Протекторная и регенерационная терапия при остром и хроническом повреждении почки 14. 00. 40 урология
| Вид материала | Автореферат |
- Ранняя диагностика и профилактика рака почки на основе клинико эпидемиологического, 1500.23kb.
- Изменения секреторно-моторной функции желудка лошади при остром расширении 06. 02., 474kb.
- 8 марта 2012 года всемирный день почки, 99.34kb.
- Аппендикс: методы очистки воды, 360.55kb.
- Образовательный стандарт послевузовской профессиональной подготовки специалистов Специальность:, 1675.37kb.
- Порядок возмещения вреда при повреждении здоровья лица, не достигшего совершеннолетия, 13kb.
- Бражник Елена Анатольевна л-314, 424.02kb.
- Стандарт медицинской помощи больным с врожденной аномалией почки неуточненной, 591.5kb.
- Курс для руководителей салонов (как начинающих, так и имеющих опыт работы), 54.36kb.
- Клинико-патогенетические механизмы развития внешне и внутрисекреторной недостаточности, 559.83kb.
На правах рукописи
Казаченко Александр Викторович
ПРОТЕКТОРНАЯ И РЕГЕНЕРАЦИОННАЯ ТЕРАПИЯ ПРИ ОСТРОМ И ХРОНИЧЕСКОМ ПОВРЕЖДЕНИИ ПОЧКИ
14.00.40 – урология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
МОСКВА
2009
Р
абота выполнена в ФГУ НИИ урологии Росмедтехнологий и в ФГУ НЦ акушерства, гинекологии и перинатологии Росмедтехнологий им. М.В.Кулакова| Научные консультанты | доктор медицинских наук, профессор Дзеранов Николай Константинович академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Сухих Геннадий Тихонович |
| Официальные оппоненты | доктор медицинских наук, профессор Винаров Андрей Зиновьевич кафедра урологии Московской Медицинской Академии им. И.М.Сеченова доктор медицинских наук, профессор Зайцев Андрей Владимирович кафедра урологии Московского государственного медико-стоматологического университета доктор медицинских наук, профессор академик Академии медико-технических наук РФ Онищенко Нина Андреевна заведующая лабораторией биотехнологий стволовых клеток ФНЦ Трансплантологии и искусственных органов имени академика В.И. Шумакова |
| Ведущая организация | ГОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования Росздрава |
Защита состоится « » _______________ 2009 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д. 208.056.01 при ФГУ НИИ урологии Росмедтехнологий, 105425, Москва. 3-я Парковая, 51.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ НИИ урологии.
Автореферат разослан « » ___________ 2009 г.
| Ученый секретарь диссертационного совета 208.056.01, доктор медицинских наук | Т.С.Перепанова |
Актуальность
Острое или хроническое нарушение функции почек вне зависимости от повреждающего фактора является тяжелым, нередко встречающимся состоянием, которое помимо инвалидизации, в ряде случаев создает и реальную угрозу жизни больного. В урологической практике нарушение функции почек встречается у пациентов после различных операций сопровождающихся ишемией органа, особенно при наличии исходных признаков почечной недостаточности, а также после операции на единственной почке. В первую очередь это можно связать с повреждением функционально активных паренхиматозных клеток органа в результате нарушения клеточного метаболизма и повреждения внутриклеточных мембранных структур в период ишемии и в раннем постишемическом периоде [Биленко М.В., 1989; Кирпатовский В.И. и соавт., 2003].
К развитию функциональной недостаточности почек приводят различные урологические заболевания, сопровождающиеся длительно текущим хроническим пиелонефритом с частыми периодами обострения, что неуклонно ведет к гибели почечной паренхимы, особенно в случае дополнительного ишемического повреждения почки в ходе оперативного вмешательства [Лопаткин Н.А. и соавт., 1996; Fugger R. et al., 1991; Lien Y.H. et al., 2003].
При развитии острой или хронической функциональной недостаточности почек (или почки) возникает необходимость поддержания или полной замены функции поврежденного органа путем применения эфферентных методов лечения. Однако, потребности в этих видах лечения, включая и трансплантацию почки, намного опережают возможности современной медицины, как в России, так и в других развитых странах, что требует более углубленного изучения патогенеза данного состояния и поиска альтернативных методов лечения [Лопаткин Н.А. и соавт., 1998; Шумаков В.И., 2005].
