Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова биологический факультет на правах рукописи
| Вид материала | Автореферат |
- М. В. Ломоносова биологический факультет н а правах рукописи Столяров Андрей Павлович, 657.12kb.
- Xxi столетия Дунаева Светлана Олеговна, 37.07kb.
- Институциональное развитие местного самоуправления в российской федерации 23. 00., 689.31kb.
- Факультет дополнительного образования, 54.13kb.
- На правах рукописи, 514.74kb.
- Секция «почвоведение» Кинетика поглощения гуминовых кислот угля проростками пшеницы, 2613.34kb.
- Модель оценки инвестиционного климата российских регионов в условиях неопределенности, 111.18kb.
- М. В. Ломоносова филологический факультет слово грамматика речь выпуск II сборник научно-методических, 97.35kb.
- На правах рукописи, 584.81kb.
- Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова Факультет иностранных языков, 296.78kb.
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
имени М.В. ЛОМОНОСОВА
БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ
На правах рукописи
ТУЛЬСКАЯ
ЕЛЕНА МИХАЙЛОВНА
ТЕЙХОЕВЫЕ КИСЛОТЫ И ГЛИКОПОЛИМЕРЫ АКТИНОМИЦЕТОВ: РАЗНООБРАЗИЕ СТРУКТУР, ТАКСОНОМИЧЕСКИЕ И ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ
Специальность 03.00.07 – микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Москва, 2009 г.
Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета
Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова
Научные консультанты: доктор биологических наук
Евтушенко Людмила Ивановна
доктор биологических наук, профессор
Нетрусов Александр Иванович
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Зенова Галина Михайловна.
доктор биологических наук, профессор
Эль-Регистан Галина Ивановна
доктор химических наук, профессор
Бакиновский Леон Владимирович
Ведущая организация: Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН
Защита состоится «____» ____________ 2009 г. на заседании диссертационного совета Д.501.001. 21 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп.12, биологический факультет, ауд. М-1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.
Автореферат разослан «____» _____________ 2009 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
кандидат биологических наук Пискункова Н.Ф.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Состояние вопроса и актуальность проблемы.
На поверхности бактериальной клетки экспонированы углеводные остатки, входящие в состав биополимеров клеточной стенки (Наумова и Шашков, 1997; Shibaev, 1987; Sutcliffe, 1994; Weidenmaier and Peschel, 2008). Эти полимеры часто имеют весьма сложную структуру и играют важную роль в жизнедеятельности микроорганизма. Нейтральные и кислые полисахариды, тейхуроновые кислоты, у которых углеводные остатки соединены между собой ковалентными связями, являются типичными представителями гликополимеров клеточных стенок. Моносахаридные остатки присутствуют в основном гликополимере бактериальной клеточной стенки – пептидогликане, а также в уникальных соединениях, характерных только для клеточных стенок грамположительных бактерий – тейхоевых кислотах и сахар-1-фосфатных полимерах, мономерные звенья которых объединены фосфодиэфирными связями.
Исследование структур тейхоевых кислот и гликополимеров клеточных стенок важно как в фундаментальном, так и научно-прикладном аспектах. Выявление и описание новых структур представляет интерес в связи с оценкой разнообразия биополимеров, пониманием их функций в микробной клетке и путей их биосинтеза, а также распространения у различных микроорганизмов в связи с вопросами эволюции. Исследование структур поверхностных полимеров способствует также пониманию механизмов взаимодействия бактерий внутри микробного сообщества и с внешней средой, в том числе с высшими организмами. Весьма актуальны исследования этих биополимеров микроорганизмов в медицинском аспекте. Их углеводная составляющая отвечает за биологическое распознавание поступающих извне веществ (например, лекарств), а также определяет самые разнообразные процессы клеточного узнавания, в том числе, имеющих ключевое значение при развитии многих заболеваний человека и животных, включая бактериальные и вирусные инфекции, рак, воспаления и др. (Дмитриева и др., 2007; Нифантьев, 2008; Weidenmaier and Peschel, 2008). Одним из направлений исследований тейхоевых кислот и гликополимеров клеточных стенок бактерий, получившим развитие в последние годы, является так называемое “хемотаксономическое” – изучение распространения и структур полимеров в связи с фундаментальными задачами развития естественной системы микроорганизмов и решения практичесих задач идентификации.
