Протекторная и регенерационная терапия при остром и хроническом повреждении почки 14. 00. 40 урология

Вид материала

Содержание

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Подобный материал:

1 2 3 4

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Прежде, чем приступить к изучению новых методов противоишемической защиты почки, мы провели исследование клеточных механизмов повреждения и адаптации почки в условиях ишемии и воспаления с использованием современных возможностей прижизненного исследования структуры и метаболизма органа, метода конфокальной микроскопии с использование флуоресцентных зондов позволяющих оценить состояние трансмембранного потенциала митохондрий (зонд TMRE), активности синтеза оксида азота (зонд DAF-2) и активных форм кислорода (зонд DCF).

Проведенные исследования по изучению механизмов ишемического повреждения почки при различных сроках ишемии показали, что именно митохондрии клеток почечных канальцев играют основную роль в обеспечении сохранения функциональной полноценности органа, а степень их повреждение напрямую зависит от длительности ишемического воздействия (рис. 1).

А Б В

Рис. 1. Конфокальная микроскопия витальных срезов почки крысы (окраска TMRE). А – интактной почки; Б – после 40 минут ишемии; В – после 90 минут ишемии.

При этом в ишемическом повреждении почки значительную роль играет именно митохондриальная продукция активных форм кислорода (рис. 2) и оксида азота (рис. 3, 4), которые являются инициаторами окислительного и токсического повреждения клеточных структур.

А Б В

Рис.2. Конфокальная микроскопия витальных срезов почки крысы после 40-минутной ишемии и реперфузии. Окраска зондом А – DCF; Б – TMRE; В - совместное окрашивание зондом DCF и TMRE. Активные формы кислорода генерируются как в митохондриях с сохраненным трансмембранным потенциалом (желтое свечение), так и в митохондриях, его утративших (не накапливающих TMRE) (зеленое свечение).

А Б В

Рис. 3. Конфокальная микроскопия витальных срезов почки после 40-минутной ишемии и реперфузии. Окраска зондом А – DAF-2; Б – TMRE; В - совместное окрашивание зондом DAF-2 и TMRE. Оксид азота образуется в митохондриях эпителия почечных канальцев с сохраненным трансмембранным потенциалом (желтое свечение). Клубочек в процессе образования оксида азота не участвует.

Рис. 4. Распределение свечения TMRE и DAF-2 в клетках эпителия одного почечного канальца при 40-минутной ишемии и реперфузии. Пики интенсивности свечения обоих красителей совпадают, подтверждая, что основным источником генерации оксида азота являются митохондрии.

Таким образом, в сочетании с утратой способности к адекватному ресинтезу АТФ в раннем постишемическом периоде состояние митохондриального аппарата клеток может быть ключевым моментом, определяющим сохранность клеток почки после ишемического воздействия.

В дальнейшем наша работа была условно разделена на изучение и поиск возможных протекторных и регенерационных методов защиты почки от ишемического повреждения. В обоих разделах нами были использованы методики исследований позволяющие оценить происходящие функциональные и метаболические изменения в ишемизированных почках, в том числе конфокальная микроскопия с флуоресцентными зондами, магнито-резонансная томография, а также морфологические, биохимические и радиоизотопные методы исследования.

В клинической практике многие урологические заболевания сопровождаются развитием острого и хронического воспалительного процесса в почке, который в свою очередь, может оказывать влияние на выраженность постишемических функциональных расстройств.

Проведенное нами экспериментальное исследование показало, что острый пиелонефрит значительно ухудшает функциональное и метаболическое состояние почки в раннем постишемическом периоде, которое проявляется выраженной активацией процессов перекисного окисления липидов и достоверным снижением показателей клиренса креатинина и реабсорбции натрия (табл. 1) с этим в данных условиях значительно возрастает опасность развития функциональной недостаточности оперированной почки.

