Российская академия наук

Вид материала

Тезисы

Содержание Материалы и методы. Характеристика антиоксидантной активности Алкалоид(амино)содержащие соли Препарат мелафен повышает устойчивость Исследование антиоксидантной активности Окислительный стресс при курении

Подобный материал:

• Основание Петербургской академии наук, 49.85kb.
• Спонсоры конференции: Фармацевтическая фирма «Санофи-Авентис», 74.5kb.
• Ш. Н. Хазиев (Институт государства и права ран) Российская академия наук и судебная, 297.05kb.
• Научный журнал «Вопросы филологии» Оргкомитет: Сопредседатели, 53.54kb.
• Научный журнал "Вопросы филологии" Оргкомитет: Сопредседатели, 47.73kb.
• Котов Сергей Викторович доктор медицинских наук, профессор Савин Алексей Алексеевич, 547.92kb.
• Н. д кондратьева Международный фонд Н. д кондратьева и Российская академия естественных, 13.13kb.
• Российская академия наук отделение общественных наук ран, 74.85kb.
• Высочество Князь Монако Альберт II и другие. Сдоклад, 38.69kb.
• Ипээ ран www sevin ru, 22.27kb.

Жаворонок Т.В., Степовая Е.А., Петина Г.В., Шахристова Е.В.


ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет Росздрава», г. Томск, 634050, г. Томск, Московский тракт, 2, 8(3822)420922, tavaza@ngs.ru


Изучение механизмов антиоксидантной защиты нейтрофилов при окислительном стрессе (ОС) актуально в плане поиска путей увеличения эффективности их функционирования как эффекторных клеток острого воспаления. Ведущим редокс-буфером клетки выступает система глутатиона, участвующая в защите белков, липидов, нуклеиновых кислот от окислительного повреждения. Цель: оценить вклад системы глутатиона в регуляцию окислительной модификации белков (ОМБ) нейтрофилов при ОС in vitro.

Материалы и методы. Нейтрофилы крови 27 здоровых доноров выделяли на двойном градиенте плотности Ficoll-Paque, для стимуляции респираторного взрыва культивировали с Н₂О₂ (200 мкM) в течение 18 ч при 37º С и 5 % СО₂, в среду инкубации добавляли протектор SH-групп 1,4-дитиоэритритол (DTE, 5 мМ), блокатор SH-групп N-этилмалеимид (NEM, 5 мМ) или ингибитор синтеза глутатиона бутионин-сульфоксимин (BSO, 1 мM). В нейтрофилах определяли содержание восстановленного (GSH) и окисленного (GSSG) глутатиона методом ферментативной рециркуляции при блокировании SH-групп винилпирилидином, количество карбонильных производных белков (КПБ) методом иммуноферментного анализа, SH-групп белка (Б-SН) и белково-связанного глутатиона (Б-SSG) методом, учитывающим способность боргидрида натрия высвобождать GSH из связи с белками. Достоверность различий выборок оценивали с учетом критериев Манна-Уитни и Вилкоксона, различия были достоверны при уровне значимости р≤0,05.

Результаты. ОС инициировал дисбаланс в системе глутатиона нейтрофилов крови: снижение показателей GSH/GSSG в 6,0 раз, Б-SH/Б-SSG в 8,0 раз на фоне увеличения содержания КПБ в 2,5 раза. В присутствии избытка Н₂О₂ емкости восстановительного потенциала внутриклеточной системы глутатиона было недостаточно для предупреждения процессов ОМБ и происходило перераспределение GSH с целью защиты редокс-чувствительных SH-групп белков путем обратимых реакций глутатионилирования. Протектор SH-групп DTE увеличивал в нейтрофилах содержание GSH в 1,6 раза, индекс Б-SH/Б-SSG в 2,1 раза относительно таковых при ОС и способствовал поддержанию КПБ на уровне интактного контроля. Блокада SH-групп в нейтрофилах с помощью NEM, наоборот, снижала содержание GSH в 2,0 раза, индекс
Б-SH/Б-SSG в 7,7 раза, но существенно не влияла на уровень GSSG, Б-SSG, КПБ (р>0,05) в сравнении с величинами, регистрируемыми при ОС. Инкубирование нейтрофилов с ингибитором синтеза глутатиона de novo BSO приводило к состоянию дефицита общего глутатиона в клетках, в основном за счет снижения фракции GSH, уменьшению содержания Б-SH в 8,5 раз при сохранении пула Б-SSG (р>0,05) и активации ОМБ с ростом уровня КПБ в 1,3 раза относительно величин, регистрируемых при ОС.

