Синтез модифицированных природных хлорофиллов и изучение их свойств для бинарных методов терапии в онкологии 02. 00. 10 Биоорганическая химия

Вид материала

Автореферат

Содержание 2. Конъюгаты производных природных хлорофиллов с молекулами других классов 2.1. Реакция 1,3-диполярного циклоприсоединения в синтезе конъюгатов на основе хлоринов и бактериохлоринов In Book 1,3-Dipolar Cycloadditional Chemistry 2.1.1. Синтез гликоконъюгатов в ряду хлорофилла а 77 конденсировали с перацетами 1-О-(2-азидоэтил)-β-D-галактозы 79 2.1.2. “Click chemistry” в синтезе гликоконъюгатов на основе бактериопурпуринимидов 2.1.3. 1,3-Диполярное циклоприсоединение в синтезе борсодержащих конъюгатов 2.2. Кросс-метатезис олефинов 101 в данных условиях составил 40%, причем увеличение концентрации катализатора и/или аллилгалактозида 100 106, с аллилгалактозидом 100 2.3. Реакция Соногаширы в синтезе борсодержащих конъюгатов на основе природных хлоринов

Подобный материал:

• * Исследование физико-химических и сорбционных свойств синтезированных сорбентов, 26.1kb.
• Учебная программа курса по выбору по дисциплине «Биоорганическая химия» Специальность:, 174.53kb.
• Синтез и изучение химических свойств адамантилзамещенных эфиров кето- и дикетокарбоновых, 394.66kb.
• Методы модификации полимерных материалов углеродными наноструктурами, 35.19kb.
• Программа спецкурса «методы расчета физико-химических свойств веществ» для студентов, 40.47kb.
• Тематический план лабораторных занятий по дисциплине «общая химия, биоорганическая, 46.73kb.
• Учебно-методическая карта дисциплины, 62.2kb.
• Синтез и свойства биологически активных соединений, содержащих no-донорный фрагмент, 577.21kb.
• Программа «аналитическая химия» по направлению подготовки 020100 «Химия», 31.74kb.
• Изучение свойств нервной системы учащихся, 286.83kb.

2. Конъюгаты производных природных хлорофиллов с молекулами других классов

Использование известных ФС в клинике дает не плохие результаты, но применение этих веществ нередко связано с побочными эффектами. Исследования, направленные на изыскание путей снижения этих явлений, весьма актуальны. Одним из возможных путей повышения избирательности фотодинамического действия является присоединение к молекулам фотосенсибилизатора лигандов, для которых имеются специфические рецепторы на поверхности опухолевых клеток. Для подобных соединений характерна повышенная селективность связывания с поверхностью опухолевых клеток, что

приводит к увеличению эффективности фотодинамического действия и позволяет снизить

концентрацию препарата.


____________________________

⁵Спектральные свойства и фотоцитотоксичность производных Бхл а изучены д.б.н., проф. Феофановым А.В., ИБХ РАН.

Общая стратегия синтеза конъюгатов на основе производных Хл а и Бхл а представлена на Схеме 14. Первый вариант включает нуклеофильное раскрытие циклопентанонового кольца в феофорбиде а и региоселективное образование 13¹-амидов. В качестве нуклеофилов использовали алкилдиамины, аллиламин и пропаргиламин, получая таким образом пигменты с терминальными аминогруппой, двойной и тройной связями.



Схема 14. Методы синтеза конъюгатов.

Ключевыми соединениями во втором варианте синтеза являлись пурпурин 18 и бактериопурпурин, на основе которых были получены циклические имиды с якорными группами для присоединения молекул других классов, таких как моно- и дисахариды, борные кластеры.

Для реализации связывания таких лабильных объектов, как природные хлорины и бактериохлорины, с вышеназванными лигандами в настоящей работе были использованы реакции, отвечающие определенным требованиям, главные из которых – это доступность и простота получения исходных соединений, мягкие условия проведения реакций и высокий выход целевого продукта. Такими реакциями являются:

- Cu-катализируемая реакция 1,3-диполярного циклоприсоединения терминальных алкинов с азидами;

- реакция кросс-метатезиса олефинов с использованием катализатора Граббса второго поколения;

- Pd-катализируемая реакция образования C-C связей между арил- или винилгалогенидами и терминальными алкинами;

- реакция нуклеофильного раскрытия 1,4-диоксанового кольца в оксониевых производных субстратов.