К началу наших исследований среди вышеупомянутых полимеров наиболее изученными были тейхоевые кислоты. С момента их открытия у лактобацилл в 50-е годы ХХ века в лаборатории профессора Джеймса Бэддили (Baddiley and Matias, 1954; Baddiley et al., 1956) проводились работы, связанные с изучением структурного разнообразия, путей биосинтеза и функций тейхоевых кислот у бактерий. Эти работы в основном были выполнены на представителях родов Bacillus*, Lactobacillus и Staphylococcus (Baddiley et al., 1962 a,b; 1972; Karamata et al., 1972; 1987; Archibald, 1974; Doyle et al., 1975; Hancock and Baddiley, 1976; Rodgers and Taylor, 1978; Yokoyama et al., 1987; Mauël et al., 1989 и др.). Было также обнаружено, что организмы разных видов содержат различные по структуре тейхоевые кислоты, (Baddiley et al., 1961; Davison and Baddiley, 1964; Archibald et al., 1968; Baird-Parker, 1970), и была высказана идея о возможности использования данных полимеров в таксономических целях (Fiedler et al., 1981; Schleifer and Stackebrandt, 1983).
________________________
*- латинские наименования родов, видов и подвидов, а также наименования таксонов более высокого порядка (семейство, порядок, класс и т.д.) приведены согласно правилам журнала «Микробиология», 2008, Т. 77, № 4, стр. 574
Огромный вклад в изучение разнообразия структур и распространения тейхоевых кислот у представителей различных таксонов порядка Actinomycetales внесли приоритетные работы Заслуженного деятеля науки Российской Федерации, профессора Ирины Борисовны Наумовой с сотрудниками (Наумова, 1964; 1973; 1979; Евтушенко и др., 1984; Наумова и Шашков, 1997; Naumova et al., 1980; Naumova, 1988; Naumova et al., 2001), ведущиеся в течение многих лет на кафедре микробиологии биологического факультета МГУ в сотрудничестве со специалистами Института органической химии им. Н.Д.Зелинского РАН и Института биохимии и физиологии им. Г.К. Скрябина РАН (отдел «Всероссийская коллекция микроорганизмов»).
Представители порядка Actinomycetales (актиномицеты) выделяются среди других прокариот размерами (до 9 млн. п.о.) и организацией генома, особенностями фенотипа, в т.ч., разнообразием морфологии и химических компонентов клетки и клеточной стенки. Актиномицеты также превосходят другие известные группы бактерий по способности синтезировать биологически активные соединения. Они являются продуцентами свыше половины из более 10000 антибиотиков и других соединений, известных к настоящему времени (Грачева, 2003; Goodfellow et al., 1988; Anderson and Wellington, 2001; Watve et al., 2001). Все вышесказанное способствовало повышенному интересу к этой группе микроорганизмов со стороны различных специалистов, прежде всего биотехнологов, микробиологов-систематиков и молекулярных биологов, что, в свою очередь, определило более успешное развитие системы актинобактерий по сравнению с другими группами пркариот.
Создание филогенетической схемы прокариот, и актинобактерий в частности, стало возможным благодаря внедрению в микробиологию молекулярно-генетических методов и определению нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК. Филогенетические древа, однако, не могут быть использованы непосредственно для построения иерархической системы (Калакуцкий, 2006; Stackebrandt and Swings, 2005). Выделение новых и ревизия ранее описанных таксонов осуществляется с учетом разносторонних согласующихся данных филогенетического и фенотипического характера (принцип полифазной таксономии). Информация о фенотипе особенно важна для обоснования выделения новых таксонов родового и видового уровней и уточнения границ между таксонами.
Изучение хемотаксономических признаков (тип клеточной стенки, тип пептидогликана, состав менахинонов, жирных кислот фосфолипидов) сыграло ключевую роль в развитии системы классификации актиномицетов в «домолекулярную эру». Отличия организмов по хемотаксономическим признакам зачастую являются определяющими при обосновании выделения нового рода или вида актиномицетов и в настоящее время. Вместе с тем, многие полимеры и крупные молекулы клетки не изучены или слабо исследованы в таксономическом аспекте. В этой связи актуальны работы, направленные на поиск и оценку таксономической значимости новых биомолекул и их структурных компонентов – особенно в связи с выделением из природной среды массивов новых микроорганизмов, обособляющихся от изветсных таксонов на уровне генотипа, но неотличимых от них по традиционно используемым в систематике актиномицетов фенотипическим, в т.ч., хемотаксономическим, признакам.