Таблица 1. Влияние острого пиелонефрита и тепловой ишемии на функциональные

показатели почек (кролика)

Показатель	Интактные почки	Почки с острым пиелонефритом без ишемии	Тепловая 40-минутная ишемия
Показатель	Интактные почки	Почки с острым пиелонефритом без ишемии	Без инфекции	На фоне острого пиелонефрита
Диурез (мл/мин)	0,24+0,4	0,06+0,01***	0,14+0,02*	0,02+0,01***
Клиренс креатинина (мл/мин)	3,45+0,31	2,07+0,26*	0,59+ 0,11***	0,73+0,15***
Реабсорбция натрия (%)	97+2	92+1*	83+2**	67+3***
Реабсорбция натрия (мЭкв/мин)	0,46+0,03	0,27+0,03*	0,07+0,01***	0,06+0,01***

Достоверность различий по отношении к интактным почкам: *- р >0,05 ; **- р >0,01; ***- р >0,001.

В то же время хронический пиелонефрит вне стадии обострения практически не влияет на выраженность постишемических функциональных расстройств (табл. 2), так как по всей видимости сохранившиеся функционально полноценные канальцы обладают повышенной устойчивостью к действию такого патогенного фактора, как острая тепловая ишемия. Механизм этого явления для нас остался неясным и требует дополнительного более углубленного исследования.

Таблица 2. Влияние хронического пиелонефрита и тепловой ишемии на функциональные

показатели почек (крысы)

Показатель	Интактные животные	Хронический пиелонефрит	Тепловая ишемия (40 минут)
	Интактные животные	Хронический пиелонефрит	Без инфекции	Хронический пиелонефрит
Выживаемость	100%	100%	100%	100%
Диурез (мл/сутки)	15,6 + 3,2	15,5 + 2,8	14,8 + 1,9	18,2 + 3,4
Креатинин крови (мкмоль/л)	59 + 3	65 + 2	55 + 2	67 + 2
Мочевина крови (моль/л)	5,9 + 0,3	8,1 + 0,2*	6,7 + 0,2	7,9 + 0,3
Клиренс креатинина (мл/мин/кг)	2,92 + 0,19	1,86 + 0,14*	2,87 + 0,11	2,8 + 0,19
Реабсорбция натрия (%)	99,5 + 0,1	99,3 + 0,12	99,4 + 0,1	99,2 + 0,1

Примечание: Достоверность разницы результатов: * - р < 0,05 по сравнению с интактными животными.

Если подходить к полученным результатам с практической точки зрения то можно предположить, что при операциях на почке, требующих пережатия почечных сосудов, у больных с пиелонефритом фактором риска существенного ухудшения функционального состояния органа после операции является только активный воспалительный процесс. В латентной стадии или в стадии ремиссии хронический пиелонефрит не утяжеляет функциональное состояние почки после вынужденной ее интраоперационной ишемии.

Следующим разделом нашей работы явилось изучение различных протекторных методов защиты почки от ишемического повреждения.

Одним из широко распространенных в клинической практике методов профилактики ишемического повреждения почки является ее локальное охлаждение, используемое в двух возможных вариантах – холодовая перфузия почки и как более простой вариант - методика наружного охлаждения органа, заключающаяся в интраоперационном обкладывания почки крошкой льда, что позволяет снизить ее температуру до +14 – +18⁰С. Мы в эксперименте исследовали происходящие метаболические процессы при обеих методиках холодовой защиты органа, а в клинике изучили именно эффективность методики наружного охлаждения почки у пациентов, которым выполняли резекцию почки.

Результаты экспериментов показали, что после 40 минут ишемии в условиях локальной гипотермии (+14 - +16⁰С), в отличие от тепловой ишемии той же длительности, основные показатели, характеризующие функциональное состояние почки (клиренс креатинина и канальцевая реабсорбция натрия) изменялись незначительно и быстро приходили к нормальным значениям (рис. 5).

Рис. 5. Динамика показателей клиренса креатинина (А) и реабсорбции натрия (Б) у кроликов после тепловой и холодовой локальной и перфузионной 40-минутной ишемии.

Таким образом, проведенные нами эксперименты показали определенные противоишемические возможности локальной гипотермии при интраоперационной защите почек.

