«Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Вид материала

Содержание

Временнáя организация пролиферации обновляющихся тканей эпифизэктомированных беспородных белых крыс после совместного введения п
Исследование роли эпифиза в формировании биоритмов

Подобный материал:

1 2 3 4

Параметры циркадианных ритмов МИ эпителиев пищевода и крипт тощей кишки, а также клеток герминативного центра лимфатического узелка трахеобронхиальных лимфатических узлов эпифизэктомированных беспородных белых крыс после введения пептидов эпифиза

Параметр	Пищевод		Кишечник		Лимфатический узел
Параметр	1 сутки	2 сутки	1 сутки	2 сутки	1 сутки	2 сутки
Мезор,‰	7±1.1		68.8±4.22		24±2.35
Акрофаза,ч	9⁰⁰	9⁰⁰	24⁰⁰	24⁰⁰	12⁰⁰	12⁰⁰
АФ,ч	7⁰⁰-14⁰⁰	6⁰⁰-14⁰⁰	20⁰⁰-2⁰⁰	20⁰⁰-5⁰⁰	8⁰⁰-17⁰⁰	8⁰⁰-17⁰⁰
Длительность АФ,ч	7	8	6	9	9	9
Середина АФ,ч	10³⁰	10⁰⁰	23⁰⁰	0³⁰	12³⁰	12³⁰
АА,‰	12	13.6	54.75	38.17	32.4	29.2
ОА,‰	5.38	5.25	2	1.7	3.8	3.9
КС,1/ч	0.59	0.87	0.33	0.11	0.63	0.65
РМср,‰	54.25±7.7		1636±34		196±44
РМАФср,‰	26.25±0.6		654±84.1		99.8±7

Введение пептидов эпифиза эпифизэктомированным животным в
6 часов также привело к формированию циркадианного ритма пролиферации эпителия пищевода. Циркадианный ритм МИ эпифизэктомированных животных после введения пептидов эпифиза в 6 часов имел характер монофазного ритма с максимумом деления клеток в 21 и минимумом в 9 часов (Р<0,001). Возрастание митотической активности происходило в ночные часы. Длительность активной фазы ритма восстановилась до уровня близкого к показателям животных контрольной группы. Акрофаза ритма наблюдалась в начале темновóго периода фоторежима. Смещение активной фазы ритма по отношению к таковой интактных животных составило 10 часов. Смещение акрофазы – 12 часов. Значения амплитудных показателей и коэффициента синхронизации ритма эпифизэктомированных животных после введения пептидов эпифиза в 6 часов были близкими к таковым интактных животных. Кривая динамики МИ эпителия пищевода эпифизэктомированных животных, которым вводили пептиды эпифиза в 6 часов имеет вид синусоиды инвертированной по отношению к таковой в контроле.

Результаты многочисленных исследований последних лет свидетельствуют о высокой биологической активности пептидного препарата эпифиза эпиталамина в отношении нейроэндокринной, репродуктивной и иммунной систем. Неоднократно демонстрировалось ингибирующее влияние пептидов эпифиза на функциональную активность гонад, коры надпочечников, гипофиза. Физиологические эффекты мелатонина и пептидов эпифиза обнаруживают частичное функциональное сходство, в частности, отмечается их антигонадотропное, противоопухолевое, иммуномодулирующее и антиоксидантное действие (Ryzhak et al., 2007; Kozina et al., 2007; Konturek et al., 2008). В связи с тем, что физиологические эффекты мелатонина и пептидов эпифиза зачастую оказываются сходными, неоднократно высказывалось предположение о возможности реализации физиологических свойств эпифизарных пептидов через изменение синтеза мелатонина. Изучение характера синтеза мелатонина у крыс, самок макак резусов и человека показало, что введение в вечернее время эпиталамина, а также эпиталона (синтетического аналога эпиталамина), оказывает значительное стимулирующее действие на синтез мелатонина (Korkushko et al., 2004, 2007). Однако приведенные выше результаты собственного исследования, многообразие пептидов эпифиза, а также дистантность их действия и функциональная специфичность свидетельствуют о проявлении пептидами свойств гормонов. Восстановление циркадианного ритма пролиферации обновляющихся тканей эпифизэктомированных животных после введения пептидов эпифиза указывает на то, что пептиды эпифиза обладают собственными ритмогенными свойствами, не связанными с влиянием на продукцию мелатонина.