Выводы. ОС, индуцированный in vitro 200 мкМ Н₂О₂, сопровождается дисбалансом системы глутатиона с возрастанием концентрации GSSG, Б-SSG и активацией карбонилирования белков в нейтрофилах крови. Ингибирование синтеза глутатиона de novo в нейтрофилах с помощью 1 мM BSO на фоне экспериментального ОС приводит к нарушению глутатионилирования белков и стимуляции необратимых процессов ОМБ. Под влиянием 5 мМ DTE восстановленный глутатион оказывает протекторный эффект в отношении ОМБ нейтрофилов при ОС. Динамика обратимых изменений функциональных SH-групп глутатиона и белков определяет редокс-состояние и резервно-адаптационные возможности нейтрофилов в ситуации ОС.


вклад глутатиона в поддержание функций нейтрофилов в условиях окислительного дисбаланса при остром воспалении


Жаворонок Т.В., Степовая Е.А., Петина Г.В.


ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет

Росздрава», г. Томск, 634050, г. Томск, Московский тракт, 2,

8(3822)420922, tavaza@ngs.ru


Интегральной частью воспалительного ответа считают гиперпродукцию нейтрофилами активных форм кислорода (АФК), способных вместе с провоспалительными цитокинами поддерживать воспаление. Основой защиты клеток от повреждения АФК служит восстановительный потенциал системы глутатиона, который определяет редокс-состояние и влияет на эффективность функционирования нейтрофилов. Цель: оценить роль системы глутатиона в механизмах изменений функциональных свойств нейтрофильных лейкоцитов крови при внебольничной пневмонии (ВП).

Материал и методы. Нейтрофилы крови 48 больных ВП и 27 здоровых доноров выделяли на двойном градиенте плотности, культивировали в полной среде 18 ч при 37ºС и 5% СО2. В присутствии ингибитора синтеза глутатиона бутионин-сульфоксимина (BSO, 1мM), ингибитора каталазы 3-амино-1,2,4-триазола (АТ, 2мM) в среде инкубации определяли продукцию клетками цитокинов (TNF-, IL-8) и радикала НО•, в нейтрофилах оценивали активность миелопероксидазы (МПО), глутатионпероксидазы (ГПО), содержание восстановленной (GSH), окисленной (GSSG), белково-связанной (Б-SSG) форм глутатиона. Достоверность различий выборок оценивали с учетом критериев Манна-Уитни и Вилкоксона, различия были достоверны при уровне значимости р≤0,05.

Результаты. В нейтрофилах при ВП зарегистрирован рост продукции IL-8, TNF-, НО•, активности MПO, снижение уровня GSH в 3,0 раза, индекса GSH/GSSG в 6,5 раз, активности ГПО в 1,6 раза и прирост Б-SSG в 11,6 раз. Блок синтеза GSH de novo дополнительно снижал содержание GSH, коэффициент GSH/GSSG и активность ГПО (в 1,9; 2,0 и 2,5 раза, соответственно, по сравнению величинами, полученными в отсутствие BSO (р<0,05)), но содержание Б-SSG не изменялось, что указывает на нарушение механизмов глутатионирования при защите белков от окислительной деградации. Добавление BSO в среду инкубации нейтрофилов, праймированных в условиях ВП, не влияло на продукцию нейтрофилами TNF- и IL-8, но снижало выход НО• и активность MПO в 1,4 раза (р<0,05). На фоне низкого уровня GSH в клетках блокада его дополнительного синтеза приводила к инверсии повышенной активности MПO, которая становилась ниже величин, регистрируемых у здоровых доноров (р<0,05). Обсуждается участие GSH и Б-SSG в регуляции активности МПО и продукции НО• нейтрофилами в условиях блокады синтеза глутатиона. Ингибирование каталазы с помощью АТ в нейтрофилах у больных ВП приводило к компенсаторному перерасходу GSH, низкой активности ГПO и снижению образования НО• в 1,7 раза (р<0,05) при отсутствии влияния на активность МПО и продукцию цитокинов.

