Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова биологический факультет на правах рукописи
| Вид материала | Автореферат |
- М. В. Ломоносова биологический факультет н а правах рукописи Столяров Андрей Павлович, 657.12kb.
- Xxi столетия Дунаева Светлана Олеговна, 37.07kb.
- Институциональное развитие местного самоуправления в российской федерации 23. 00., 689.31kb.
- Факультет дополнительного образования, 54.13kb.
- На правах рукописи, 514.74kb.
- Секция «почвоведение» Кинетика поглощения гуминовых кислот угля проростками пшеницы, 2613.34kb.
- Модель оценки инвестиционного климата российских регионов в условиях неопределенности, 111.18kb.
- М. В. Ломоносова филологический факультет слово грамматика речь выпуск II сборник научно-методических, 97.35kb.
- На правах рукописи, 584.81kb.
- Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова Факультет иностранных языков, 296.78kb.
В связи с огромной ролью, которую играют ТК в жизнедеятельности микробной клетки, а также в связи с таксономической значимостью этих биополимеров, нами были продолжены исследования по изучению распространения ТК в клеточных стенках организмов порядка Actinomycetales. Кроме того, параллельно в клеточных стенках многих из исследованных организмов был изучен моносахаридный состав, что также представляет таксономическую ценность.
Таблица 6. Распространение тейхоевых кислот среди представителей различных
таксонов порядка Actinomycetales.
| Подпорядок, семейство | ТК | Таксоны имеющие ТК |
| Подпорядок Streptosporangineae Сем. Nocardiopsaceae Сем. Streptosporangiaceae* Сем. Thermomonosporaceae* | + + + | Все изученные виды |
| Подпорядок Glycomycineae Сем. Glycomycetaceae | + | Все виды Glycomyces |
| Подпорядок Corynebacterineae Сем. Corynebacterineae Сем. Gordoniaceae Сем. Nocardiaceae Сем. Mycobacteriaceae | − − − − | |
| Подпорядок Pseudonocardineae Сем. Actinosynnemataceae Сем. Pseudonocardiaceae | − − | |
| Подпорядок Frankineae Сем. Geodermatophilaceae* Сем. Frankiaceae* Сем. Kineosporiaceae | − − В | Kineosporia aurantiaca |
| Подпорядок Streptomycineae Сем. Streptomycetaceae | В | Все виды Streptomyces; Следы поли(GroP) у Kitasatospora spp.* |
| Подпорядок Micrococcineae Сем. Brevibacteriaceae* Сем. Rarobacteraceae* Сем. Cellulomonadaceae* Сем. Intrasporangiaceae* Сем. Promicromonosporaceae Сем. Dermabacteraceae* Сем. Microbacteriaceae* Сем. Micrococcaceae* | + + − − − В В В | Некоторые виды Brachybacterium* Некоторые виды Agromyces* Группа «Arthrobacter nicotinae»* |
| Подпорядок Micromonosporineae Сем. Micromonosporaceae* | В | Все виды Spirilliplanes Большинство видов Actinoplanes |
| Подпорядок Propionibacterineae Сем. Nocardioidaceae Сем. Propionibacteriaceae* | + − | Aeromicrobium, Nocardioides |
В – признак вариабелен у представителей таксона;
* - данные по ряду организмов указанных родов взяты из публикаций: Евтушенко и др., 1984; Наумова и Шашков, 1997; Козлова и др., 2000; Потехина, 2006; Fiedler and Schäffler, 1987; Takeuchi and Yokota, 1989; Schubert et al., 1993; Evtushenko et al., 2007.
7.1. Распространение тейхоевых кислот в клеточных стенках некоторых представителей порядка Actinomycetales.
Всего в данной работе обследовано более 100 штаммов различных родов актиномицетов, относящихся к 12-ти семействам 9-ти подпорядкам порядка Actinomycetales. Как видно из табл. 6, организмы ряда высших таксонов (подпорядки и семейства), характеризуются наличием или отсутствием ТК. Последние обнаружены в клеточных стенках у всех изученных актиномицетов подпорядков Glycomycineae и Streptosporangineae и не выявлены у представителей подпорядка Corynebacterineae и Pseudonocardineae. Не содержат ТК в клеточных стенках и большинство изученных штаммов подпорядка Frankineae. В случае вариабельности признака «наличие ТК» внутри высших таксонов, признак характерен для всех организмов более узких филогенетических групп (родов или близких видов в составе рода).