Временнáя организация пролиферации обновляющихся тканей эпифизэктомированных беспородных белых крыс после совместного введения пептидов эпифиза и мелатонина. Совместное введение пептидов эпифиза и мелатонина эпифизэктомированным животным обуславливает формирование монофазного циркадианного ритма пролиферации эпителиев пищевода и крипт тощей кишки, а также клеток герминативного центра лимфатического узелка трахеобронхиальных лимфатических узлов. По большинству параметров суточного ритма МИ экспериментальные животные незначительно отличаются от интактных. Длительность активной фазы ритма, а также величины амплитудных показателей ритма (коэффициент синхронизации, абсолютная и относительная амплитуды) не выходили за пределы значений для интактных животных. Суточный пул делящихся клеток не имел статистически достоверных отличий (Р>0,05) от аналогичного показателя интактных животных. Посредством спектрального анализа и анализа методом наименьших квадратов показано наличие циркадианного (период около 24 часов) и ультрадианного (период 7-9 часов) ритмов пролиферации обновляющихся тканей эпифизэктомированных животных, одновременно получавших пептиды эпифиза и мелатонин.

Суточная динамика пролиферации эпифизэктомированных животных, которым одновременно вводили пептиды эпифиза и мелатонин сходна с суточной динамикой пролиферации эпифизэктомированных животных, которым вводили только пептиды эпифиза. Это выражается в наличии монофазного циркадианного ритма клеточной репродукции с близкими периодами и подтверждает ритмогенные свойства пептидов эпифиза.

Исследование роли эпифиза в формировании биоритмов

продукции тканевых регуляторов пролиферации

Временнáя организация антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени интактных беспородных белых крыс. Ритмичность функционирования пролиферативной системы контролируется на различных уровнях, но действие любого фактора в конечном итоге реализуется посредством тканевых регуляторов, на что указывает наличие органной и тканевой специфичности ритмов пролиферации. На тканевом уровне деление клеток контролируется кейлон-антикейлонной системой, в которой кейлоны подавляют, а антикейлоны стимулируют размножение клеток. Соотношение их концентраций в ткани определяет уровень её пролиферативной активности и обеспечивает структурный гомеостаз.

Формирование биоритмов пролиферации осуществляется посредством ритмической продукции тканевых регуляторов деления клеток. Продукция кейлонов в тканях различной локализации характеризуется циркадианной ритмичностью. Показано, что изменения концентрации эпидермального G₂-кейлона в эпителии языка и пищевода крыс носят выраженный ритмический характер с активной фазой ритма в дневное время. Наличие циркадианного ритма биосинтеза кейлонов отмечается также в препаратах асцитной опухоли Эрлиха (Антохин, 1979; Машанова, 2003), причем ритмический характер продукции свойственен всем компонентам (G₁-, S- и G₂-) кейлонсодержащего препарата. Продукция факторов роста также характеризуется циркадианной ритмичностью (Haus et al., 1999).

Антирадикальная активность кейлон-антикейлонной системы печени крыс изучалась на протяжении одних суток. Данные спектрального анализа и анализа методом наименьших квадратов свидетельствуют о ритмической организации антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени интактных животных с периодом, приближающимся к 24 и 7 часам.

У интактных животных наблюдалось периодическое изменение антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени, которое характеризовалось монофазным ритмом на протяжении суток. Его активная фаза приходилась на ночные часы. Значения антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени были максимальными в 21 час, достоверно превышая минимальные значения в 14 часов (Р<0,05). Изменения антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени интактных животных скоррелированы с режимом освещения (табл.4). Антирадикальная активность в темновой фазе фотопериода превышала (Р<0,05) таковую в световой фазе (рис.11).

Рис. 11. Средние значения антирадикальной активности (усл. ед/мг белка) кейлон-антикейлонной системы печени в световую и темновую фазы фотопериода

С целью выявления роли эпифиза в формировании циркадианного ритма антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени была проведена экстирпация железы и изучена динамика антиради-

кальной активности кейлон-антикейлонной системы печени эпифизэктомированных беспородных белых крыс. Эпифизэктомия привела к исчезновению циркадианного ритма антирадикальной активности кейлон-антикей-лонной системы печени. Результаты спектрального анализа и анализа методом наименьших квадратов показали отсутствие циркадианного ритма. В то же время обнаружился выраженный ультрадианный ритм антирадикальной активности с периодом около 9,5 часов.