Выводы. Нарушение функциональных свойств нейтрофилов при ВП сопровождается дисбалансом в системе глутатиона, определяющей редокс-статус клеток. Отсутствие синтеза GSH de novo угнетает кислород-зависимые механизмы функциональной активности нейтрофилов (способность к продукции НО^•, активность MПO), необходимые для обеспечения микробицидной функции, и не влияет на синтез цитокинов IL-8, TNF-. Блокирование каталазы компенсируется заместительным вкладом системы GSH в редокс-потенциал нейтрофилов при ВП, отражаясь на их функциональной активности лишь снижением продукции НО^•. Для поддержания функционального состояния нейтрофилов важнее синтез GSH de novo, чем активность каталазы. Дизрегуляция GSH-зависимой системы может снижать эффективность функционирования нейтрофилов при ВП и способствовать их элиминации из организма.


ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ

ГИМАТОМЕЛАНОВЫХ КИСЛОТ ПЕЛОИДОВ


Жданова А.В., Аввакумова Н.П., Кривопалова М.А., Глубокова М.Н.


Самарский государственный медицинский университет, г. Самара

ул. Арцыбушевская, 171; тел. (846) 3375646; navvak@mail.ru


В небольших количествах свободные радикалы играют важную роль в поддержании здоровья, принимая участие в различных химических реакциях, ежесекундно происходящих в клетках. Однако воздействие интенсивной физической нагрузки, а также загрязненной питьевой воды, курения, радиации приводит к сбоям природных механизмов контроля. Тогда активность свободных радикалов резко возрастает, разрушающе действуя на организм. Вследствии этого возникает необходимость использования антиоксидантов, выделенных из биологических объектов. Для медицинских исследований большой интерес представляют гиматомелановые кислоты низкоминерализованных иловых сульфидных грязей, которые являются спирторастворимой фракцией гумусовых кислот. На их основе разрабатываются биологически активные пелоидопрепараты широкого спектра действия; изучаются возможности их внедрения в практику здравоохранения и реабилитационных процедур. По химическому составу гиматомелановые кислоты представляют собой сложные смеси высокомолекулярных органических полиароматических соединений, образующихся при разложении растительных и животных остатков под действием микроорганизмов и абиотических факторов среды. Отличительной особенностью гиматомелановых кислот можно считать высокое атомное соотношение Н/С и выраженную отрицательную степень окисленности.

Целью данного исследования является изучение антиоксидантной активности гиматомелановых кислот пелоидов амперометрическим и манометрическим методом, а также определение их влияния на лейкоциты крови в условиях окислительного стресса.

Количественное определение суммарного содержания антиоксидантов (ССА) проведено методом жидкостной хроматографии с амперометрическим детектированием. Определение осуществляли с помощью прибора Цвет Яуза АА-01. В результате исследования получили, что ССА в гиматомелановых кислотах составляет 73,5*10-3 мг/мл в пересчете на кверцетин, который рекомендован в качестве стандарта для данного прибора ВНИИ Метрологической службы.

В результате манометрического определения антиоксидантой активности была оценена степень торможения окислительного процесса добавками гиматомелановых кислот пелоидов, а также найдены эффективные константы скорости ингибирования. На основании последних рассчитан ионольный эквивалент, который составил 23 отн. ед.

Изучение влияния гиматомелановых кислот на систему крови, проведенное в условиях окислительного стресса, вызванного пероксидом водорода, выявило следующие изменения: в контрольных образцах количество лейкоцитов колебалось в пределах 6,05*109/л. Под воздействием пероксида водорода количество лейкоцитов уменьшилось примерно на 29% (4,30), при добавлении гиматомелановых кислот пелоидов лейкоциты повысились до 5,0*109/л.