Можно также отметить, что ТК обычно свойственны организмам с хорошо развитым воздушным мицелием и сложными репродуктивными структурами, реже встречаются у нокардиоформных и палочковидных организмов и не выявлены у кокковых форм. Полимеры обнаружены у абсолютного большинства изученных организмов, включая Kineosporia aurantiaca, содержащих LL-диаминопимелиновую кислоту в пептидогликане. Доля ТК в клеточной стенке нокардио- и коринеформных организмов (семейство Nocardioidaceae) обычно ниже, чем у спорообразующих (напр., Streptomycetaceae). ТК не обнаружены у анаэробов семейства Propionibacteriacea, а также у организмов с арабиногалактаном или арабиногалактаном и миколовыми кислотами в клеточных стенках (подпорядки Corynebacterineae и Pseudonocardineae), у организмов с муреином Б-типа (семейство Microbacteriaceae), за исключением единичных видов рода Agromyces (Гнилозуб, 1994), и у абсолютного большинства организмов (включая спорангиальные) с лизином и орнитином в составе муреина. Исключение – Rarobacter (Takeuchi and Yokota, 1989), а также ряд филогенетически обособленных видов рода Arthrobacter (семейство Micrococcaceae, Fiedler and Schäffler, 1987), которые, видимо, должны быть выведены из состава рода.
В качестве примера практического использования на ранних этапах работы признака “наличие ТК” можно привести нашу работу (Стрешинская и др., 1989 г.) по уточнению таксономического положения ряда видов рода Nocardiopsis, сходных с Saccharothrix морфологически и по типу клеточной стенки (III C). Было исследовано 9 штаммов видов Nocardiopsis и Saccharothrix и выявлено две группы организмов внутри рода Nocardiopsis. К первой относились четыре штамма видов N. dassonvillei и N. trеhalosi (доминирующий моносахарид клеточной стенки – глюкоза, клеточные стенки содержали ТК глицерофосфатной природы). Вторую группу составили N. atra, N. coeruleofusca, N. longispora и N. syringae (доминирующий моносахарид клеточной стенки – галактоза, ТК отсутствуют). Виды второй группы по указанным критериям и ряду других характеристик оказались близкими к изученным Saccharothrix spp. Было сделано предположение, что их следует вывести из состава рода Nocardiopsis и отнести к Saccharothrix. Впоследствии зарубежными авторами было подтверждено это предположение и представители второй изученной нами группы (N. coeruleofusca, N. longispora и N. syringae) реклассифицированы в род Saccharothrix (Grund and Kroppenstedt, 1990).
7.2. Моносахариды в клеточных стенках изученных актиномицетов.
Состав диагностических моносахаридов клеточной стенки, определяемый обычно в препаратах целых клеток, наряду с диаминокислотой пептидогликана, предложенный в качестве хемотаксономического признака, дифференцирующего роды (группы родов) в период становления хемотаксономического направления в систематике актиномицетов (Lechevalier and Lechevalier 1970a,b,c), продолжает успешно использоваться и в настоящее время. Признак несет информацию о специфических для определенных групп организмов компонетах клеточной стенки. Для ряда мицелиальных организмов метод определения сахаров в целых клетках даёт те же результаты, что и в препаратах клеточных стенок, однако последний метод более инфрмативен и позволяет выявлять дополнительные диагностические для таксона моносахариды (например, глюкозу, рибозу, галактозу). Помимо клеточной стенки, такие сахара могут происходить из цитоплазмы, капсул и экзополисахаридов, и традиционно не рассматривались в качестве диагностических. Так, например, принято считать, что для стрептомицетов характерен тип клеточной стенки I – LL-диаминопимелиновая кислота и отсутствие «дифференцирующих» сахаров.
Сравнительный анализ опубликованных и наших данных по «сахарам клеточных стенок» (определяются на первых этапах изучения структуры ТК и других гликополимеров) показал, что моносахариды, не относящиеся к группе «дифференцирующих сахаров», часто входят в состав этих полимеров и в ряде случаев являются важной дополнительной характеристикой таксона. Так, галактоза является ценным химическим маркером группы видов стрептомицетов из кластера “S. violaceusniger”, галактоза и манноза (происходящие из галактоманнана) характерны для Kineosporia aurantiaca, наличие галактозы (глюкозы) свойственно ряду видов Nocardiopsis и Saccharothrix (см. выше), и т.д. Изучение состава сахаров препаратов клеточных стенок позволяет также выявить моносахариды, считавшиеся ранее не свойственными представителям того или иного рода (например, мадуроза для ряда видов стрептомицетов).