Колебания антирадикальной активности на протяжении суток не имели какой-либо связи с фоторежимом. На общем монотонном фоне изменений антирадикальной активности наблюдалось два статистически недостоверных подъема (Р>0,05) с максимумами в 24 и 9 часов. Антирадикальная активность кейлон-антикейлонной системы печени в световой и темновой фазах фотопериода не имела статистически достоверных (Р>0,05) отличий (рис.11).

Таким образом, удаление эпифиза привело к рассогласованию циркадианной составляющей деятельности кейлон-антикейлонной системы печени с условиями освещенности, и исчезновению циркадианного ритма продукции тканевых регуляторов пролиферации на 40-е сутки после эпифизэктомии. У эпифизэктомированных животных динамика антирадикальной активности характеризуется только ультрадианной ритмичностью.

Для решения вопроса о взаимосвязи организменного (эпифизарного) и тканевого уровней регуляции биоритмов пролиферации было изучено влияние введения пептидов эпифиза эпифизэктомированным животным на формирование циркадианного ритма антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени. Пептиды эпифиза вводили одной группе эпифизэктомированных животных в 6 часов, другой группе в 18 часов в дозе 2.5 мг/кг ежедневно с 24 по 41 день после эпифизэктомии.

Введение пептидов эпифиза эпифизэктомированным животным как в 6, так и в 18 часов привело к формированию циркадианного ритма антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени. Посредством спектрального анализа и анализа методом наименьших квадратов были выявлены циркадианный ритм антирадикальной активности с периодом, приближающимся к 24 часам и ультрадианный с периодом около
8 часов.

Циркадианный ритм антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени эпифизэктомированных животных после введения пептидов эпифиза имел характер монофазного ритма. Возрастание антирадикальной активности отмечалось в дневное время при введении пептидов эпифиза в 6 часов и в ночное время при их введении в 18 часов. Длительность активной фазы ритма восстановилась до уровня близкого к показателям животных контрольной группы (табл.4). При введении пептидов эпифиза в 6 часов акрофаза ритма наблюдалась в начале световó-го периода фоторежима. Максимум антирадикальной активности отмечался в 9 и минимум в 3 часа (Р<0,05). При введении пептидов эпифиза в
18 часов акрофаза ритма наблюдалась в начале темновóго периода. Максимум антирадикальной активности отмечался в 21 и минимум в 9 часов (Р<0,05). Смещение активной фазы ритма по отношению к таковой интактных животных составило 11 часов при введении пептидов эпифиза в 6 часов и 1 час при их введении в 18 часов. Смещение акрофазы на 12 часов наблюдалось только при введении пептидов эпифиза в 6 часов. Значения амплитудных показателей и коэффициента синхронизации ритма антирадикальной активности эпифизэктомированных животных после введения пептидов эпифиза были близкими к таковым интактных животных (табл.4).

Таблица 4

Параметры циркадианных ритмов антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени интактных, эпифизэктомированных и эпифизэктомированных с последующим введением пептидов эпифиза животных

Параметр	Интактный контроль	Эпифиз-эктомия	Эпиталамин (18 часов)	Эпиталамин (6 часов)
Мезор, усл. ед/мг белка	324.5±46.88	541±37	605±64	628.7±71.5
Акрофаза,ч	21⁰⁰	Ритм отсутст-вует	21⁰⁰	9⁰⁰
АФ,ч	19⁰⁰-5⁰⁰		18⁰⁰-5⁰⁰	6⁰⁰-16⁰⁰
Длительность АФ,ч	10		9	10
Середина АФ,ч	24⁰⁰		22³⁰	11⁰⁰
АА, усл. ед/мг белка	308.6		471	607
ОА, усл. ед/мг белка	2.55		2.25	2.5
КС,1/ч	0.17		0.18	0.41

У эпифизэктомированных животных, которым вводили пептиды эпифиза среднесуточные значения антирадикальной активности не имели статистически достоверных отличий (Р>0,05) от значений соответствующих показателей для интактных и эпифизэктомированных животных. В то же время динамика антирадикальной активности, в отличие от эпифизэктомированных животных, характеризовалась наличием циркадианного ритма. Антирадикальная активность в световой фазе фотопериода (Р<0,05) превышала таковую в темновой фазе при введении пептидов эпифиза в 6 часов (рис.11). Введение пептидов эпифиза в 18 часов обусловило превышение (Р<0,05) антирадикальной активности в темновой фазе фотопериода (рис.11). Результаты графически-параметрического анализа указывают на сходство биоритмологической организации кейлон-антикейлонной системы печени интактных и эпифизэктомированных животных, получавших пептиды эпифиза в 18 часов. Введение пептидов эпифиза эпифизэктомированным животным в 6 часов привело к формированию инвертированного циркадианного ритма антирадикальной активности.