Многолетние исследования патогенеза ишемического повреждения почек привели к выводу о многофакторности этого процесса [Биленко М.В., 1989; Fugger R. et al., 1991; Crompton M., 1999; Lien Y.H. et al., 2003; Gure A. et al., 2004]. Основными факторами считаются нарушение синтеза АТФ, повреждение клеточных мембран избыточным образованием активных форм кислорода с активацией мембраносвязанной фосфолипазы А2 и протеолитических лизосомальных ферментов, перераспределение ионов натрия, калия и кальция между клеткой и внеклеточной средой вследствие утраты барьерных свойств клеточных мембран, активация синтеза медиаторов воспаления и связанная с этим лейкоцитарная инфильтрация паренхимы почки. В последние годы большое значение придается усилению синтеза оксида азота – одного из центральных регуляторов клеточного метаболизма, способного при избыточной продукции взаимодействовать с супероксид анион радикалом с образованием высокотоксичного соединения – пероксинитрита. Особенно неблагоприятными могут быть последствия этого процесса при сопутствующем воспалении (пиелонефрит), что часто встречается в урологической практике.
В связи с этим проблема патогенеза ишемического повреждения почки и постишемической острой почечной недостаточности, роль оксида азота в этом процессе и его взаимосвязь с основными факторами клеточного повреждения является актуальной. Необходимо определить взаимодействие факторов ишемического повреждения при остром и хроническом пиелонефрите и влияние сопутствующего воспаления на толерантность почки к ишемии.
Современные технические возможности позволяют изучать состояние метаболизма непосредственно в живых клетках срезов различных тканей, в том числе и паренхимы почек, причем на уровне субклеточных органелл. При использовании метода сканирующей лазерной конфокальной микроскопии с окраской витальных срезов специфическими флуоресцентными зондами возможно оценивать функциональное состояние митохондрий и других клеточных органелл и определять активность патологических процессов, протекающих в клетках ишемизированного органа, а также выраженность индуцированных ими метаболических расстройств [Плотников Е.Ю. и соавт., 2005; 2007; Кирпатовский В.И. и соавт., 2006].
Знание механизмов ишемического повреждения поможет в разработке методов его профилактики и/или минимизации последствий. До настоящего времени основными методами противоишемической защиты являются локальное охлаждение и применение фармакологических препаратов, обладающих антиишемическим и антигипоксическим действием, однако, нередко их клиническая эффективность ограничена.
Перспективным может быть применение нового класса антиоксидантов (так называемые «митохондриально-ориентированные антиоксиданты»), способных избирательно накапливаться в функционирующих митохондриях в концентрации в 1000 раз превышающей их концентрацию в цитоплазме [Васильева А.К. и соавт., 2007; Антоненко Ю.Н. и соавт., 2008; Архипова Л.Т. и соавт., 2008]. К таким соединениям относятся конъюгаты производных пластохинона [10-(6-пластохинонил) децилтрифосфоний и 10-(6'-пластохинонил) децилродамин] и убихинона, синтезированные в НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московского государственного университета. Доказана высокая антиоксидантная активность этих препаратов in vitro в модельных опытах и на клеточных культурах [Васильева А.К. и соавт., 2007; Скулачев В.П., 2007; Анисимов В.Н. и соавт., 2008; Агапова Л.С. и соавт., 2008]. Однако, на органном уровне эффективность этих соединений пока не изучена.
Другим принципиально новым направлением повышения противоишемической толерантности органов является тренировка клеток к дефициту кислорода (гипоксическая тренировка организма и ишемическая тренировка органа). В литературе имеются сообщения о повышении устойчивости миокарда, почек и других органов к последующей ишемии после проведения нескольких сеансов дыхания газовой смесью, обедненной кислородом (10-12% О2), [Алешин М.А. и соавт., 1992; Кирпатовский В.И. и соавт., 1996]. Аналогичное действие оказывает кратковременное 2-3 кратное пережатие питающих орган кровеносных сосудов (на 3-5 минут) с периодами реперфузии, выполненными непосредственно перед основным периодом ишемии [Ingwall J.S. et al., 1984; Ogawa T. et al., 2001; Chatterjee P.K. et al., 2003; Hernandez D.J. et al., 2008; Jia R.P. et al., 2009]. Механизм данного эффекта окончательно неясен, что требует его дальнейшего изучения.