К настоящему моменту определены структуры тейхоевых кислот и показана возможность использования этих полимеров и их структурных компонентов в качестве хемотаксономических маркеров видов ряда родов актиномицетов, например, Agromyces (Гнилозуб, 1994), Actinomadura, Nonomurea, Brevibacterium (Потехина, 2005). Эти и другие работы продемонстрировали также огромное структурное разнообразие тейхоевых кислот и гликополимеров в этой группе бактерий и перспективность дальнейших исследований в данном направлении.
Цель и задачи исследования.
Цель настоящего исследования – изучение распространения и разнообразия тейхоевых кислот и гликополимеров клеточных стенок у представителей порядка Actinomycetales и оценка коррелятивных связей между наличием и структурой вышеназванных полимеров, с одной стороны, и таксономическим положением и свойствами организмов, с другой.
Среди основных задач исследования можно выделить следующие:
1. Изучение распространения тейхоевых кислот и других гликополимеров у представителей различных родов актиномицетов, относящихся к 12-ти семействам, 9-ти подпорядкам порядка Actinomycetales (более 100 штаммов).
2. Установление структур тейхоевых кислот и других гликополимеров клеточных стенок исследуемых актиномицетов – представителей некоторых видов родов Nocardiopsis (29 штаммов); Glycomyces (4 штамма); Nocardioides (15 штаммов); Streptomyces (14 штаммов), а также Kineosporia aurantiaca.
3. Анализ полученных результатов и имеющихся в литературе сведений и оценка возможности использования вышеназванных полимеров и их структурных компонентов в качестве химических маркеров таксонов.
4. Выяснение взаимосвязи между структурой тейхоевых кислот и гликополимеров клеточных стенок стрептомицетов-возбудителей парши обыкновенной картофеля и корнеплодов и их патогенностью.
Научная новизна работы.
Впервые изучено распространение тейхоевых кислот и других гликополимеров в клеточных стенках, а также моносахаридный состав последних у более 100 штаммов, представителей различных родов актиномицетов, относящихся к 12-ти семействам 9-ти подпорядкам порядка Actinomycetales. Впервые найдены тейхоевые кислоты и другие гликополимеры клеточных стенок и установлены структуры полимеров у 63 (из 100) штаммов актиномицетов, относящихся к 28 видам, 5-ти родам 5-ти семейств 5-ти подпорядков порядка Actinomycetales. Обнаружено и описано 15 новых структур упомянутых биополимеров, среди них 11 тейхоевых кислот, 2 кислых полисахарида – полимер и олигомер Kdn (3-дезокси-D-глицеро-D-галакто-нон-2-улопиранозоновая кислота), тейхуроновая кислота и нейтральный полисахарид. Впервые показана специфичность состава и строения тейхоевых кислот для видов родов Nocardiopsis, Nocardioides, Glycomyces и Streptomyces, что имеет важное значение для усовершенствования системы классификации исследованных групп бактерий. Предложен новый перспективный подход к ревизии таксономической структуры наиболее многочисленного по видовому составу рода Streptomyces, а именно, использование признака “набор и структура тейхоевых кислот и других гликополимеров клеточной стенки” как критерия границ близких видов. В соответствии с отличиями по составу тейхоевых кислот клеточной стенки и с другими фенотипическими признаками, а также с обособленностью на филогенетическом уровне (анализ 16S рРНК), предложен новый вид Nocardioides prauseri sp. nov. и переописаны виды Nocardioides luteus и Nocardioides albus. Впервые показано, что клеточные стенки стрептомицетов, вызывающих паршу обыкновенную у картофеля и корнеплодов, содержат в клеточных стенках более двух анионных полимеров различных по структуре, среди которых – полимер/олигомер Kdn. Эти полимеры, наряду с фитотоксином такстомином и гидролитическими ферментами, по всей вероятности, могут считаться факторами патогенности, обусловливая специфическую адгезию фитопатогена к растению-хозяину на первых этапах развития инфекции. Выявлен ряд новых фитопатогенных актиномицетов рода Streptomyces, филогенетически и фенотипически отличных от ранее известных возбудителей парши обыкновенной картофеля и корнеплодов.