III. Оценка биологической активности кейлон-антикейлонных препаратов интактных, эпифизэктомированных и эпифизэктомированных с последующим введением пептидов эпифиза беспородных белых крыс

Для оценки биологической активности препарата системы кейлон-антикейлон интактных, эпифизэктомированных и эпифизэктомированных с последующим введением пептидов эпифиза крыс частично гепатэктомированным мышам вводили комплексный экстракт тканевых регуляторов пролиферации, полученный в дневные или ночные часы.

Проверка биологической активности кейлон-антикейлонного препарата, полученного от интактных беспородных белых крыс показала выраженную митозингибирующую активность его дневных фракций и способность ночных фракций усиливать пролиферацию гепатоцитов частично гепатэткомированных мышей. Это свидетельствует о том, что дневные фракции кейлон-антикейлонного препарата печени содержат преимущественно его кейлонный компонент, в то время как ночные фракции – антикейлонный. Дневные и ночные фракции препарата, выделенные у эпифиз-эктомированных животных не оказывают влияние на репродукцию клеток.

Введение пептидов эпифиза эпифизэктомированным белым крысам привело к восстановлению циркадианного ритма антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени. Его активные фазы отмечались в разное время суток в зависимости от времени введения пептидов эпифиза. Исследование биологической активности дневных и ночных фракций кейлон-антикейлонного препарата, полученного из печени эпифизэктомированных крыс, которым вводили пептиды эпифиза в 6 часов показало, что введение частично гепатэктомированным мышам ночной фракции препарата приводит к уменьшению МИ гепатоцитов, а введение его дневной фракции повышает митотическую активность гепатоцитов, оказывая инвертированное действие по сравнению с препаратами, полученными от интактных животных. Введение препаратов, полученных от эпифизэктомированных беспородных белых крыс, которым вводили пептиды эпифиза в 18 часов, оказывает аналогичное действие с препаратами, полученными от интактных животных.

Кейлон-антикейлонная система печени белых крыс является динамической системой, в которой на протяжении суток поддерживается баланс между стимулятором и ингибитором пролиферации. В норме у белых крыс баланс между кейлоном и антикейлоном в ночные часы смещен в сторону последнего, что приводит к усилению митотической активности. У эпифизэктомированных крыс происходит исчезновение циркадианного ритма продукции тканевых регуляторов пролиферации, что определяет аналогичность эффектов введения, как ночных, так и дневных фракций препарата на пролиферацию. Введение пептидов эпифиза эпифизэктомированным животным привело к восстановлению циркадианного биоритма продукции тканевых регуляторов пролиферации. В результате эффект введения дневных и ночных фракций препарата кейлона и антикейлона приобретает сходство с эффектом введения такового, полученного от интактных животных. Последнее свойственно для кейлон-антикейлонного препарата, полученного от эпифизэктомированных животных с введением пептидов эпифиза в 18 часов.

Наши исследования показывают, что реализация ритмогенных эффектов эпифиза осуществляется через тканевые регуляторы пролиферации. Это подтверждается исчезновением циркадианного ритма антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени после эпифизэктомии и его восстановлением в результате введения эпифизэктомированным животным пептидов эпифиза. В то же время возникновение ультрадианных биоритмов пролиферации связано, по-видимому, с цикличностью метаболических процессов в тканях и ультрадианным ритмом продукции тканевых регуляторов пролиферации. Это подтверждается тем, что у эпифизэктомированных животных динамика антирадикальной активности характеризуется только ультрадианной ритмичностью. Тот факт, что введение пептидов эпифиза эпифизэктомированным животным в момент смены фоторежима с темновой фазы на световую (6 часов) привело к формированию инвертированного циркадианного ритма антирадикальной активности кейлон-антикейлонной системы печени указывает на то, что продукция эпифизом биологически активных пептидов, контролирующих ритмичность функционирования кейлон-антикейлонной системы, должна происходить в ночные часы.

Таким образом, система регуляции пролиферативных процессов представляет собой многоуровневый комплекс, в основе которого лежит регуляция деления отдельной клетки. На основании результатов собственного исследования и принимая во внимание данные литературы, можно заключить, что формирование циркадианного ритма пролиферации обеспечивается участием следующих структур: 1) супрахиазматические ядра, воспринимающие информацию от сетчатки глаза о режиме освещения и задающие ритм секреторной активности эпифиза; 2) эпифиз, трансформирующий нервный импульс в эндокринный сигнал; 3) периферические эндокринные железы, модулирующие параметры ритма; 4) эндогенные тканевые регуляторы пролиферации – кейлоны и антикейлоны, формирующие биоритм пролиферации конкретной ткани; 5) внутриклеточные регуляторы пролиферации.