2.1. Реакция 1,3-диполярного циклоприсоединения в синтезе конъюгатов на основе хлоринов и бактериохлоринов

Реакция циклоприсоединения [3+2] между азидами и алкинами с терминальной тройной связью (Huisgen R. In Book 1,3-Dipolar Cycloadditional Chemistry, 1984) универсальна и используется для создания сложных биоконъюгатов, иммобилизации биомолекул на матрицах различной природы и присоединения лекарств к адресным системам доставки. Широкому применению вышеописанной реакции для нужд биологической и фармацевтической химии способствовало значительное увеличение ее скорости за счет использования соединений Сu(I) в качестве катализатора. Кроме того, последний способствует региоселективному протеканию реакции с образованием 1,4-дизамещенных 1,2,3-триазолов.

Нами разработана универсальная схема синтеза конъюгатов хлорина е₆, пурпуринимида и бактериопурпуринимида с остатками углеводов и борными кластерами, в которой ключевой стадией является “click” реакция между ацетиленовыми производными природных хлоринов и бактериохлоринов, с одной стороны, и азидами сахаров и борных полиэдров, с другой стороны.

2.1.1. Синтез гликоконъюгатов в ряду хлорофилла а

Известно, что раковые клетки обладают высокой экспрессией галектинов (например, Галектин – 1, Галектин - 3) – белков, имеющих углевод-узнающий домен с высокой аффинностью к β-галактозидам. Поэтому углеводные заместители в хлоринах и бактериохлоринах способны обеспечить векторную направленность доставки ФС внутрь раковой клетки посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза.

В настоящей работе синтезированы углеводсодержащие ФС на основе производных Хл а и Бхл а с остатками галактозы и лактозы.

В качестве ключевого соединения в синтезе хлоринового гликоконъюгата был использован метилфеофорбид а 76, из которого с выходом 86% получено производное хлорина е₆ с терминальной тройной связью 77 (Схема 15).





Схема 15. Синтез гликоконъюгатов в ряду производных хлорофилла а.


Структура последнего подтверждена набором ЯМР экспериментов. Сигнал этинильного протона проявляется в виде триплета при 2.39 м.д., а протоны метиленовой группы пропаргильного остатка - в виде мультиплета при 4.50 м.д., давая корреляцию в спектре COSY с соседним NH-протоном амидной группы и протоном при тройной связи.

Производное 77 конденсировали с перацетами 1-О-(2-азидоэтил)-β-D-галактозы 79 и 1-О-(2-азидоэтил)-β-D-лактозы 80.⁶ Реакция циклоприсоединения проводилась в ___________________________________

⁶Модифицированные углеводы синтезированы в лаборатории д.х.н., проф. Себякина Ю.Л., МИТХТ им. М.В. Ломоносова

присутствии 10 мол. % иодида меди (I). В течение первых 10 мин. происходило образование Cu-комплекса хлорина, сопровождающееся гипсохромным смещением длинноволновой полосы поглощения пигмента с 663 до 635 нм.

Поэтому в дальнейшем нами был реализован иной подход к синтезу углеводсодержащих хлоринов, основанный на использовании Zn–комплекса амида 78 и получении соответствующих гликоконъюгатов 81 и 82. Было показано, что Zn-комплекс хлорина е₆ в условиях реакции является достаточно устойчивым и не подвергается замещению на ион меди. Подобная «защита» катионом Zn²⁺ c последующим деметаллированием в слабо кислой среде позволила получить конъюгаты 83 и 84, деблокирование защитных ацетильных групп в которых давало галактозилхлорин 85 и лактозилхлорин 86 с выходами 90 и 85% соответственно.