Практическое значение работы.
Полученные в результате проведенных исследований данные о химическом составе и структурных особенностях тейхоевых кислот и других гликополимеров клеточных стенок фитопатогенных стрептомицетов могут служить основой для будущих исследований молекулярных механизмов взаимодействия фитопатогенов и растения-хозяина и разработки новых методов борьбы с возбудителями заболеваний растений. Полученные данные могут быть использованы для создания более совершенной системы идентификации фитопатогенов. На большом фактическом материале убедительно показано, что признак «наличие/отсутствие тейхоевых кислот и других гликополимеров клеточной стенки», а также таксономическая специфичность ряда структурных компонентов, выявляемых методами хроматографии, могут быть успешно применены в повседневной микробиологической практике при идентификации микроорганизмов исследованных групп и решении вопроса о границах таксонов. Подкомитетом по систематике подпорядка Micrococcineae Международного комитета по систематике прокариот рекомендовано определять вышеназванные характеристики при описании новых родов и видов соответствующих групп актинобактерий (Shumann et al., 2009).
Значительно пополнены базы данных спектров ЯМР тейхоевых кислот и других гликополимеров бактериальных клеточных стенок, что внесло определённый вклад в гликологию, химическую микробиологию и может быть использовано при анализе структур близких полимеров в биохимической практике.
Полученные данные о структуре, разнообразии и распространении тейхоевых кислот и других гликополимеров в клеточных стенках представителей порядка Actinomycetales востребованы и цитируются в ведущих современных обзорах и монографиях (Lazarevic et al., 2002; Seltmann and Holst, 2002; Neuhaus and Baddiley, 2003; Weidenmaier and Peschel, 2008) и авторитетном международном руководстве по микробиологии – “The Procaryotes” (Kroppenstedt and Evtushenko, 2006). Кроме того, эти данные могут быть включены в курсы по биохимии и микробиологии на биологических факультетах высших учебных заведений.
Основные защищаемые положения диссертации.
● тейхоевые кислоты и гликополимеры широко распространены в клеточных стенках представителей прядка Actinomycetales, однако доминируют тейхоевые кислоты;
● тейхоевые кислоты и гликополимеры клеточных стенок представителей порядка Actinomycetales проявляют чрезвычайно широкое структурное разнообразие;
● набор и структура тейхоевых кислот и гликополимеров клеточных стенок представителей порядка Actinomycetales являются таксономически значимой фенотипической характеристикой таксонов разных уровней (от подпорядка до вида);
● клеточные стенки фитопатогенных стрептомицетов характеризуются ярко выраженными анионными свойствами, которые обеспечены наличием в них комплекса кислых полимеров гетерогенного состава: тейхоевыми и тейхуроновыми кислотами с пировиноградной или глутаминовой кислотой в качестве дополнительного кислого компонента, кислыми поли/олигосахаридами;
● выявление новых структур гликополимеров клеточной стенки может служить не только маркером новых видов или подвидов актиномицетов, но и указывать на неизвестные до сего времени экологические функции изучаемых организмов.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на Всесоюзной конференция «Регуляция микробного метаболизма» (Пущино, 1989); Международных симпозиумах по биологии актиномицетов (Madison, 1991; Москва, 1994); Всероссийской конференции «Биосинтез и деградация микробных полимеров. Фундаментальные и прикладные аспекты» (Пущино, 1995); Международной конференции «Микробное разнообразие» (Пермь, 1996); Втором съезде Биохимического общества Российской АН, Москва, 1997); Международном симпозиуме «Современные проблемы биохимии микроорганизмов и биотехнологии» (Пущино, 2000); Втором Германо-Польско-Российском съезде по углеводам бактерий (Москва, 2002); Первой Всероссийской конференции по иммунитету растений к болезням и вредителям (Санкт-Петербург, 2002); Первом конгрессе FEMS Европейских микробиологов (Ljubljana, 2003); II Московском международном конгрессе по биотехнологии (Москва, 2003); III Всероссийской школе-конференции «Химия и биохимия углеводов» (Саратов, 2004); Всероссийском симпозиуме «Биотехнология микробов», (Москва, 2004); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2005); Международном конгрессе коллекций культур микроорганизмов (Göslar, 2007); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 45 работ, из них обзор и 24 экспериментальные статьи в рекомендуемых ВАК’ом изданиях; тезисы 20 докладов.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 350 страницах машинописного текста и состоит из введения, 9-ти глав, включающих материалы литературных источников, касающиеся темы данной работы (3 главы обзора литературы), краткой характеристики объектов и методов исследований (одна глава), изложения результатов собственных исследований (4 главы), а также главы, посвященной обсуждению полученных результатов. Кроме того, имеется общее заключение и выводы. Работа содержит 64 таблицы, 54 рисунка. Список цитируемой литературы содержит 720 ссылок. В Приложении приведён полный список исследованных штаммов актиномицетов с указанием обнаруженных моносахаридов, а также наличия (отсутствия) тейхоевых кислот в их клеточных стенках; таблицы баз данных по ЯМР-спектрам найденных тейхоевых кислот и других гликополимеров.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Обзор литературы
Тейхоевые кислоты и другие гликополимеры клеточных стенок грамположительных бактерий: структурное разнообразие, распространение и некоторые функции, экологические аспекты.