С другой стороны, обнаружение у штамма нового моносахарида, не найденного в составе клеточных стенок известных (близких) видов, с высокой степенью вероятности свитетельствует о том, что такой штамм относится к новому таксону. Специфичность биосинтеза «нового» сахара и полимера, включающего такой сахар, обусловлена специфичностью соответствующих локусов генома микроорганизма.
При изучении 6-ти новых изолятов рода Kribbella в клеточной стенке 3-х штаммов нами были выявлены редкий сахар 2,3-ди-О-метил-D-галактопираноза и высший сахар – псевдаминовая кислота. Клеточные стенки двух других штаммов содержали 2,4-диацетамидо-2,4-дидезокси-D-глюкозу – впервые обнаруженный сахар (названный крибелозой), который сходен с бацилозамином (Schäffer et al., 2001), отличающемся от вновь найденного наличием О-метильной группы у пятого атома углерода глюкозы. В клеточной стенке еще одного штамма обнаружен редкий диаминосахар – 2,3-диацетамидо-2,3-дидезокси-D-глюкоза. Изученные штаммы содержали также в клеточной стенке то или иное количество галактозы и маннозы. Отличия изученных штаммов от известных видов рода по составу моносахаридов, входящих в полимеры, связанные с пептидогликаном, позволяют предполагать, что они принадлежат как минимум к трем новым видам рода Kribbella. Вопрос о видовой принадлежности этих изолятов будет решен в дальнейшем на основании изучения фенотипических и генотипических характеристик.
Глава VIII. Экологические аспекты изучения анионных углеводсодержащих полимеров клеточных стенок актиномицетов.
Среди множества обитающих в почве сапрофитных видов стрептомицетов в возрастающем количестве обнаруживаются фитопатогенные организмы, вызывающие экономически значимые заболевания сельскохозяйственных растений, включая паршу картофеля обыкновенную (Takeuchi et al., 1996; Loria et al., 1997; Bouchek-Mechiche et al., 2000; Bukhalid et al., 2002). Основными факторами патогенности известных стрептомицетов-возбудителей парши являются фитотоксин (такстомин), ингибирующий биосинтез целлюлозы, некротический белок и гидролитические ферменты (Loria et al., 1997; Bukhalid et al., 2002). Вместе с тем, сведения о механизме взаимодействия патогена с растением-хозяином, в который, несомненно, вовлечены поверхностные структуры клеточной стенки фитопатогена, крайне фрагментарны. Обнаружение (Shashkov et al., 2000) у фитопатогенного штамма Streptomyces sp. ВKM Ac-2090, наряду с тейхоевой кислотой, полимера Kdn, обладающего адгезивными свойствами по отношению к тканям растения, положило начало исследованиям по выявлению особенностей строения анионных полимеров клеточной стенки у возбудителей парши картофеля в связи с возможным участием этих полимеров в патогенезе.
Нами были исследованы анионные полимеры клеточных стенок у 13 штаммов - изолятов из пораженных паршой клубней картофеля различных сортов, почвы картофельных полей, а также представителей типовых штаммов известных «почвенных» видов, таксономически близких к фитопатогенам (табл.7). Кроме того, были проведены эксперименты по проверке вирулентности, определению такстомина и целлюлозолитической активности у вышеупомянутых и других организмов, у котрых были обнаружены аналогичные по структуре полимеры клеточных стенок (табл.7). С целью идентификации штаммов, были также определены нуклеотидные последовательности фрагмента гена 16S рРНК. На основании полученных данных, было установлено, что рассматриваемые объекты относятся к 3 филогенетическим группам: “Streptomyces scabei”, “Streptomyces setonii-griseus” и “S. violaceusniger” (табл. 8).