Принципиально новым и перспективным современным направлением исследований по сохранению функции поврежденных тканей и органов, в том числе и почки является клеточная терапия, в частности, использование различных типов стволовых клеток [Онищенко Н.А. и соавт., 2005; Черкашина Д.В., Петренко А.Ю., 2006; Brodie J.C., Humes H.D., 2005; Yokoo T. et al., 2008; Humphreys B.D. et al., 2008]. Проведенные в ряде стран исследования показали, что в процессе регенерации поврежденной почки принимают участие собственные кроветворные и мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, которые обнаруживаются в различных почечных структурах [Ricardo S.D., Deane J.A., 2005; Lange C. et al., 2005; Ikarashi K. et al., 2005; Herrera M.B. et al., 2004]. Имеются данные по использованию экзогенных костномозговых клеток, которые вводили животным с острой почечной недостаточностью различного генеза, что способствовало ускоренному восстановлению нарушенных функциональных почечных показателей [Gupta S. et al., 2002; Kale S. et al., 2003; Morigi M. еt al., 2004; Togel F. et al., 2005; Behr L. et al., 2007; Choi S. et al., 2008]. Однако, до сих пор не установлены наиболее оптимальный тип стволовых клеток и лучший способ их ведения. Лишь в единичных публикациях описаны результаты клеточной терапии хронической почечной недостаточности, хотя имеются определенные указания на перспективность этого метода [Yokoo T. еt al., 2003; Baud L. еt al., 2005; Knudsen L.M. et al., 2005]. Все это определяет актуальность дальнейших исследований в этом направлении.
Цель исследования. Выявление клеточных механизмов повреждения почек в условиях ишемии и воспаления и оценка эффективности тренировочных методов, фармакологической, клеточной терапии для предотвращения функциональной почечной недостаточности.
Задачи исследования
- Разработать методики моделирования острой и хронической функциональной недостаточности почек разной степени выраженности, обусловленной ишемией почки, прогрессирующим течением хронического пиелонефрита или дозированным уменьшением функционирующей паренхимы почки.
- Провести сравнительное изучение выраженности функциональных, морфологических и метаболических изменений, включая митохондриальную дисфункцию, продукцию активных форм кислорода и оксида азота, и определить их роль в механизме функциональных расстройств почки, вызванных тепловой или холодовой ишемией.
- Изучить протекторный эффект новых противоишемических фармакологических средств, направленных на защиту митохондрий, при постишемической острой почечной недостаточности и провести сравнительную оценку их эффективности с уже апробированными в клинике фармакологическими препаратами.
- Провести сравнительный анализ тренировочных методов профилактики постишемической острой почечной недостаточности (гипоксическая тренировка организма, ишемическая тренировка почки) с оценкой их эффективности.
- Изучить роль сопутствующего пиелонефрита в толерантности почки к ишемии.
- На клиническом материале изучить метаболические изменения в паренхиме ишемизированных почек методом лазерной конфокальной микроскопии и сопоставить полученные результаты с данными экспериментальных исследований.
- Оценить в эксперименте эффективность терапии хронической функциональной недостаточности и постишемической острой почечной недостаточности с использованием фетальных культивированных костномозговых мезенхимальных стволовых клеток и суммарной культуры клеток почки человека.
- Провести сравнительное изучение динамики функциональных показателей поврежденной почки при клеточной терапии острой и хронической функциональной недостаточности почек у животных в зависимости от пути введения клеток.
- Оценить эффективность клеточной терапии хронического пиелонефрита у животных с использованием морфологических и функциональных методов исследования.
- Разработать рекомендации для клинического использования методов протекторной и регенерационной терапии поврежденной почки.
Научная новизна
Показана ведущая роль в ранних постишемических расстройствах функции почек митохондриальной дисфункции, активных форм кислорода и оксида азота, а также изучено влияние на них разных методов противоишемической защиты.
Выявлено, что протекторный эффект тренировочных методов противоишемической защиты почки (ишемическая и гипоксическая тренировка) обусловлен функциональным состоянием митохондрий, а именно различной степенью продукции ими активных форм кислорода и оксида азота.
