Российская академия наук Программа фундаментальных исследований Президиума ран фундаментальные науки – медицине

Вид материала

Содержание

Белки растительного происхождения как ингибиторы тромбогенеза
Разработка набора биологически активных веществ и оценка его эффективности при тяжелых повреждениях печени
Цель проекта
Задачи проекта

Подобный материал:

1 ... 40 41 42 43 44 45 46 47 ... 74

БЕЛКИ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ КАК ИНГИБИТОРЫ ТРОМБОГЕНЕЗА

С.Д. Варфоломеев, М.А. Розенфельд, Е.А. Костанова

Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН, Москва

Процесс свертывания крови осуществляется последовательно протее-кающими ферментативными реакциями, заканчивающимися генерацией тромбина, который превращает растворимый фибриноген в фибриновый гель и одновременно с этим активирует фибринстабилизирующий фактор (ФXIIIa). Последний катализирует образование ε-(γ-глутамил)лизиновых перекрестных связей в α- и γ- полипептидных цепях молекул фибрина. В связи с отсутствием физиологических ингибиторов неконтролируемое повышение ферментативной активности ФXIIIa обусловливает возникновение тяжелых видов коагулопатий.

Методом аффинной хроматографии на сорбенте КМ-химопапаин-сефароза 4В был выделен комплекс ингибиторов природного происхождения из клубней картофеля Solanum tuberosum, подавляющий транспептидазную активность фермента. Белковый препарат относится к классу ингибиторов цистеиновых протеиназ (ИЦП) и способен блокировать активность ФXIIIa прямым воздействием на его существенную сульфгидрильную группу.

Методом ВЭЖХ комплекс ингибиторов был разделен на пять основных отдельных белковых компонентов: высокомолекулярных с массами: ~ 80 и 65 кДа; низкомолекулярных с массами: ~36, 25 и 22 кДа. Методом рэлеевского светорассеяния показано, что все белковые компоненты за исключением ингибитора с м.м. 80 кДа образуют с фибринстабилизирующим фактором эквимолярный комплекс, что обусловливает ингибирующее действие белков ИЦП. Это подтверждено прямым методом флуоресцентного электрофореза, где выявлено подавление ферментативной транспептидазной активности ФXIIIa в присутствии вышеуказанных ИЦП.

Методом электрофореза восстановленных образцов перекрестно-сшитого фибрина установлено, что белки с молекулярными массами 65, 36, 25, и 22 кДа соответственно ингибируют скорость процессов γ-диме-ризации и α-полимеризации полипептидных цепей фибрина. Турбидиметрическим методом выявлена повышенная чувствительность фибринового геля в присутствии ингибиторов к гидролитическому действию плазмина.

Также показано, что ингибиторы снижают ферментативную активность фибринстабилизирующего фактора в плазме крови доноров и больных.

РАЗРАБОТКА НАБОРА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ И ОЦЕНКА ЕГО ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИ ТЯЖЕЛЫХ ПОВРЕЖДЕНИЯХ ПЕЧЕНИ

И.В. Урываева ¹⁾, Э.И. Гальперин ²⁾, Р.И. Атауллаханов ³⁾, Т.Г.Дюжева ²⁾, Л.В. Платонова ²⁾, Н.Н. Ионочкина ²⁾, М. Кочергин ²⁾, А.В.Пичугин ³⁾, Т.М. Мельникова ⁴⁾, Г.В. Делоне¹⁾

¹⁾Институт биологии развития РАН, ²⁾Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова, ³⁾ Институт иммунологии МЗ, ⁴⁾ Институт органической химии РАН

Несмотря на выраженную способность печени к регенерации и восстановлению лечение некоторых заболеваний печени требует усиления ее регенераторной и функциональной активности, что связано с продукцией различных эндогенных факторов, обладающих активностью, направленной на стимуляцию размножения клеток паренхимы. Многочисленными экспериментальными исследованиями, проведенными нами, показана возможность стимуляции регенерации поврежденной печени (Гальперин Э.И. и др., 1985-2005).

Цель проекта: создать для лечения повреждений печени лекарственный препарат, состоящий из набора естественных индукторов регенерации печени, образующихся в органе в период регенерации.

Задачи проекта – выделить из ткани неонатальной печени набор биологически активных веществ, обладающих регенерирующей активностью, и установить их природу и основные физико-химические свойства.

Результаты. Получен экстракт из печени 2-3-дневного поросенка с использованием оригинальной технологии, основанной на гомогенизации ткани печени с дистиллированной водой, центрифугировании, прогре-вании, осаждении этанолом, удалении спирта упариванием. Для удаления из экстракта балластных веществ и выделения активной фракции, содер-жащей естественные индукторы регенерации, использовали несколько фракционирующих приемов – диализ, осаждение сульфатом аммония. Наиболее эффективным оказался диализ через мембрану с пределом эксклюзии 12КД, позволивший получить две фракции: диализат (остаток в мешке) и маточник (вне мешка) в весовом соотношении 1:10. Эффект воздействия экстракта и фракций на поврежденную печень изучали на экспериментальной модели токсического повреждения печени мышей тиоацетамидом (ТАА, 250 мг/кг), оценивая изменение активности АСТ и АЛТ в сыворотке крови опытных животных по сравнению с контроль-ными. Активность АСТ и АЛТ в сыворотке крови мышей с токсическим повреждением печени после введения экстракта из печени поросенка (2,3 мг белка на мышь) была наибольшей через 48 ч после введения ТАА и cоставила 65±8 % и 68±9 % (p<0,05) (n=23) по сравнению с контролем, соответственно. Активность АСТ и АЛТ в сыворотке крови эксперимен-тальных мышей после введения диализата (1,15 мг белка на мышь) составила 52 и 53 % (p<0,05) по сравнению с контролем, соответственно. Маточник был неактивен. Высаживание полимерных фракций в экстракте сульфатом аммония приводило к потере активности как в осадке, так и маточнике. Изучены физико-химические свойства экстракта и диализата. Экстракт не терял своей активности при нагревании при 40-45 в течение 1 часа, при концентрировании раствора, при лиофильной сушке с по-следующим растворением сухой массы, а также при хранении при комнатной температуре в течение 4 суток, в последнем случае активность даже увеличивалась. Анализ диализата на жидкостном хроматографе на колонке TSK-50S показал, что он гомогенен по молекулярной массе, име-ет один пик, а маточник гетерогенен – более 5 пиков. Молекулярная масса активного вещества находится в пределах 80-20 КД. Количественный анализ на белок показал, что активная фракция на 99 % состоит из белка.

Выводы. Получен экстракт из печени 2-3-дневного поросенка, обладающий регенерирующей эффективностью в процессе восстановления поврежденной печени. Проведена частичная очистка комплекса биологически активных веществ, установлена их принципиальная природа и изучены физико-химические свойства. Планируется дальнейшая очистка по химическим свойствам комплекса биологически активных веществ, обладающих регенерирующей активностью, идентификация известных индукторов в составе набора веществ, определение их концентрации и в дальнейшем искусственный синтез их копии для реконструкции комплекса веществ.

Blog