатые белком, содержат мало стеринов. В дрожжах рода Candida высокое соотношение C:N в среде приводит к накоплению липидов, а не эргостерина.

Для дрожжей, усваивающих н-алканы, они являются лучшим источником углерода для синтеза эргостерина, чем углеводы. Это может быть связано с образованием из н-алканов ацетата (предшественника эргостерина) в результате -окисления парафинов. Для пекарских дрожжей ацетат является хорошим источником углерода в биосинтезе стеринов.

Стимулирующее действие на образование стеринов дрожжами оказывают ингибиторы гликолиза и разобщители окислительного фосфорилирования и дыхания. Важно также присутствие в среде достаточного количества витаминов, главным образом пантотеновой кислоты, которая в составе КоА участвует в построении молекулы эргостерина.

При действии на дрожжи рентгеновского излучения содержание эргостерина увеличивается в 2-3 раза, что объясняется угнетением процесса аминирования, сопровождающегося повышением синтеза липидов. Подобно ионизирующим облучениям действуют радиомиметические вещества, нарушающие метаболизм клетки и стимулирующие липидный обмен. Например, при комбинированном воздействии на клетки дрожжей эмбихина и рентгеновского излучения выход стеринов Saccharomyces cerevisiae увеличивается на 109 % по сравнению с контролем.

Полиеновые антибиотики нистатин и филипин, взаимодействующие с мембранами дрожжей, повышают уровень стеринов в клетках на 5060 % по сравнению с контролем.

Синтез стеринов не связан с ростом дрожжей. Содержание стеринов повышается по мере старения культуры и стеринообразование продолжается после остановки роста клеток.

Роль стеринов в метаболизме продуцентов не до конца ясна. Наблюдается связь между дыхательной активностью дрожжей и образованием эргостерина. В анаэробных условиях дрожжи содержат много сквалена и мало эргостерина. Роль эргостерина как структурного компонента мембран связывают с проницаемостью клеточных мембран.

Наиболее богата стеринами у дрожжей фракция митохондрий. Предполагается, что митохондрии принимают участие в биосинтезе стеринов, которые затем участвуют в образовании митохондриальных структур и оказывают влияние на их функциональную активность.

Стерины содержат в молекуле ОН-группу и в клетке находятся в виде эфиров жирной кислоты. Поэтому существует предположение, что образование стеринов – это реакция детоксикации, защищающая организм от избыточного синтеза жирных кислот. Стерины используются для транспорта непредельных кислот и других соединений в клетке. Микоплазмы включают стерины в клеточные мембраны. Дрожжи Saccharomyces cerevisiae в условиях пониженного содержания растворенного О₂ в среде поглощают экзогенные стерины, часть из которых подвергают трансформации с образованием ценных стероидов. Например, демостерин клетки дрожжей превращают в
24-метилхолестерин, а 24,25-дигидроланостерин преобразуют в
7-дегидрохолестерин, который служит интермедиатом в биосинтезе витамина D₃.

3.9.5 Промышленное получение и применение эргостерина

В промышленности эргостерин получают из дрожжей Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis и мицелиальных грибов. Засев производят большим количеством инокулята. Культивирование ведут при высокой температуре и сильной аэрации в среде, содержащей большой избыток источников углерода по отношению к источникам азота.

Дрожжи и грибы Aspergillus и Penicillium используют для получения кристаллического витамина D₂ или концентрата. В качестве концентрата в животноводстве применяют облученные сухие дрожжи.

Максимум поглощения эргостерина наблюдается при 280 нм. Это излучение возбуждает отдельные связи колец А и В в молекуле эргостерина и вызывает его превращение в витамин D₂. Облучение производят ультрафиолетовыми лампами с длиной волны 280300 нм (сухие дрожжи) или в тонком слое 5 %-ной суспензии дрожжей. При более коротковолновом или длинноволновом излучении повышается выход других соединений стериновой природы.

На выход витамина D₂и образование других соединений влияют длительность облучения, температура, наличие примесей.

Промышленность выпускает препарат «Кормовые гидролизные дрожжи, обогащенные витамином D₂». В 1 г абсолютно сухих дрожжей содержится 5000 ИЕ витамина D₂, не менее 46 % сырого протеина и незаменимые аминокислоты, в том числе лизин, метионин, триптофан.

Для получения кристаллического витамина D₂ дрожжи или мицелий грибов подвергают гидролизу соляной кислотой при 110 С. Гидролизованную массу обрабатывают спиртом при 7578 С и после охлаждения до 1015 С фильтруют. Фильтрат упаривают до содержания в нем 50 % сухих веществ и используют как концентрат витаминов группы В.

Витамин D₂ получают из массы, оставшейся после фильтрации. Массу промывают, сушат, измельчают и дважды обрабатывают при температуре 78 С трехкратным объемом спирта.

Спиртовые экстракты сгущают до 70%-ного содержания сухих веществ. Таким образом получают липидный концентрат. Его омыляют раствором NaOH, а стерины остаются в неомыленной фракции. Кристаллы эргостерина выпадают из раствора при 0 С. Очистку кристаллов проводят путем перекристаллизации, последовательным промыванием 69%-ным спиртом, смесью спирта и бензола (80:20) и повторной перекристаллизацией. Полученные кристаллы эргостерина сушат, растворяют в эфире, облучают, после чего эфир отгоняют, а раствор витамина концентрируют и кристаллизуют.

Для получения масляного концентрата раствор витамина после фильтрации разбавляют маслом до стандартного уровня.