Структура гликохлоринов 83 и 84 установлена с помощью одно- и двумерной спектроскопии ЯМР, включая надежное доказательство региоспецифического образования 1,4-дизамещенного триазола методом ROESY.

Введение углеводного фрагмента в молекулу хлорина заметно повысило гидрофильность последнего, а в случае лактозилхлорина 86 привело к водорастворимому соединению.


2.1.2. “Click chemistry” в синтезе гликоконъюгатов на основе бактериопурпуринимидов

Переход к гликоконъюгатам в ряду производных Бхл а обусловлен поиском ФС с улучшенными спектральными характеристиками. Полученные нами ранее бактериопурпуринимиды показали высокую химическую стабильность, а батохромный

сдвиг Q_y-полосы в область 820-835 нм делает их перспективными кандидатами в качестве

ФС для ФДТ рака.

В настоящей работе описанный выше подход к синтезу гликоконъюгатов в ряду природных хлоринов был успешно реализован для получения гликоконъюгатов на основе бактериопурпуринимида с модифицированной лактозой (Схема 16).

В предложенной схеме использовался второй вариант синтеза, когда ключевым соединением являлся бактериопурпурин 8, из которого получены циклоимиды с пропаргильным заместителем в разных положениях макроцикла. Дело в том, что наличие в молекуле БП двух высокоэлектрофильных центров (ацетильной группы и ангидридного экзоцикла) приводит к неоднозначному протеканию реакции с пропаргиламином и образованию наряду с циклоимидом 87 также диалкинильного продукта 88. Было показано, что изменение количества пропаргиламина и времени реакции позволяет влиять на соотношения продуктов 87 и 88. Так, кипячение в хлороформе метилового эфира БП с 8-кратным избытком пропаргиламина в течение 16 ч приводило к получению циклоимида 87 с выходом 60% и основания Шиффа 88 с выходом 20%. Увеличение избытка пропаргиламина (40 экв.) и продолжительности реакции до 40 ч приводило преимущественно к образованию дипропаргильного производного 88. Последующее хроматографическое разделение реакционной смеси позволило выделить циклоимиды 87 и 88, которые далее вводили в реакцию с азидным производным лактозы 89, полученным последовательным ацилированием перацетата аминолактозида глицином и азидоуксусной кислотой.⁷

Схема 16. Синтез углеводсодержащих производных бактериопурпуринимида.

___________________________

⁷Лактозильное производное 89 синтезировано в лаборатории д.х.н., проф. Книреля Ю.А., ИОХ РАН.

Реакция циклоприсоединения протекала аналогично описанной для хлорина, однако образование Cu-комплекса бактериопурпуринимида в ходе реакции не наблюдалось, что согласуется с известным фактом в химии порфиринов, согласно которому легкость образования металлокомплексов падает в ряду порфирины – хлорины – бактериохлорины. Гликоконъюгат 90 был получен с 80%-ным выходом.

Синтез бактериопурпуринимида, содержащего в молекуле два остатка лактозы, осуществляли на основе циклоимида 88. Для этого последний восстанавливали боргидридом натрия с образованием смеси диастереомеров, которые затем вводили в реакцию сочетания с лактозидом 89. В результате был получен конъюгат 92 с выходом 70%.

Для направленного введения углеводного фрагмента в пиррольный цикл А в качестве

исходного соединения был использован N,N-диметиламинобактериопурпуринимид, кипячение которого с пропаргиламином в хлороформе привело к образованию соответствующего основания Шиффа, которое затем было восстановлено боргидридом натрия. Образовавшуюся смесь диастереомеров вводили в сочетание с азидным производным перацетата лактозы 89, что приводило к конъюгату 94 с выходом 83%.

Удаление защитных ацетильных групп в соединениях 90, 92 и 94 позволило впервые получить высокогидрофильные углеводсодержащие конъюгаты 91, 93 и 95 в ряду природных бактериохлоринов.

В спектрах ЯМР лактозилбактериопурпуринимидов 90, 92 и 94 были выделены сигналы, относящиеся к макроциклу, триазолу и углеводному фрагменту, что позволило не только

надежно установить структуру соединений, но и таутомерные формы и конформации.