Доказана взаимосвязь прижизненных постишемических изменений, выявленных при конфокальной микроскопии и магнитно-резонансной томографии, с функциональным состоянием почек при различных сроках, вариантах ишемии и способах противоишемической защиты.
Доказана высокая эффективность протекторного действия новых противоишемических фармакологических средств, в том числе хлорида лития и митохондриально-ориентированных антиоксидантов «SkQ-1», «SkQR» (являющихся трансмембранно проникающими катионами), направленных на защиту митохондрий при постишемической острой почечной недостаточности разной степени тяжести.
Определена роль сопутствующего хронического пиелонефрита в толерантности почки к ишемии и в эффективности противоишемической защиты и доказано, что в отличие от острого пиелонефрита хроническое воспаление почки существенно не снижает ее противоишемическую толерантность.
В эксперименте продемонстрированы возможности сохранения и улучшения функции поврежденной почки за счет стимуляции регенерационных процессов введением костномозговых мезенхимальных стволовых клеток и прогениторных фетальных клеток почки человека при острой постишемической почечной недостаточности и хронической функциональной недостаточности почек.
Доказана зависимость эффективности клеточной терапии от пути введения (внутривенный или интрапаренхиматозный) и вида используемых клеток.
Выявлено кратковременное влияние клеточной терапии культивированными фетальными костномозговыми мезенхимальными стволовыми клетками на течение хронического пиелонефрита проявляющееся в большей степени в улучшении функции почки и в меньшей степени в подавлении воспалительного процесса.
Практическая значимость работы
Разработана воспроизводимая экспериментальная модель хронического пиелонефрита с развитием хронической функциональной недостаточности почек, позволяющая изучать различные аспекты патогенеза и терапии данного патологического процесса.
Проведена количественная оценка выраженности расстройств функции почки, характеризующих тяжесть острой почечной недостаточности после тепловой и холодовой ишемии разной длительности, что имеет важное значение для разработки более эффективных вариантов противоишемической защиты почки.
Обоснована в эксперименте методика проведения ишемической тренировки почки с целью профилактики ишемического повреждения при длительных (более 40 минут) сроках интраоперационной ишемии почки, рекомендуемая для клинической апробации.
Доказана возможность и целесообразность клинического применения новых фармакологических средств – митохондриально-ориентированных антиоксидантов («SkQ-1» «SkQR») являющихся трансмембранно проникающими катионами, и лития хлорида в качестве препаратов для противоишемической защиты почки.
Установлена целесообразность клинического применения культивированных фетальных костномозговых мезенхимальных стволовых клеток и суммарной культуры почечных клеток человека для лечения пациентов с острой постишемической и хронической функциональной недостаточностью почек. Доказана более высокая эффективность костномозговых мезенхимальных стволовых клеток при их интрапаренхиматозном введении.
Показана целесообразность дальнейших исследований по использованию культивированных фетальных костномозговых мезенхимальных стволовых клеток для лечения хронического пиелонефрита с обращением особого внимания на методы усиления их противовоспалительного действия.
Основные положения выносимые на защиту
1. При ишемии почки основными источниками активных форм кислорода и оксида азота, запускающих каскад мембранно-деструктивных реакций, являются функционально неполноценные митохондрии эпителиальных клеток почечных канальцев, что предопределяет необходимость целенаправленной их защиты от ишемического повреждения.
2. Новые направления противоишемической защиты почек с использованием митохондриально-ориентированных антиоксидантов, хлорида лития и тренировочных методов обладают высокой эффективностью и потенциально могут быть использованы в клинической практике.
3. Клеточная регенерационная терапия с использованием фетальных стволовых и прогениторных клеток способствует улучшению функции поврежденных почек при острой постишемической и хронической почечной недостаточности, а также уменьшает выраженность функциональных расстройств при хроническом пиелонефрите.
Связь с планом научно-исследовательской работы института и отраслевыми программами
Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ФГУ «НИИ урологии Росмедтехнологий», регистрационный номер 0120.0807026; Межведомственного Научного совета по уронефрологии № 24.08 РАМН и Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.
Внедрение результатов исследования в клиническую практику
Разработанные принципы тренировочных методик профилактики постишемических функциональных расстройств, антиоксидантной фармакологической противоишемической защиты и использования стволовых клеток могут быть рекомендованы для дальнейшего клинического исследования.