Полученные экспериментальные данные были подтверждены проведенным пилотным клиническим исследованием, которое заключалось в изучении состояния митохондриального аппарата в биоптатах почки, взятых у больных во время операций (резекция почки) в начале и конце периода ишемии.

У пациентов, которым проводили локальное охлаждение почки имело место более выраженное сохранение функциональной полноценности митохондриального аппарата почечных канальцев (интенсивность флуоресценции TMRE) (рис. 6 А) и уменьшение окислительного стресса за счет подавления продукции свободных радикалов кислорода (флуоресценция DCF) (рис. 6 Б) по сравнению с группой пациентов, где операцию проводили в условиях тепловой ишемии почки.

Рис. 6. Динамика интенсивности флуоресценции TMRE (А) и DCF (Б) в зависимости от вида (тепловая или холодовая) ишемии почки оперированных пациентов.

Механизм протективного действия на почку умеренной (+14 - +16⁰С) гипотермии вероятно всего обусловлен снижением интенсивности клеточного метаболизма и замедлением развития процессов ишемического расстройства обмена веществ, а также повреждения мембранного аппарата клеток. Изученные нами сроки допустимого выключения почки из кровотока вполне могут устраивать урологов при некоторых ситуациях, когда не требуется длительного прерывания почечного кровотока, например, при секционной или парциальной нефролитотомии с удалением камней почек, при резекции почки.

Другим перспективным направлением профилактики ишемического повреждения почки, потенциально применимым в клинической практике, являются тренировочные методы. В частности нами было проведено исследование влияния ишемической тренировки (ИТ) почки и интервальной нормобарической гипоксической тренировки (ИНГТ) организма на выраженность постишемических метаболических и функциональных расстройств почки.

При анализе результатов проведенного исследования, можно отметить, что как ишемическая, так и гипоксическая тренировки способствуют повышению резистентности почек к ишемическому повреждению, проявляющееся в сохранении функциональных показателей почки на значениях, близких к норме (табл. 3), а также в меньшей активации продукции активных форм кислорода и оксида азота, а также в сохранении высокого потенциала митохондрий (рис. 7).

Таблица 3. Влияние ишемической тренировки почки и гипоксической тренировки организма на функциональные показатели ишемизированной (40 минут) почки (крысы).

Показатель	Интактные крысы	40 минут ишемии	ИНГТ + 40 минут ишемии	ИТ + 40 минут ишемии
Выживаемость	100%	100%	100%	100%
Диурез (мл/сутки)	15,6 + 3,2	15,3 + 2,6	12,8 + 2,2	7,3 + 0,7
Креатинин крови (мкмоль/л)	59 + 3	62 + 4	64 + 3	65 + 2
Натрий крови (ммоль/л)	137 + 2	141 + 2	136 + 2	138 + 1
Калий крови (ммоль/л)	4,6 + 0,1	4,4 + 0,2	5,3 + 0,2*^,^#	5,1 + 0,1*^,^#
Клиренс креатинина (мл/мин/кг)	2,92 + 0,19	2,09 + 0,21*	2,37 + 0,23	2,71 + 0,18^#
Реабсорбция натрия (%)	99,5 + 0,1	97,7 + 0,2*	98,9 + 0,2 ^#	99,9 + 0,1 ^#

Примечание: Достоверность разницы результатов: * - р <0,05 по сравнению с интактными животными; # - р <0,05 по сравнению с ишемией без тренировки.

Рис. 7. Интенсивность флуоресценции зондов TMRE, DCF, DAF-2 в эпителии почечных канальцев после 40 минутной тепловой ишемии с тренировкой и без нее.