Главы I, II, III. В литературном обзоре представлены сведения, касающиеся строения бактериальной клеточной стенки; разнообразия структурных вариаций, распространения и некоторых функций тейхоевых кислот и других гликополимеров клеточных стенок грамположительных бактерий. Особое внимание уделено названным полимерам клеточных стенок представителей порядка Actinomycetales. Приведены сведения, касающиеся современной классификации актиномицетов. Отмечена особая значимость хемотаксономических признаков, отражающих химический состав и строение клетки и клеточной стенки и являющихся одной из наиболее значимых групп фенотипических признаков в систематике актиномицетов. Обоснована актуальность и перспективность изучения тейхоевых кислот и других гликополимеров клеточной стенки с целью использования для развития системы классификации актиномицетов. Представлены сведения о фитопатогенных стрептомицетах, их видовом составе, а также данные об известных к настоящему времени возможных факторах патогенности, в числе которых некоторые биополимеры клеточных стенок.
Экспериментальная часть
Глава IV. Материалы и методы, использованные в работе. В работе использован ряд микробиологических, химических, биохимических, инструментальных методов исследования. Методики, как правило, были описаны в литературе ранее и модифицированы для решения поставленных в работе задач. Исследовано более 100 штаммов актиномицетов, относящихся к различным родам актиномицетов из 12-ти семейств 9-ти подпорядков порядка Actinomycetales (ссылка скрыта) из различных коллекций микроорганизмов, в том числе ИНА, ВКМ и НИИ картофелеводства БелНАН. Морфологические и культуральные признаки определяли как описано Гаузе и др. (1983). Биомассу, собранную на логарифмической фазе роста, использовали для получения клеточных стенок (Стрешинская и др., 1979). Пептидогликан получали по модифицированному методу (Elliott et al., 1975). Анализ сахаров в кислотных гидролизатах клеточных стенок изучаемых актиномицетов, а также изомеров диаминопимелиновой кислоты в пептидогликане после его кислотного гидролиза, осуществляли методом хроматографии на бумаге сравнением со стандартными образцами (Стрешинская и др., 1989). Фосфолипиды определяли по методу, описанному ранее (Minnikin et al., 1984; O’Donnel et al., 1985). Тейхоевые кислоты (ТК) и гликополимеры экстрагировали 10%-ной трихлоруксусной кислотой (ТХУ) из клеточных стенок и обезжиренного мицелия. Очистку проводили на DEAE-Toyopearl 650M в линейном градиенте NaCl (0–0,5 М), методом препаративного высоковольтного электрофореза, а также фракционировали с помощью дробного осаждения этанолом (Tul’skaya et al., 1991).