Оценка фотоиндуцированной активности полученных углеводсодержащих хлоринов и бактериохлоринов, которая проводилась на линии трансформированных клеток Hep2 (эпидермоидная карцинома гортаноглотки), показала, что наиболее активны гликоконъюгаты в ряду производных хлорофилла а 85 и 86 (Табл. 1). В целом малоактивными оказались производные бактериопурпуринимида, при этом расположение углеводного остатка в макроцикле определенным образом влияет на фотоцитотоксичность соединений. Бактериопурпуринимид с дисахаридным остатком в пирроле А 95 обладает средней активностью (IC₅₀=2.24 мкМ), тогда как введение углевода в экзоцикл 91 или наличие двух остатков дисахарида 93 делает пигменты неактивными.

Низкая активность гликоконъюгатов природных хлоринов и бактериохлоринов (ниже, чем у негликозилированного хлорина е₆ (IC₅₀=0.16 мкМ) может быть связана с высокой гидрофильностью полученных пигментов и присутствием в структуре триазольного гетероцикла.

Таблица 1. Результаты биологических испытаний in vitro гликоконъюгатов хлорина е₆ и бактериопурпуринимида.

№ соединения	Тип макроцикла	Тип углеводного фрагмента	ИК50 (мкМ)
85	Хлорин e6	Gal	0.8
86	Хлорин e6	Lac	0.97
95	Бактериопурпуринимид	3-Lac	2.24
91	Бактериопурпуринимид	132-N-Lac	___
93	Бактериопурпуринимид	ди-Lac	___
99	Триметиловый эфир хлорина е6 (схема 2)	___	0.16

2.1.3. 1,3-Диполярное циклоприсоединение в синтезе борсодержащих конъюгатов

Уникальное свойство тетрапиррольных соединений селективно накапливаться в раковой ткани делает их привлекательными транспортными системами как для направленной доставки борных кластеров в опухоль, так и для комбинированной ФДТ и БНЗТ рака, что несомненно должно повысить результативность противоопухолевой терапии. С этой точки зрения особый интерес представляют фотосенсибилизаторы на основе природных хлорофиллов с интенсивным поглощением в ближней ИК-области спектра. В качестве борсодержащих фрагментов были использованы полиэдрические соединения бора - производные клозо-додекаборат аниона [B₁₂H₁₂]^2- и аниона бис(дикарболлид)кобальта [3,3’-Co(1,2-C₂B₉H₁₁)₂]^-.

При синтезе борсодержащих конъюгатов хлоринов мы использовали реакцию 1,3-диполярного циклоприсоединения между азидами и алкинами с терминальной тройной связью, хорошо зарекомендовавшую себя при получении гликоконъюгатов.

Исходный цинковый комплекс хлорина е₆ с терминальной тройной связью 78 в присутствии солей одновалентной меди обрабатывали азидами, полученными путем раскрытия азидом натрия диоксанового кольца в оксониевых производных бис(дикарболлид)кобальта [8-O(CH₂CH₂)₂O-3,3’-Co(1,2,-C₂B₉H₁₀)(1’,2’-C₂B₉H₁₁)] А и клозо-додекабората [O(CH₂CH₂)₂O-B₁₂H₁₁] Б (Схема 17). После деметаллирования продуктов реакции были получены конъюгаты 96 и 97 с выходами 60 и 68%.




Схема 17. Синтез борсодержащих конъюгатов методом 1,3-диполярного циклоприсоединения.


Биологические испытания полученных конъюгатов, выполненные на клетках аденокарциномы легкого человека А549, показали, что внутриклеточная концентрация соединений 96 и 97 недостаточна для эффективного фотодинамического разрушения клеток, что ограничивает использование подобных конъюгатов в ФДТ и БНЗТ рака.