Результаты этих экспериментов показали, что ведущими клеточными механизмами повышения толерантности почки к ишемии при гипоксической тренировке является сохранение энергопродуцирующей активности митохондрий в сочетании с большей сбалансированностью возможностей антиоксидантной защиты клеток и интенсивности продукции активных радикалов, а в случае ишемической тренировки это подавление избыточной продукции оксида азота в раннем постишемическом периоде, что также ведет к сохранению функциональной полноценности митохондрий и их АТФ-синтезирующей активности. Полученные нами данные о достоверном уменьшении синтеза оксида азота в раннем реперфузионном периоде при ишемической тренировки, при недостоверном влиянии на продукцию радикалов кислорода, в сочетании с высокой сохранностью функции почки в постишемическом периоде, возможно, свидетельствует о большей значимости избытка оксида азота в патогенезе ишемического повреждения, чем избытка кислородных радикалов, которые могут быть нейтрализованы антиоксидантной системой при достаточной ее мощности.

Неудовлетворенность эффективностью существующих на сегодня медикаментозных средств противоишемической защиты, заставляет проводить поиск новых препаратов. Так нами было исследовано противоишемическое действие лития хлорида, являющегося ингибитором фермента киназа-3β-гликогенсинтазы (GSK-3β), на котором замыкается ряд защитных сигнальных метаболических путей.

При этом было выявлено, что противоишемическая эффективность лития хлорида напрямую зависит от длительности ишемического воздействия на почку. При ишемии почки длительностью 60 минут и меньше лития хлорид оказывал выраженное протекторное действие, проявляющееся в сохранении активной флуоресценции митохондрий канальцевого эпителия и его морфологической структуры, а также в сохранении показателей мочевины крови, клиренс креатинина и реабсорбции натрия на уровне нормальных значений. В тоже время увеличение тепловой ишемии на срок более 60 минут значительно снижало эффективность действия данного препарата. В частности выживаемость животных снижалась в 2 раза, на фоне значительного угнетения показателей функции почки, но все же они были выше по сравнению с контролем (табл. 3).

Однако, следует учитывать, что в урологической практике ишемия почки такой длительности (90 минут и более), как правило, встречается лишь при ауто- или аллотрансплантации почки, однако в этих случаях всегда используют другие методы противоишемической защиты (охлаждение и промывание консервирующим раствором). По-видимому, включение в этот комплекс препаратов лития поможет в большей степени защитить почку от ишемического повреждения.

Таблица 3. Влияние хлорида лития на функцию почки после различных сроков ее тепловой ишемии.

Показатель	Интактные животные	60 мин. Ишемия – 3 сут.		90 мин. Ишемия – 3 сут.		90 мин. Ишемия – 7 сут.
Показатель	Интактные животные	Контроль	Литий	Контроль	Литий	Контроль	Литий
Выжива-емость	100%	100%	100%	20%	100%	0%	50%
Креатинин крови (мкмоль/л)	59 ± 3	145±11***	110±9***^,Х	600	445±32***^,ХХ	-	102±9***
Клиренс креатинина (мл/мин/кг)	2,92 ± 0,19	0,81±0,11***	3,63±0,34^ХХХ	0,02	0,26±0,03***^,Х	-	2,49±0,27
Реабсорбция натрия (%)	99,52 ± 0,06	99,11±0,08*	99,24±0,12	75,34	94,18±0,13***^,Х	-	98,66±0,20***

Примечание: *, **, *** - р < 0,05, p <0,01 и p < 0,001 по сравнению с интактными крысами;

- х, хх и ххх - р < 0,05, p <0,01 и p < 0,001 по сравнению с ишемией без введения лития.

Таким образом, результаты наших экспериментальных исследований продемонстрировали перспективность использования хлорида лития для противоишемической защиты почки. Целесообразно продолжить исследования с фармакопейными препаратами лития с целью возможного их использования в клинической практике.

Предварительный анализ данных проведенного, нами исследованная показал, что для профилактики острой постишемической почечной недостаточности важно обеспечить сохранение функциональной полноценности именно митохондрий клеток канальцев ишемизированной почки. На сегодня традиционно применяемые для этой цели являются препараты из группы антиоксидантов, при этом они, оказывая определенное протекторное действие, не могут в достаточной степени решить эту задачу.