Таблица 1. Основные продукты кислотного (2 М HCl, 100°, 3 ч) и щелочного (1 М NaOH, 100°, 3 ч) гидролизов изученных ТК.
| Тейхоевая кислота | Основные продукты гидролиза | ||
| Тип ТК | Структура ТК | Кислотный гидролиз | Щелочной гидролиз |
| I G, 1,3 | 1,3-поли(глицерофосфат) | GroP; GroP2; Gro; Pi; С/З* | GroP; GroP2; Gro2P3; Pi; ФЭ** |
| I G, 2,3 | 2,3-поли(глицерофосфат) | GroP; GroP2; Gro; Pi; С/З | GroP; GroP2; Pi; ФЭ* |
| I R, 1,5 | 1,5-поли(рибитфосфат) | RboP; AhRboP; RboP2; Rbo; AhRbo; Pi; С/З | RboP; RboP2; Pi; ФЭ* |
| I R, 3,5 | 3,5-поли(рибитфосфат) | RboP; RboP2; Rbo; AhRbo; Pi | RboP; RboP2; Rbo; AhRbo; Pi |
| II GS, 3,3 | Поли(гликозилглицерофосфат) | GroP; Gro; Pi; С/З | Gro; ФЭ |
| IV GS | Поли(глицерофосфат-гликозилглицерофосфат) | GroP; GroP2; Gro; Pi; С/З | GroP; GroP2; Pi; ФЭ; Э3 |
Gro-глицерин; GroP-глицерофосфат; GroP2-бисфосфат глицерина; Gro2P3-диглицеринтрифосфат; Rbo-рибит; AhRbo-ангидрорибит; RboP-рибитфосфат; AhRboP-ангидрорибитфосфат; RboP2-бисфосфат рибита; Pi минеральный фосфат; ФЭ – фосфорные эфиры; Э3 – см. раздел 5.1.;
* боковой заместитель на остатке полиола или сахарид в коре полимера;
** фосфорные эфиры образуются при наличии заместителей на остатках полиола.
Первичную структуру ТК и гликополимеров, а именно: качественный состав (вид полиола, наличие и природа заместителей, моносахаридный состав), строение мономерных единиц, локализацию фосфодиэфирной связи, изучали химическими методами. Последние основаны на расщеплении молекулы полимера (кислотный, щелочной, ферментативный гидролизы) и изучении качественного и количественного состава полученных фрагментов, подвижности последних в электрическом поле (высоковольтный электрофорез) и в различных хроматографических системах относительно стандартных образцов, способности окрашиваться различными проявителями. Анализируя фосфорные эфиры полиолов, можно предварительно говорить о типе ТК (табл. 1). Абсолютную конфигурацию некоторых заместителей определяли, как описано (Gerwig et al., 1979; Gorshkova et al., 1997; Shashkov et al., 2006). Данные о строении фрагментов анализировали, что позволяло реконструировать структуру полимера (Kelemen and Baddiley, 1961). Молекулярные массы ТК определяли с помощью гельфильтрации на сефадексе G-50 (Tul’skaya et al., 1991). Результаты химических исследований подтверждали методами ЯМР-спектроскопии (Shashkov et al., 2001). Применялись также методы MALDI TOF масс-спектроскопии для определения структуры и молекулярной массы олигомера Kdn (Shashkov et al., 2002 а). Определение патогенности на картофеле и проростках редиса осуществляли по описанному методу (Goyer et al., 1998). Наличие такстомина в культуральной жидкости исследуемого стрептомицета проводили методом тонкослойной хроматографии.
Для определения нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК использовали универсальные бактериальные праймеры 27f (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG), 530f (5'-GTGCCAGCAGCCGCGC) и 1492r (5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT). Определение нуклеотидной последовательности 16S рРНК проводили на автоматическом секвенаторе CEQ2000 XL (Beckman Coulter, США) в соответствии с предлагаемым фирмой протоколом. Для филогенетического анализа полученную нуклеотидную последовательность гена 16S рРНК изучаемого организма выравнивали с последовательностями типовых и референтных штаммов с помощью программы CLUSTAL W. Эволюционное расстояние рассчитывали по алгоритму (Ohta and Kimura, 1971; Kimura and Ohta 1973). Для ДНК-ДНК гибридизации Н3-меченную ДНК получали с использованием (1',2',5'-3H) дезоксицитидин-трифосфата и ферментов для ник-трансляци N 5500 (Amersham). ДНК-ДНК гибридизацию проводили на мембранных фильтрах (“Hiiu Kalur”, Таллин, Эстония) в оптимальных условиях (раствор Денхарда с 50% формамида (об/об), 50° С, 24 ч), как описано (Tijssen, 1993).
Результаты исследований