2.2. Кросс-метатезис олефинов

в синтезе гликоконъюгатов на основе хлорофилла а

В настоящей работе нами предложен новый эффективный метод синтеза гликоконъюгатов в ряду производных Хл а с использованием реакции кросс-метатезиса алкенов. В главе 2.1.2. было показано, что введение углеводных остатков в различные положения хлоринового макроцикла по-разному влияет на амфифильность молекулы и, как следствие, на биологические свойства пигмента. В частности, гидрофильные заместители в пиррольном кольце А значительно увеличивают фотодинамическую эффективность ФС.

Наличие винильной группы у производных Хл а упрощает получение гликозилированных хлоринов с использованием реакции кросс-метатезиса алкенов, которая заключается в перераспределении алкилиденовых групп между двумя олефинами в присутствии карбеноидных комплексов металлов. Высокоактивный и стабильный рутениевый катализатор Граббса второго поколения 98 позволил нам использовать реакцию кросс-метатезиса для такого малоактивного алкена, каким является хлорин е₆ 99 (Схема 18). Последний вводили в реакцию сочетания с тетраацетатом аллил-β-D-галактопиранозида 100, полученным гликозилированием аллилового спирта. Изучение данного взаимодействия показало, что оптимальными условиями проведения реакции является кипячение хлорина 99 с четырехкратным избытком аллилгалактозида 100 в хлористом метилене в течение 16 часов в присутствии 25 мол. % катализатора.





Схема 18. Реакция кросс-метатезиса олефинов в синтезе углеводсодержащих хлоринов и пурпуринимидов.


Выход гликоконъюгата 101 в данных условиях составил 40%, причем увеличение концентрации катализатора и/или аллилгалактозида 100 не оказывало влияния на степень конверсии исходного хлорина 99. Данное взаимодействие протекает стереоселективно с образованием двойной связи Е- конфигурации и характеризуется отсутствием побочных продуктов, что упрощает хроматографическую очистку целевого продукта и позволяет регенерировать исходный хлорин 99 для повторного использования.

Другим местом связывания хлоринового макроцикла с остатком углевода служила аллильная группа в пиррольном кольце С соединения 103, которую вводили путем раскрытия экзоцикла Е мезофеофорбида под действием аллиламина. Гидрирование винильной группы в пиррольном кольце А феофорбида 76 до этильной диктовалось необходимостью региоселективного введения углеводного фрагмента в положение 13 макроцикла. Взаимодействие аллиламида 103 с тетраацетатом аллил-β-D-галактопиранозида 100 в соотношении 1:5 в присутствии 5 мол. % катализатора Граббса в течение 4 часов давало конъюгат 104. Избыток одного из реагентов необходим для смещения равновесия в сторону образования продукта реакции, так как из литературы известно, что аллильные производные в условиях реакции кросс-метатезиса могут образовывать гомодимеры. Следует отметить, что в данном случае реакция протекала с меньшей стереоселективностью по сравнению с винильной группой в пиррольном цикле А, и наблюдалось образование двух изомеров E/Z соединения 104 с соотношением 5:1 (по данным ЯМР) с общим выходом 80%. Нам удалось разделить изомеры с помощью препаративной тонкослойной хроматографии и выделить основной продукт (Е-изомер), обладающий меньшей хроматографической подвижностью.

Следующий этап работы состоял в синтезе гликоконъюгатов на основе пурпуринимидов с использованием реакции кросс-метатезиса. Переход к пигментам, поглощающим в области 700 нм, обусловлен высокой эффективностью их использования в фотомедицине. Нами была разработана схема региоселективного введения углеводного фрагмента в макроцикл пурпуринимидов, аналогичная превращениям хлорина е₆. Однако попытки проведения реакции кросс-метатезиса с участием винильной группы циклоимида 109 не дали положительного результата даже при использовании большого избытка аллилгалактозида 100, длительном кипячении реакционной смеси или увеличении количества катализатора Граббса вплоть до 1 эквивалента.

Более успешным оказался путь, включающий кросс-сочетание аллилмезопурпуринимида, полученного из мезопурпурина 106, с аллилгалактозидом 100, приводящий к конъюгату 107 с соотношением E/Z-изомеров 6:1. Основной Е-изомер был выделен с выходом 62%.