В связи с этим, следующим этапом нашего исследования явилось исследование принципиально новой группы препаратов – митохондриально-ориентированных антиоксидантов – синтезированных в Институте физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, Московского государственного университета. Отличительной особенностью данной группы препаратов является их способность к избирательному накоплению в митохондриях в концентрации 1000-кратно превышающей концентрацию этих веществ в цитоплазме клетки.

Мы изучили эффекты 2 митохондриально-ориентированных антиоксидантов из этой группы препаратов - 10-(6-пластохинонил) децилтрифосфония (SkQ-1), 10-(6-пластохинонил) децилродамина (SkQR). Антиоксиданты вводили животным внутрибрюшинно за 24 часа до предполагаемой ишемии почки, так как данный срок введения используемых препаратов по результатам наших исследований являлся оптимальным для оказания их наибольшего антирадикального эффекта.

При сравнительной оценке противоишемического действия этих атиоксидантов было отмечено, что оба препарата увеличивают выживаемость экспериментальных животных после 90-минутной ишемии единственной почки с 18% до 90-95%, а по данным биохимического исследования эффективность SkQR оказалась несколько выше, чем SkQ-1 за счет большего защитного эффекта в отношении сохранности канальцевого аппарата почки, что проявилось в предупреждении нарушения реабсорбции натрия и уменьшении степени полиурии (рис. 8).

Рис. 8. Изменения показателей концентрации креатинина в крови (А) и клиренса креатинина (Б), после 90 минут ишемии единственной левой почки крысы.

При этом доза в 200 нмоль/кг оказалась более эффективной, чем доза 1 мкмоль/кг, что совпадало с выраженностью антирадикальной активности препарата.

Для сравнения эффективности действия митохондриально-ориентированных антиоксидантов с используемыми в клинике препаратами, мы в эксперименте сопоставили и оценили степень защиты препарата SkQR в дозе 200 нмоль и комплекса протиовоишемических препаратов пентоксифиллина и α-токоферола, эффективность которых доказана в клинических условиях у пациентов оперированных по поводу коралловидного нефролитиаза с пережатием почечных сосудов. Использование данного комплекса препаратов в клинике приводило к уменьшению выраженности ишемического повреждения почечных канальцев проявляющееся в ускорении нормализации гиперферментурии маркерных ферментов деструкции эпителия почечных канальцев (фермента щеточной каемки Ɣ-глутамил транспептидазы – ГГТП (рис. 9) и лизосомального фермента нейтральной α-глюкозидазы – НАГ) в раннем послеоперационном периоде (рис. 10), а также в сохранении дефицита секреции I¹³¹-гиппурана на дооперационном уровне (49±3% и 48±2% соответственно), тогда как у больных, оперированных без фармакологической защиты этими препаратами (контрольная группа), функция оперированной почки в этот же период достоверно ухудшалась (44±2 и 60±3% соответственно).

Рис. 9. Динамика активности Ɣ-глутамил транспептидазы в моче пациентов контрольной и исследуемой групп в послеоперационном периоде.

Рис. 10. Динамика активности нейтральной α-глюкозидазы в моче пациентов контрольной и исследуемой групп в послеоперационном периоде.

При сравнительном экспериментальном исследовании групп животных с применением препарата SkQR и комплекса препаратов пентоксифиллин и α-токоферол была показана более высокая эффективность митохондриально-ориентированного антиоксиданта, что проявлялось в лучшей сохранности функциональных показателей ишемизированной почки (табл. 4).

Поскольку комплекс (α-токоферол и пентоксифиллин) доказал свою клиническую эффективность, можно полагать, что SkQR имеет существенные перспективы внедрения в клинику при условии доведения его до категории фармакопейного препарата, разрешенного для клинического применения.

Новым направлением в поддержании функции поврежденной почки, как при остром, так и при хроническом ее повреждении, является стимуляция регенераторных процессов в органе с использованием клеточных технологий, в том числе стволовых клеток. Проведение исследований в этом направлении и явилось следующим этапом нашей работы.

Blog

Протекторная и регенерационная терапия при остром и хроническом повреждении почки 14. 00. 40 урология

Содержание