Совокупность информации, полученной в экспериментах «in vitro» позволяют отнести гиматомелановые кислоты к антиоксидантам, перспективным для использования в медицинской практике. Они индифферентны относительно клеток крови в физиологических условиях, но при окислительном стрессе нивелируют повреждающее действие и таким образом способствуют поддержанию гомеостаза.


АЛКАЛОИД(АМИНО)СОДЕРЖАЩИЕ СОЛИ

1,3,4-ТИАДИАЗОЛ-2,5-ДИСУЛЬФОКИСЛОТЫ И ИХ

АНТИОКСИДАНТНАЯ АКТИВНОСТЬ


Животова Т.С.


Институт органического синтеза и углехимии Республики Казахстан, г. Караганда, ул. Алиханова, 1, тел. (7212)-41-13-29,

E-mail: zhts2004@mail.ru


Несмотря на то, что антиоксидантами традиционно принято считать вещества фенольной природы, среди азотистых гетероциклов, содержащих пиперидиновый, пиридиновый, пиримидиновый, тиазольный и другие фрагменты, встречаются вещества, обладающие анти- или прооксидантным действием.

Окислением 2,5-димеркапто-1,3,4-тиадиазола синтезирована 1,3,4-тиадиазол-2,5-дисульфокислота (I). Взаимодействием (I) с некоторыми алкалоидами и вторичными аминами получены ониевые соли (II-VIII) и проведены испытания синтезированных соединений (I-VIII) на антиоксидантную активность.

Полученные соединения (I-VIII) представляют собой белые кристаллические вещества с высокими температурами плавления, хорошо растворимые в воде.

Выход 1,3,4-тиадиазол-2,5-дисульфокислоты (I) составляет порядка 98%, солей (II-VIII) – 50-77%. Выходы соединений (II-VIII) зависят от электронодонорных свойств заместителей и от конформационной жесткости циклов в молекулах исходных алкалоидов и вторичных аминов.







Антиоксидантную активность 1,3,4-тиадиазол-2,5-дисульфокислоты (I) и ее солей (II-IV, VI, VII) изучали на модели окисления липосом фосфатидилхолина по тесту с тиобарбитуровой кислотой. Препарат сравнения – синтетический антиоксидант ионол. Все исследованные соединения в разной степени, но проявили антиоксидантные свойства. С учетом того, что анабазин и l-эфедрин не проявляют антиоксидантных свойств, а цитизин является прооксидантом, можно предположить, что именно введение сульфогрупп и тиадиазольного фрагмента в структуру алкалоидов и вторичных аминов приводит к появлению у них антиоксидантной способности.


ПРЕПАРАТ МЕЛАФЕН ПОВЫШАЕТ УСТОЙЧИВОСТЬ

РАСТЕНИЙ К СТРЕССОВЫМ ВОЗДЕЙСТВИЯМ


Жигачева И.В., Гуревич С.М., Козаченко А.И., Наглер Е.Г.


Учреждение Российской академии наук Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, 119334 г. Москва, ул Косыгина,4;

