Российская академия наук Программа фундаментальных исследований Президиума ран фундаментальные науки – медицине

Вид материала

Программа

Содержание Исследование биофизических механизмов агрегации кристаллинов, индуцированной импульсным лазерным уф излучением 308 нм В.В.Немов, Ю.В.Сергеев, М.А.Островский им. И.Н. Блохиной Национальный институт глаза Национального института здоровья США

Подобный материал:

• Российская академия наук Программа фундаментальных исследований Президиума ран фундаментальные, 9808.28kb.
• Распоряжение Президиума ран от 23 сентября 2008 г. №10104-653 "Об утверждении Порядка, 422.29kb.
• Тезисы докладов, 4952.24kb.
• Тезисы докладов, 3726.96kb.
• Программа фундаментальных исследований Президиума ран фундаментальные науки медицине, 320.86kb.
• Программа фундаментальных исследований Президиума ран, 3259.61kb.
• Программа фундаментальных исследований президиума ран «Биоразнообразие» 2005-2008,, 173.94kb.
• Программа отчетной конференции по программе фундаментальных исследований Президиума, 123.52kb.
• Всероссийский симпозиум «Экология мегаполисов: фундаментальные основы и инновационные, 8.63kb.
• Научный журнал "Вопросы филологии" Оргкомитет: Сопредседатели, 47.73kb.

ИССЛЕДОВАНИЕ БИОФИЗИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ АГРЕГАЦИИ КРИСТАЛЛИНОВ, ИНДУЦИРОВАННОЙ ИМПУЛЬСНЫМ ЛАЗЕРНЫМ УФ ИЗЛУЧЕНИЕМ 308 НМ

Л.В.Соустов¹⁾, Е.В.Челноков¹⁾, Н.В.Сапогова¹⁾, Н.М.Битюрин¹⁾,

В.В.Немов²⁾, Ю.В.Сергеев³⁾, М.А.Островский⁴⁾

¹⁾ Институт прикладной физики РАН, Нижний Новгород.

²⁾ Нижегородский НИИ эпидемиологии и микробиологии

им. И.Н. Блохиной

³⁾Национальный институт глаза Национального института здоровья США

⁴⁾Институт биохимической физики им. Н.М. Эммануэля РАН, Москва

За время работы по Программе (с 2002 года) нами проведены исследования УФ-индуцированной агрегации модельного белка карбоангидразы и основных белков хрусталика глаза человека: альфа-, бета- и гамма-кристаллинов. Выявлена нелинейная зависимость скорости агрегации этих белков от режимов облучения импульсного XeCl лазера (308 нм). Построена теоретическая модель, в которой принято, что начальный процесс фотоагрегации обусловлен образующимися молекулами с удвоенной массой и происходит как при взаимодействии фотоактивированных молекул белка, так и фотоактивированных молекул с исходными. Первый процесс доминирует при лазерном облучении, а второй может преобладать при воздействии на хрусталик глаза естественного солнечного света. Исследовано влияние некоторых короткоцепочечных пептидов на скорость фотоагрегации кристаллинов. Определена комбинация пептидов (мы назвали её «новый препарат»), которая в большей степени замедляет агрегацию кристаллинов (и тем самым замедляет развитие фотокатаракты), чем вещества, на основе которых созданы известные антикатарактальные препараты. «Новый препарат» прошел испытания в НИИ глазных болезней РАМН и показал положительный результат в замедлении развития УФ-индуцированной катаракты у крыс.

По проекту 2007 года исследована фотоагрегация карбоангидразы и бета L-кристаллина с использованием обнаруженного нами эффекта постагрегации – процесса образования больших конгломератов после окончания воздействия на растворы белков различными, в том числе и малыми УФ дозами. Эффект состоит в том, что если после облучения раствора белка некоторой УФ дозой (обозначим ее D₀) прекратить воздействие УФ, то мощность рассеянного излучения пробного пучка продолжает увеличиваться, что обусловлено образованием высокомолеку-лярных агрегатов в отсутствие УФ излучения. При этом зависимости мощности рассеянного излучения от величины D₀ существенно различны для растворов карбоангидразы и бета L-кристаллина. Возможно, это связано с различными механизмами образования агрегатов в этих белках, например, из-за различия их структур (в нативном состоянии молекула карбоангидразы является мономером, а у бета L-кристаллина – димером). Характер поведения рассеянного излучения пробного пучка после прекращения УФ облучения существенно зависит от величины D₀, то есть от размеров и концентрации агрегатов, образовавшихся за время воздействия УФ излучения. При малых УФ дозах рассеянное излучение появляется с некоторой задержкой Т, которая растет с уменьшением величины D_0. Получена зависимость Т(D₀), которая при уменьшении D₀ до некоторого значения D*_0. стремится к бесконечности. Величина D*_0. может быть определена как «безопасная доза» УФ воздействия, после которой концентрацию вновь образующихся агрегатов можно считать пренебрежимо малой.

