Geum.ru

Лечебный Фитоцентр «феникс»

Вид материалаДокументы

Содержание


Энзимотропное действие Флараксина и противоопухолевых препаратов
Подобный материал:
1   ...   13   14   15   16   17   18   19   20   ...   29

Энзимотропное действие Флараксина и противоопухолевых препаратов


Предварительные исследования взаимодействия «Цитохрома-С» с «Флараксином» указывали на возможность образования межмолекулярных комплексов (10). Как известно (11), «Цитохром-С» представляет сложную ферментативную систему, включающую в себя кофермент-комплекс железа с протопорфиринами, связанный с белковым окружением ковалентными связями по серу содержащим функциональным группам.

В настоящей работе методами флуоресценции и спектрофотометрии изучено взаимодействие «Флараксина», вещества-основы Флараксина (ВО), «Циклофосфана» и «Проспидина» с белковыми структурами «Цитохрома-С» и его протогемом.

Флуориметрия


Спектры флуоресценции «Цитохрома-С» изучали в изотоническом буфере и в растворе 5% глюкозы. В спектре флуоресценции «Цитохрома-С» (концентрация С=10-4 моль/л, =286 нм) наблюдаются полосы, обусловленные флуоресценцией тирозиновых (=300 нм) и триптофановых (фл=350 нм) остатков, а также малоинтенсивная длинноволновая компонента фл=450 нм, характерная для триплетного свечения триптофана (8).

Нами было проведено флуориметрическое титрование раствора «Цитохрома-С» с «Флараксином» и ВО, «Проспидином» и «Циклофосфаном». Введение в раствор «Флараксина» и ВО сопровождалось изменениями в спектре флуоресценции «Цитохрома-С», тогда как «Проспидин» и «Циклофосфан» не влияли на его спектр. На Рис. 4.2. приведены зависимости, отражающие изменение интенсивности флуоресценции «Цитохрома-С» при 300нм и 350нм.

Р
I, I' и 3, 3' - ФЛАРАКСИН и вещество (изотонический буфер)
2, 2' и 4, 4' - ФЛАРАКСИН и ВО (5% глюкоза)
I и 4 - на длине волны 350 нм
I'и 4' - на длине волны 300 нм
ис 4.2. Изменение интенсивно-сти флуоресценции «Цитохрома-С» в зависимости от концентра-ции Флараксина или ВО.

Из которого видно, что с возрастанием концентрации ФАВ наблюдается тушение флуоресценции полосы =300нм и возгорание при фл=350нм, что обусловлено, по-видимому, изменением окружения тирозиновых и трипто-фановых остатков с последующим переносом энергии от флуорофора тирозина к триптофану. При этом возгорание триптофановой флуоресценции в присутствии «Флараксина» в ~3 раза эффективнее, чем в присутствии ВО. Насыщение флуоресценции фл=350нм при введении «Флараксина» достигается при меньших концентрациях (5-7 мг/мл), чем для ВО (12-13 мг/мл). Величины констант тушения Кq, определенные из зависимости F0/F=f(1/c), приведены в Табл.4.2.

Таблица 4.2. Величины констант тушения флуоресценции «Цитохрома-С» с «Флараксином» и его ВО.

Вещество
Kq, моль-1·сек-1·л

Изотонический буфер
5% глюкоза

Флараксин

=300 нм
(9,3± 0,1)·104
(1,10± 0,05)·105

=350 нм
(1,3± 0,1)·104
(8,0± 0,1)·103

=450 нм
(1,0± 0,1)·105
(5,7± 0,2)·104

Вещество-основа Флараксина (ВО)

= 300 нм
(9,4± 0,1)·104
(9,8± 0,10)·105

= 350 нм
(1,9± 0,1)·103
(4,4± 0,1)·103

= 450 нм
----

(2,9± 0,2)·104

Анализ приведенных в Табл.4.2. констант Кq показывает, что как в изотоническом буфере, так и в растворе 5% глюкозы реакции в области тирозиновых остатков (=300 нм) протекает с большей скоростью, чем для триптофановых флуорофоров. Глюкоза вызывает снижение скорости тушения флуоресценции «Цитохрома-С» с «Флараксином», а, следовательно, ингибирование взаимодействия между ними, что обусловлено, по-видимому, ее влиянием на скорость протонного обмена в присутствии «Флараксина» (9).

Спектрофотометрия


Проведено спектрофотометрическое исследование взаимодействия «Циохрома-С» с «Флараксином», «Циклофосфаном», «Проспидином». На Рис.4.3 приведены зависимости оптической плотности Д237 раствора «Циохрома-С» (полосы Соре) от концентрации добавленных ФАВ («Флараксин», «Проспидин», «Циклофосфан») в изотоническом буфере (рН 6,9), так и в растворе 5% глюкозы (рН 6,1). Как видно из рисунка, «Циклофосфан» и «Проспидин» в изотоническом буфере незначительно понижают оптическую плотность  - формы «Цитохрома-С», а, следовательно, смещают равновесие в сторону образования окисленной формы фермента, в то время как «Флараксин» при малых концентрациях (Сфл <2·10-4 моль/л) незначительно повышает Д237, а при большей концентрации резко снижает оптическую плотность. В растворе 5% глюкозы введение уже малых добавок «Флараксина» приводит к длинноволновому смещению полосы Соре и снижению ее оптической плотности Д237. То-есть результаты эксперимента показывают, с одной стороны, различный характер воздействия на состояние окисления протогема «Флараксина» по сравнению с «Циклофосфаном» и «Проспидином»; с другой стороны, применение в качестве исходной среды 5% глюкозы убирает концентрационную область действия «Флараксина» как восстановителя (область возрастания Д237 в спектре «Цитохрома-С»), способствует образованию окисленной формы «Цитохрома-С».

П
1 и 1’ - ФЛАРАКСИН в Изотоническом буфере и 5% глюкозе.
2 и 3 – ПРОСПИДИН и ЦИКЛОФОСФАН в Изотоническом буфере.
одтверждением этого может быть проведенное спектрофотометрическое титрование «Флараксина» (раствор в 5% глюкозе) «Цитохромом-С». На Рис.4.4. приведен дифференциальный спектр в координатах D - нм, где D = D - D0, D0 и D - оптическая плотность на длине волны  раствора «Цитохрома-С»

Рис.4.3. Зависимость интенсивно-сти полосы поглощения (полос Соре) D410 «Цитохрма-С» от концентрации добавленных ФАВ (CФАВ).

и смеси его с «Флараксином» (за вычетом D Флараксина). Как можно видеть, отрицательное поглощение (max=274нм) и возрастание оптической плотности (max=330нм) свидетельствует о том, что окислительно-восстановительная реак-ция протекает с расходованием компонентов Флараксина, флавоноидов или алкалоидов (12) с образованием комплексов с переносом заряда.