Удаление защитных ацетильных групп в соединениях 101, 104 и 107 под действием метоксида натрия в системе MeOH/CH₂Cl₂ приводило к гликоконъюгатам 102, 105 и 108 с выходами 65-85%.

Биологические испытания in vitro полученных гликоконъюгатов, проведенные на линии клеток Hep2, позволили нам сделать два основных вывода:

- все галактозилхлорины, полученные реакцией кросс-метатезиса и содержащие двойную связь в спейсере, оказались более активными по сравнению с группой гликоконъюгатов, имеющих замещенный триазольный цикл (гл. 2.1.2);

- среди хлоринов с остатком галактозы в разных положениях макроцикла наиболее высокую фотоиндуцированную активность проявил гликоконъюгат 102 с углеводным фрагментом в пирроле А (IC₅₀=0.02 мкМ), что в 8 раз выше, чем у негликозилированного триметилового эфира хлорина е₆ 99 (IC₅₀=0.16 мкМ).


2.3. Реакция Соногаширы в синтезе борсодержащих конъюгатов на основе природных хлоринов

Особый интерес среди реакций, используемых для получения конъюгатов тетрапиррольных соединений с молекулами других классов, представляет палладий катализируемая реакция образования С-С связи между арилгалогенидами и терминальными алкинами в присутствии или без добавления солей меди (I) в качестве сокатализатора (реакция Соногаширы).

В настоящей работе нами получены новые борсодержащие конъюгаты на основе алкинилированного кобальт бис(дикарболлид) аниона и п-иодфенильных производных хлорина е₆ и пурпуринимида по реакции Соногаширы (Схема 19). Борную субъединицу 117, содержащую концевую ацетиленовую группу, связанную с борным полиэдром гибким гидрофильным спейсером, получали действием 2-пропин-1-илата натрия на оксониевое производное бис(дикарболлид) кобальта 29. Хлориновые компоненты для реакции Соногаширы в виде п-иодфенильных производных 112 и 115 получали ацилированием аминосодержащих хлоринов 111 и 114 хлорангидридом п-иодбензойной кислоты. Реакцию проводили в атмосфере аргона в смеси бензола и диизопропилэтиламина в соотношении 5:1 в течение 48 часов. В качестве катализатора использовали трис(дибензилиденацетон) дипалладий (0) с трифенилфосфином. Для предотвращения возможности встраивания катиона меди в хлориновый макроцикл был реализован вариант реакции Соногаширы без солей Cu (I). Конъюгаты 113 и 116 получены с выходами 61 и 69%, соответственно, и их структура подтверждена спектральными характеристиками.





Схема 19. Получение борсодержащих конъюгатов на основе производных хлорофилла а по реакции Соногаширы.

Борсодержащие конъюгаты 113 и 116 являются гидрофобными соединениями. Они хорошо растворяются в органических растворителях и не растворимы в воде. Для исследования этих конъюгатов in vitro при приготовлении растворов был использован биологически совместимый солюбилизатор Кремофор EL (CrEL), который обеспечивает в водных растворах стабилизацию мономерной формы различных гидрофобных тетрапиррольных соединений. Способность хлорина е₆ флуоресцировать в красной области спектра в составе конъюгатов позволяет использовать флуоресцентную микроскопию для изучения взаимодействий соединений 113 и 116 с раковыми клетками.

Методом лазерной сканирующей конфокальной микроскопии установлено, что конъюгаты проникают в клетки А549 аденокарциномы легкого человека и накапливаются в цитоплазме. При этом в обоих соединениях наблюдается сходное внутриклеточное распределение - концентрирование в гранулярных клеточных структурах субмикронного размера. При этом они не проникают в ядро клетки и не накапливаются в плазматической мембране. Оказалось, что конъюгаты 113 и 116 обладают низкой фотоиндуцированной цитотоксичностью, однако выполняют свою основную задачу – доставляют в раковые клетки кластеры бора, необходимые для БНЗТ.