тел. (495)-939-74-09, E. mail: zhigacheva@mail.ru


«Энергетическими станциями», обеспечивающими клетки энергией, являются митохондрии. В физиологических условиях митохондрии сами могут генерировать активные формы кислорода (АФК) при участии NADH- дегидрогеназы, флавопротеина и комплекса III . Однако, несмотря на постоянную генерацию АФК дыхательной цепью, активации ПОЛ не происходит в связи с тем, что митохондрии обладают высокоэффективной антиоксидантной системой. В условиях стресса, когда генерация АФК возрастает, а антиоксидантная система уже не в состоянии справиться с нарастающим пулом АФК, в мембранах митохондрий активируются процессы ПОЛ. Можно предположить, что препараты, способные влиять на структурные характеристики биологических мембран обеспечивая мембранам большую структурную и функциональную стабильность, будут обладать антистрессовыми свойствами. В качестве такого препарата был выбран синтезированный в Институте органической и физической химии им. А.Е. Арбузова РАН регулятор роста растений мелафен, который представляет собой меламиновую соль бис(оксиметил)фосфиновой кислоты .. Препарат влияет на уровень ПОЛ в мембранах митохондрий, при чем его действие зависит от функционального состояния мембран: во всех исследуемых концентрациях он не влияет на интенсивность флуоресценции продуктов ПОЛ в мембранах свежевыделенных митохондрий из корнеплодов сахарной свеклы и снижает этот показатель до контрольных значений в мембранах «состаренных» митохондрий (25 мин. инкубации при комнатной температуре). При этом наиболее эффективными являются концентрации 2х 10^-9-4х10^-12 и 4х10^-18 – 4х10^-21М. Снижение флуоресценции продуктов ПОЛ, вероятно, связано с антирадикальной активностью препарата к радикалам О₂^-, сравнимой с реакционной способностью тетранитротетразолиевого синего (НТС). Константа скорости взаимодействия с супероксидными радикалами составляет k_мел= 4 х 10⁴М^-1с^-1. Снижению интенсивности ПОЛ способствует также способность препарата на 27-30% повышать скорость транспорта электронов на конечном участке дыхательной цепи. Таким образом, антистрессовые свойства мелафена связаны с изменением физико-химических свойств мембран и активности ферментов, ассоциированных с этими мембранами.


ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ

ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ РАЗЛИЧНОГО

ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ


Журавлева Л.А.

ГОУ ВПО «Сургутский государственный университет ХМАО – Югры», г. Сургут, Химико-технологический факультет, кафедра химии, пр. Ленина, 1, г. Сургут, Тюменская область

тел. 8-(34-62)-76-30-83; факс 8-(34-62)-76-29-29; E-mail: zhlaLA@yandex.ru

В настоящее время исследования показали, что эффективность многих ингибиторов меняется в зависимости от способа и условий окисления.

В настоящем сообщении приведены результаты тестирования некоторых лекарственных препаратов различного фармакологического действия в условиях водно-липидной кинетической модели. Окисление метиллинолеата проводили при температуре 60°С в водно среде, стабилизированной цетилтриметиламмонием бромидом, при непрерывном перемешивании. В качестве катализатора использовали ионы меди. Волюмометрически измеряли объем поглощенного кислорода во времени в контрольной пробе и в пробах с исследуемым ингибитором.

Эффективность ингибиторов оценивали кинетическими параметрами, которые определяли по результатам аппроксимации кинетических кривых окисления. Начальная скорость (W_нач) и период торможения (τ₁) свидетельствуют об участии ингибитора в реакциях обрыва цепей; максимальная скорость (W_max) и ускорение (а) – об участии продуктов окисления в реакциях обрыва, разветвления и продолжения цепей; период окончания ускорения (τ₂) и выход на контрольную скорость свидетельствует о степени расходования ингибитора. В качестве внешнего стандарта использован ионол (2,6- дитретбутил-3-метилфенол), для которого исследован механизм действия и показана высокая антиоксидантная активность в условиях водно-липидной кинетической модели. Исследована эффективность лекарственных препаратов: осалмид (2- гидроксибензол-N-4′- гидроксифенил), применяемого как желчегонное средство; эмоксипин (3- гидрокси-6-метил-2-этилпиридин), применяемого в офтальмологической практике в качестве средства для лечения внутриглазных кровоизлияний; парацетамол (n- ацетаминофенол) – болеутоляющее средство; метилдофа (3-(3′,4′-диоксифенил)-2-метиламин), применяемого как антигипертензивное средство.