Эпифизарная регуляция биоритмов пролиферации заключается в формировании сезонного и циркадианного ритмов митотической активности и не затрагивает ультрадианную составляющую. Действие биологически активных веществ эпифиза на пролиферацию может быть опосредовано периферическими эндокринными железами и кейлон-антикейлонной системой, а также осуществляться непосредственным воздействием на ткань. В последнем случае мелатонин задерживает клетки в G₁- или
G₂-периодах клеточного цикла. Продукция эпифизом мелатонина носит циркадианный характер. Концентрация мелатонина в крови достигает максимума к середине ночи, что соответствует пассивной фазе ритма пролиферации. Увеличение митотической активности начинается, как правило, во второй половине темновóго периода, когда наблюдаются падение активности ферментных систем эпифиза и снижение уровня мелатонина в крови. Действие биологически активных пептидов эпифиза на формирование циркадианного ритма пролиферации осуществляется через кейлон-антикейлонную систему. Продукция тканевых регуляторов пролиферации характеризуется циркадианной ритмичностью с активной фазой ритма продукции кейлонов в дневные и антикейлонов в ночные часы.

Таким образом, механизм формирования эпифизом циркадианного ритма пролиферации может быть следующим (рис.12):

Рис.12. Фазограмма циркадианных ритмов продукции биологически активных веществ эпифизом, концентрации кейлона в ткани и чувствительности клеток к действию кейлона. (Отрезками показаны активные фазы ритма. — суточная динамика пролиферации ткани)

Выделяющийся с наступлением темноты мелатонин, обладает цитостатическим эффектом и тормозит пролиферацию клеток. Вместе с тем, он повышает проницаемость клеточных мембран пинеалоцитов для синтезированных в них олигопептидов, облегчая тем самым попадание последних в кровоток. Выделяющиеся пептиды эпифиза подавляют продукцию кейлонов, изменяя баланс кейлон-антикейлонной системы ткани в пользу последних. На фоне прекращения синтеза мелатонина и повышения уровня антикейлонов во второй половине темновóго периода происходит увеличение митотической активности ткани. В дальнейшем при отсутствии мелатонина и пептидов эпифиза повышается продукция кейлонов, что вызывает снижение пролиферативной активности. Последующий синтез биологически активных веществ эпифизом в ночные часы приводит к повторению описанных выше процессов в результате чего и происходит формирование циркадианного ритма пролиферации.

Выводы

Разработанный способ анатомического доступа к эпифизу беспородных белых крыс и основанный на нем метод эпифизэктомии является оптимальным для использования в хронобиологических исследованиях.
Эпифизэктомия вызывает исчезновение циркадианного ритма пролиферации эпителиев пищевода, крипт тощей кишки и клеток герминативного центра лимфатического узелка трахеобронхиальных лимфатических узлов беспородных белых крыс и не влияет на ультрадианный биоритм митотической активности указанных тканей.
Однократное в течение суток введение мелатонина эпифизэктомированным беспородным белым крысам в начале темновóго периода в течение 14 суток не привело к восстановлению циркадианного ритма пролиферации эпителиев пищевода и крипт тощей кишки.
Эпиталамин, как препарат комплекса биологически активных пептидов эпифиза восстанавливает циркадианный ритм пролиферации обновляющихся тканей (эпителиев пищевода, тощей кишки и клеток герминативного центра лимфатического узелка трахеобронхиальных лимфатических узлов беспородных белых крыс) после эпифизэктомии.
В результате эпифизэктомии у беспородных белых крыс происходит исчезновение циркадианного ритма продукции тканевых регуляторов пролиферации – кейлонов и антикейлонов с сохранением ультрадианного ритма их выработки.
Введение биологически активных пептидов эпифиза (эпиталамина) эпифизэктомированным беспородным белым крысам приводит к восстановлению циркадианного ритма продукции тканевых регуляторов пролиферации (кейлонов и антикейлонов).
Регуляция циркадианного ритма митотической активности осуществляется при участии пептидов эпифиза, которые формируют циркадианный ритм продукции тканевых регуляторов пролиферации.

Blog

«Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Содержание