Таблица 7. Вирулентность, синтез такстомина и наличие Kdn у изученных штаммов фитопатогенных стрептомицетов
| Номер п/п | Название культуры | Вирулентность | Kdn | Таксто-мин | |
| Карто-фель | редис | ||||
| 1 | *Streptomyces sp. ВКМ Ас-304 | ++ | +++ | + | + |
| 2 | *Streptomyces sp. ВКМ Ас-305 | + | +++ | + | + |
| 3 | *Streptomyces sp. ВКМ Ас-306 | ++ | +++ | + | + |
| 4 | Streptomyces sp. ВКМ Ас-2274 (МВ-8) | ++ | н.о. | + | + |
| 5 | S. hygroscopicus ssp. hygroscopicus ВКМ Ac-831T | +++ | н.о. | + | - |
| 6 | S. violaceusniger ВКМ Ас-583 T | ++ | н.о. | + | - |
| 7 | S. endus ВКМ Ac-1331T | +++ | ++ | + | - |
| 8 | S. endus ВКМ Ac-129 | +++ | +++ | + | - |
| 9 | S. castelarensis ВКМ Ac-832T | +++ | н.о. | + | - |
| 10 | S. melanosporofaciens ВКМ Ас-1864 T | +++ | н.о. | + | - |
| 11 | *S. griseus ssp. cretosus ВКМ Ac-712T | +++ | ++ | + | - |
| 12 | *S. griseus ssp. griseus ВКМ Ac-800T | н.о. | ++ | + | - |
| 13 | *Streptomyces sp. ВКМ Ас-841 | ++ | н.о. | - | - |
| 14 | *S. flavogriseus ВКМ Ac-1325T | н.о. | н.о. | - | - |
| 15 | *Streptomyces sp. ВКМ Ac-2117 (ОБИ-7) | +++ | н.о. | + | - |
| 16 | *Streptomyces sp. ВКМ Ac-2124 (ОИЗ-4) | +++ | н.о. | + | - |
| 17 | *Streptomyces sp. ВKM Ac-2277 (B-15) | + | н.о. | + | - |
| 18 | *Streptomyces sp. ВКМ Ac-2528 | ++ | н.о. | - | - |
| 19 | Streptomyces sp. МВ-2 | ++ | н.о. | + | - |
| 20 | Streptomyces sp. МВ-5 | ++ | - | - | - |
| 21 | Streptomyces sp. МВ-6 | ++ | ++ | + | - |
| 22 | Streptomyces sp. МВ-7 | ++ | н.о. | + | - |
| 33 | Streptomyces sp. MB-10 | ++ | ++ | + | - |
| 24 | Streptomyces sp. ВКМ Ac-2534 (Ив-219) | +++ | +++ | - | - |
Примечания: н.о. – не определяли; * Штаммы, полимеры которых изученны Г.М. Стрешинской и Л.Н. Космачевской; штаммы МБ и Ив – получены из Белорусского НИИ картофелеводства БелАН.
Первая включает штаммы, имеющие практически идентичную последовательность гена 16S рРНК (99,9%) с типовым штаммом S. scabiei ATCC 49173T (типичным возбудителем
Таблица 8. Тейхоевые кислоты и гликополимеры клеточных стенок изученных фитопатогенных стрептомицетов.