Апробация работы
Результаты диссертационной работы были представлены на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино 2005; 2007), международной конференции “Ломоносов” (Москва, 2007), IV Съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), международном симпозиуме «От экспериментальной биологии к превентивной и интегративной медицине» (Судак, 2008), IV Всероссийском съезде трансплантологов (Москва, 2008), Российской научной конференции с международным участием «Фундаментальные исследования в уронефрологии» (Саратов, 2009).
Публикации
По теме диссертации опубликованы 45 научных работ, в том числе 15 в рецензируемых изданиях, 3 в зарубежных и 22 тезиса докладов.
Объем и структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 348 страницах машинописного текста, состоит из введения, главы посвященной материалу и методам, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы, включающей 82 работы отечественных и 225 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 26 таблицами и 113 рисунками.
Материал и методы исследования
Экспериментальные исследования были выполнены на 276 животных. 252 белых беспородных крысах и 24 половозрелых кроликах породы Шиншилла.
Уточнение механизма ишемического повреждения почки при различных вариантах моделирования, изучение и сравнительную оценку различных методов противоишемической защиты почки, исследование возможности применения стволовых костномозговых мезенхимальных и почечных клеток плода человека в лечении острой постишемической, хронической почечной недостаточности и сопутствующего хронического пиелонефрита проводили посредством конфокальной микроскопии, биохимических методов исследования (функции и метаболизма), магнито-резонансной томографии и морфологического исследования.
Стволовые клетки человека получали в Научном Центре акушерства, гинекологии и перинатологии им. М.В. Кулакова. Почечные клетки-предшественники (ПК) выделяли из почек, а мезенхимальные стволовые клетки костного мозга (КМ-МСК) – из костного мозга трубчатых костей плодов человека 8-12 недель гестации, полученных в результате медицинского аборта. Первичную непассированную культуру клеток вводили экспериментальным животным в паренхиму почки или внутривенно в количестве 1,5 млн. С целью визуализации клеток после трансплантации использовали прижизненное их окрашивание цитоплазматическим флуоресцентным зондом Calcein-AM.
Микроскопическое изучение витальных срезов почки проводилось на конфокальном микроскопе LSM510 («Carl Zeiss» Германия) с фирменным программным обеспечением. Срезы окрашивались специфичными флуоресцентными красителями. Для изучения трансмембранного потенциала () митохондрий клеток использовали этиловый эфир тетраметил-родамина (TMRE, Invitrogen, США), накапливающийся в митохондриях в соответствии с величиной .
В качестве зонда на активные формы кислорода (АФК) использовался 2,7-дихлорфлуоресцеин в виде мембран-проникающего диацетатного эфира (DCF, Invitrogen, США).
Для выявления продукции оксида азота (NO) в клетках почки, срезы инкубировали в среде содержащей 4,5-диаминофлуоресцеина в виде диацетатного эфира (DAF-2, Invitrogen, США).
Для визуализации TMRE использовали возбуждающий лазер 543 нм и измеряли флуоресценцию в диапазоне 560-590 нм. Красители DCF и DAF-2 возбуждали аргоновым лазером при 488 нм с эмиссией флуоресценции при 505 - 530 нм.
Магниторезонансное исследование почек крыс проводили интраоперационно в различные сроки ишемического и реперфузионного воздействия на аппарате BioSpec 70/30 (Bruker, Germany) с индукцией магнитного поля 7 Тл и градиентной системой 105 мТл/м.
Клиническая часть исследования включает анализ результатов обследования 40 больных (21 женщина, 19 мужчин) оперированных по поводу коралловидного нефролитиаза или паренхиматозной опухоли почки без применения и с использованием различных способов противоишемической защиты (локальное охлаждение почки, фармакологические препараты). Оценка результатов исследования основывалась на данных активности в моче маркерных ферментов деструкции эпителия почечных канальцев (фермента щеточной каемки Ɣ-глутамил транспептидазы – ГГТП и лизосомального фермента нейтральной -глюкозидазы – НАГ), показателях динамической нефросцинтиграфии с 131I-гиппураном (250 - 300 мкКи/кг) и конфокальной микроскопии биопсийного материала (паренхимы почки) взятого в начале и конце периода ишемии.