Источником получения эргостерина может быть мицелий грибов, остающийся как отход антибиотической промышленности и производства лимонной кислоты.

Промышленное получение эргостерина возможно также из липидной фракции Candida quilliermondii, использующей н-алканы.

Сухую массу дрожжей для извлечения остаточных углеводородов экстрагируют петролейным эфиром. Получаемая при этом липидная фракция (микробный жир) является побочным продуктом. Из нее выделяют эргостерин, убихинон-9 и другие жирорастворимые соединения.

Обогащенные эргостерином, облученные ультрафиолетовым излучением дрожжи используют в животноводстве как кормовую добавку.

Эргостерин – исходный продукт для получения некоторых стероидных гормонов, лечебных и пищевых препаратов.

3.9.6 Сырье и реактивы для промышленного получения

эргостерина

При промышленном получении эргостерина по технологической инструкции требуется:

- пекарских дрожжей 600 кг;

- едкого калия 100 кг;

- спирта этилового 975 мл.

В реактор вместимостью 2 м³ загружают 600 кг дрожжей, 100 кг чешуйчатого едкого калия, 975 л этилового спирта, при перемешивании нагревают до кипения и выдерживают до шести часов при температуре 7884 С. Массу сливают на нутч-фильтр, при этом получают твердые остатки дрожжевых клеток и частично гидролизованных белков (белковые отходы), которые преимущественно оседают на стенках и мешалке реактора. После слива экстракта их промывают водой.

Экстракт после фильтрования упаривают до содержания сухих веществ 3639 %, из концентрата после кристаллизации, осуществляемой при температуре 1520 С в течение 68 ч, осаждают эргостерин-сырец, содержащий около 30 % эргостерина, а также другие дрожжевые стерины и щелочь, получают 45 кг сырца. Его, не высушивая, подвергают двух-, трехкратному кипячению с 65%-ным этиловым спиртом в соотношении 15, 20 и 16 л на 1 л сырца, растворяя при этом щелочь и стерины (операция аффинации). После сушки при 5060 С получают 1,21,4 кг аффинированного эргостерина, содержащего не менее 88 % основного вещества и до 3 % влаги. Т_пл = 157159 С.

ЛИТЕРАТУРА

Промышленная микробиология / под. ред. Н.С. Егорова.  М.: Высшая школа, 1989. – 503 с.
Березовский, В.М. Химия витаминов / В.М. Березовский.  М.: Наука, 1973. – 489 с.
Теппер, Е.З. Практикум по микробиологии / Е.З. Теппер, В.К. Шильников, Г.И. Переверзева.  М.: Колос, 1993. – 321 с.
Нетрусов, А.И. Практикум по микробиологии / А.И. Нетрусов [и др.]. – М.: Академия, 2005. – 608 с.
Драк, А.И. Получение эргостерина без коагуляции дрожжевой массы / А.И. Драк, Г.И. Аксенович, В.В. Высоцкий, Я.С. Мелляр // Химико-фармацевтический журнал. – 1989.  № 6. – С. 4143.
Бабьева, И.П. Биология дрожжей / И.П. Бабьева, И.Ю. Чернов. – М.: Товарищество научных изданий КМК, 2004. – 221 с.

Содержание

ВВЕДЕНИЕ______________________________________________	3
1 ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ_________________________________	4
1.1 Задание_____________________________________________	4
1.2 Оценка жизнеспособных клеток дрожжей в сравнении с количеством посторонней микрофлоры______________________	4
1.3 Количественное определение сахаров в питательной среде после автоклавирования и культивирования___________________	6
1.4 Культивирование дрожжей в аэробных условиях__________	8
1.5 Культивирование дрожжей в анаэробных условиях________	10
1.6 Получение эргостерина из биомассы дрожжей_____________	12
2 ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ________________________________	15
2.1 Общая характеристика дрожжей________________________	15
2.2 Систематика дрожжей_________________________________	16
2.3 Классификация дрожжей_______________________________	18
2.4 Распространение дрожжевых грибов в природе____________	24
2.5 Особенности метаболизма дрожжей_____________________	26
2.6 Продукты метаболизма________________________________	33
2.7 Лимитирующие факторы_______________________________	34
3 ПРОМЫШЛЕННОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДРОЖЖЕЙ_________	40
3.1 История использования________________________________	40
3.2 Традиционные процессы_______________________________	40
3.3 Виноделие___________________________________________	42
3.4 Пивоварение_________________________________________	43
3.5 Хлебопечение________________________________________	45
3.6 Дрожжи как источник белка____________________________	48
3.7 Производство этанола_________________________________	50
3.8 Различные продукты, получаемые из дрожжей____________	54
3.9 Эргостерин__________________________________________	56
ЛИТЕРАТУРА____________________________________________	65

Ламберова Марина Эдуардовна

Кошелев Юрий Антонович

Войнаровская Тамара Иосифовна

ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Учебное пособие

Редактор Соловьева С.В.

Подписано в печать 21.08.2007. Формат 6084 1/16

Усл. п. л.  4,1. Уч.-изд. л.  4,4

Печать  ризография, множительно-копировальный
аппарат «RISO TR-1510»

Тираж 100 экз. Заказ 2007-49

Издательство Алтайского государственного

технического университета

656038, г. Барнаул, пр. Ленина, 46

Оригинал-макет подготовлен ИИО БТИ АлтГТУ

Отпечатано в ИИО БТИ АлтГТУ

659305, г. Бийск, ул. Трофимова, 29

Blog

Содержание