Исследования показали, что минимальная начальная скорость и наибольшее значение периода торможения для эмоксипина и осалмида свидетельствуют об их эффективном участии в реакциях обрыва цепей. В присутствии парацетамола максимальная скорость процесса выходит на контрольную скорость, что свидетельствует о полном расходовании ингибитора. Снижение максимальной скорости в ряду: ионол > парацетамол > метилдофа > эмоксипин > осалмид и по сравнению с контрольной пробой свидетельствует об участии продуктов их окисления в реакциях разветвления и продолжения цепей. Показано, что эмоксипин является более слабым ингибитором, чем ионол. Исследованные лекарственные препараты можно расположить в ряд уменьшения антиоксидантной активности по сравнению с ионолом: эмоксипин > осалмид > парецетамол > метилдофа.

Выводы:

Показана высокая антиоксидантная активность эмоксипина, что подтверждается клиническими исследованиями и тем, что в последнее время его успешно применяют при лечении инфаркта миокарда, острых кровопотерях и глаукоме и других заболеваниях, связанных с усилением перекисного окисления липидов.


ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС ПРИ КУРЕНИИ


Заварыкина Т.М., Жижина Г.П., Фаткуллина Л.Д., Бурлакова Е.Б.


Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, г. Москва, ул. Косыгина, 4Тел. 8 (495) 939-74-64; zhizhina@sky.chph.ras.ru


Курение является причиной сильного окислительного стресса в организме курящего. Известно, что табачный дым содержит множество веществ-окислителей и канцерогенов, повреждающих геном, мембраны и другие макромолекулы клеток. Табачная смола и дым служат источником активных форм кислорода (АФК), в том числе супероксидных радикалов и пероксида водорода. Генерация в организме избытка АФК усиливает процесс окисления ДНК, липидов и мембран клеток. Нами было проведено исследование биомаркеров мембрано-токсичности и генотоксичности продуктов курения в клетках периферической крови здоровых лиц (25 курильщиков и 29 некурящих) и 50 лиц со злокачественными опухолями, индукцию которых связывают с курением (34 курильщиков и 16 некурящих). В качестве маркеров повреждающего действия курения сигарет измеряли число разрывов (ОР и ДР) в ДНК лимфоцитов, микровязкость мембран эритроцитов методом ЭПР спиновых зондов, содержание малонового диальдегида (МДА) в эритроцитах и степень их гемолиза. В параллельных исследованиях группы наших коллег были измерены активности 5 антиоксидантных (АО) ферментов (ГП, ГТ, ГР, СОД и каталазы) в эритроцитах [1]. Выявлены различия измеренных параметров между здоровыми курящими и некурящими лицами, а также между группами здоровых лиц и больных раком. Обнаружено статистически значимое повышение количества двунитевых разрывов (ДР) ДНК у здоровых курящих по сравнению с некурящими лицами, особенно у много курящих по сравнению с мало курящими. Большая интенсивность курения повышала также содержание МДА в эритроцитах. В группе здоровых людей обнаружено статистически значимое снижение микровязкости липид-белковых участков (параметр τ_СII) эритроцитарных мембран у курящих по сравнению с некурящими. В группе курящих существенно снижено число корреляционных связей между параметрами, что в сочетании с изменением структурных характеристик и активности ОА ферментов свидетельствует о развитии окислительного стресса при хроническом курении. У онкологических больных обнаружено статистически достоверное (р<0,05) снижение микровязкости мембран эритроцитов (по параметру τ_CII) и увеличение содержания ДР и ОР ДНК лимфоцитов относительно здоровых лиц, т.е. усиление окислительных повреждений ДНК и мембран. В противоположность здоровым людям в группе больных существенного влияния курения на параметры крови не выявлено. Повышение структурных повреждений геномной ДНК и мембран в сочетании с изменением активности ферментов в клетках крови онкологических больных свидетельствует о значительном изменении АО статуса при наличии злокачественного процесса. Выявлены изменения корреляционных взаимосвязей параметров при курении здоровых лиц или вследствие развития рака. Изучение маркеров окислительного стресса, индуцированного курением сигарет, показало возможность применения ряда параметров окислительного стресса для оценки вреда курения и вероятности возникновения онкологических процессов у курящих [1].


[1]. Burlakova E.B., Zhizhina G.P., Gurevich S.M. et al. // J. Cancer Res. Therap. 2010, v.6, p.47-53.