Построена теоретическая модель реакционно-контролируемой УФ-индуцированной агрегации белков, учитывающая взаимодействие агрегатов всех размеров. Для оценки величины рассеяния пробного пучка в растворах белков применялась теория Ми. При этом предполагалось, что частицы белка имеют сферическую форму и рассеивают независимым образом. Построенная модель позволяет хорошо описывать имеющиеся экспериментальные зависимости рассеянной мощности от дозы облучения, а также эффект постагрегации.

Однако они существенно отличаются по структуре и по молекулярной массе. Альфа-кристаллины являются шаперонами, а бета- и гамма-кристаллины относятся к одному и тому же семейству белков. изучению обнаруженного нами эффекта постагрегации – процесса образования больших конгломератов после окончания воздействия на раствор бета-кристаллина различными, в том числе и малыми УФ дозами. Эффект состоит в том, что если после облучения раствора белка некоторой УФ дозой (обозначим ее D₀) прекратить воздействие УФ, то интенсивность рассеянного излучения пробного пучка продолжает увеличиваться, что обусловлено образованием высокомолекулярных агрегатов в отсутствие УФ излучения. Характер поведения рассеянного излучения пробного пучка после прекращения УФ облучения существенно зависит от величины D₀, то есть от размеров и концентрации агрегатов, образовавшихся за время воздействия УФ излучения. При малых УФ дозах рассеянное излучение появляется с некоторой задержкой Т, которая растет с уменьшением величины D_0. Этот эффект мы исследуем во всех кристаллинах хрусталика глаза, а также в их смесях. В результате будет определена «безопасная доза» УФ воздействия, после которой концентрацию вновь образующихся агрегатов можно считать пренебрежимо малой. Будет построена теоретическая модель, описывающая процесс образования высокомолекулярных комплексов на различных этапах фотоагрегации белков.

Воздействие различных денатурирующих факторов, например, ультрафиолетового (УФ) излучения или высоких температур, способно вызывать агрегацию кристаллинов. В результате агрегации образуются крупные светорассеивающие конгломераты, которые приводят к помутнению хрусталика, то есть к развитию катаракты. Катаракта является наиболее распространенной причиной потери зрения. В настоящее время во всем мире около 20 млн. человек страдают катарактой, а ее удельный вес в структуре глазной заболеваемости по данным ВОЗ составляет 42 %. Для лечения этой патологии используются хирургические методы – удаление помутневшего хрусталика и имплантация эластичной интраокулярной линзы. Эти методы хорошо разработаны, однако и они не лишены некоторых недостатков. В связи с этим весьма актуальной задачей остаётся поиск консервативных методов для возможной профилактики развития катаракты. Что касается исследования физических механизмов образования агрегатов в кристаллинах при УФ облучении, то к настоящему времени в литературе информация об этом практически отсутствует. В известных нам работах в основном исследуются фотохимические процессы (см., например [Корхмазян М.М., Федорович И.Б., Островский М.А. Механизмы фотоповреждения структур глаза. Действие УФ-света на растворимые белки хрусталика. // Биофизика. 1983. Т. 28. С. 966-967.

Ельчанинов В.В., Федорович И.Б. Механизмы фотоповреждения структур глаза. Образование агрегатов полипептидов при УФ-облучении белков хрусталика. // Биофизика. 1989. Т. 34. С. 758-762. Ельчанинов В.В., Федорович И.Б. Механизм фотоповреждения структур глаза. Изменение зарядов кристаллинов хрусталика при ультрафиолетовом облучении. // Биофизика. 1990. Т. 35. С. 200-204. Островский М.А., Федорович И.Б., Ельчанинов В.В, Кривандин А.В. Опасность повреждающего действия cвета на структуры глаза. Хрусталик – как естественный светофильтр и объект фотоповреждения^.]). Физические модели обсуждаются в [Курганов Б.И., Кинетика агрегации белков. Количественная оценка шаперонной активности в тестах, основанных на подавлении агрегации белков // Биохимия, 67(4), с. 492-507, 2002. Khanova H.A., Markossian K.A., Kurganov B.I., Samoilov, A.M., Kleimenov S.Yu., Levitsky D.I., Yudin I.K., Timofeeva A.C., Muranov K.O., Ostrovsky M.A., Mechanism of Chaperone-like Activity. Suppression of Thermal Aggregation of betaL-Crystallin by alpha -Crystallin // Biochemistry, 44(47), pp. 15480-15487, 2005.] при тепловой агрегации белков. Предполагается, что процесс тепловой агрегации белков включает две стадии. Вначале несколько денатурированных молекул образуют ядро, а рост белкового агрегата происходит путем присоединения денатурированной молекулы к этому ядру. Такой путь агрегации должен привести, по мере исчерпания денатурированного белка, к образованию агрегатов ограниченного размера.