| Под-группа | Штамм | Тейхуроновая кислота | Тейхоевая кислота | Kdn* | |
| Группа Streptomyces scabei (99,9% сходства нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК со S. scabei ATCC 49173T) | |||||
| 1 | Streptomyces sp. ВКМ Ac-305 | нет | TК1: 2,3- поли(глицерофосфат); TК2: 1,3- поли(глицерофосфат); TК3: 1,3- поли(глицерофосфат) с -D-GlcNАс | Kdn-полимер с -D-Galp и -D-Galp3OMe | |
| 2 | Streptomyces sp. ВКМ Ac-304 | нет | то же, а также ПС♦ | Kdn-полимер с -D-Galp и -D-Galp3OMe | |
| Streptomyces sp. ВКМ Ac-306 | нет | то же, а также ПС♦ | Kdn-полимер с -D-Galp и -D-Galp3OMe | ||
| 3 | Streptomyces sp. ВКМ Ac-2274 | нет | TК2: 1,3- поли(глицерофосфат); TК3: 1,3- поли(глицерофосфат) с -D-GlcNАс | Олигомер Kdn с -D-Galp и -D-Galp3OMe | |
| Группа Streptomyces setonii-griseus (99,2-99,7% сходства нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК со S. setonii ATCC 25497T) | |||||
| 1 | Streptomyces sp. ВKM Ac-2124 1) S. flavogriseus ВKM Ac-1325 T | 4)--D-Manp2,3NAcA-(16)--D-Glcp-(1 то же | 1,5-поли(рибитфосфат) с -Glcp то же | Полимер Kdn с -Glcp нет | |
| 2 | Sreptomyces sp. ВKM Ac-2528 | 1) 4)--D-Manp 2,3NAcA-(16)--D-GlcpNAc-(1 2) 4)--D-Glcp2,3NAcA-(16)--D-GlcpNAc-(1 | то же | нет | |
| 3 | Streptomyces sp. ВKM Ас-2117 2) “S. flavovirens” MB-7 S. griseus ssp. griseus ВKM Ac-800T | 4)--D-Manp2,3NAcA-(13)- -D-GalpNAc-(1 то же то же | 1,5-поли(рибитфосфат) с -Glcp так же так же | Полимер Kdn с -Glcp – сл Полимер Kdn с -Glcp Полимер Kdn с -Glcp – сл | |
♦ ПС: полисахарид 6)--d-GalpNAc-(1→3)--d-GalpNAc-(1, (Козлова и др., 2006); 1) Shashkov et al., 2002b; 2) Шашков и др., 2001
Продолжение Табл. 8.
| 4 | Streptomyces sp. MБ-2 Streptomyces sp. MБ-5 Streptomyces sp. MБ-6 Streptomyces sp. ВКМ Ас-841 Streptomyces sp. ВКМ Ас-2277 | 4)--D-Manp2,3NAcA-(13)--D-GalpNAc-(1 то же то же то же то же | 1,5-поли(рибитфосфат) с -Glcp и 1,5-поли(рибитфосфат) с Pyr то же то же то же то же | Полимер Kdn с -Glcp нет Полимер Kdn с -Glcp нет Полимер Kdn с -Glcp – сл | |
| 5 | Streptomyces sp. ВКМ Ас-2534 | 4)--D-Manp2,3NAcyA-(13)--D-GalpNAc-(1, где Acy – ацетил или L-Glu | 1,5-поли(рибитфосфат) с -Glcp и/или -D-GlcpNAc | нет | |
| 6 | Sreptomyces griseus ssp. cretosus ВКМ Ас-712 Streptomyces sp. МБ-10 | нет нет | 1,5-поли(рибитфосфат) с -Glcp то же | Полимер Kdn с -Glcp то же | |
| Группа “S. violaceusniger”(Williams et al., 1983, до 99,7% сходства нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК с S.violaceusniger) | |||||
| 1 | S. hygroscopicus ssp. hygroscopicus ВКМ Ac-831T | нет | TК1: 2,3- поли(глицерофосфат); TК2: 1,3- поли(глицерофосфат); TК3: 1,3- поли(глицерофосфат) с -D-GlcpNАс | Kdn-полимер с -D-Galp | |
| 2 | S.violaceusniger ВКМ Ас-583 T | нет | то же | то же | |
| 3 | S. endus ВКМ Ac-1331T | нет | то же | то же | |
| 4 | S. endus ВКМ Ac-129 | нет | то же | то же | |
| 5 | S. castelarensis ВКМ Ac-832T | нет | то же | то же | |
| 6 | S. melanosporofaciens ВКМ Ас-1864 T | нет | то же | то же | |
*Kdn, 3-дезокси-d-глицеро-d-галакто-нон-2-улопиранозоновая кислота
парши обыкновенной клубней картофеля и корнеплодов; Loria et al., 1997). При этом штамм Ас-305 характеризовался наличием трех ТК: основная – 1,3-поли(глицерофосфат) с α-N-ацетилглюкозамином и минорные – незамещенные 1,3- и 2,3-поли(глицерофосфаты). Два других штамма Ас-304 и Ас-306 имели такой же набор ТК плюс полисахарид. Во всех трех штаммах обнаружен полимер Kdn с -галактозой и -3-О-метилгалактозой (мадурозой), табл. 8. Штамм Ас-2274 содержал лишь две ТК, а Kdn был в виде олигомера, в отличие от вышеупомянутых штаммов. На основании отличий в наборе и структурах ТК и гликополимеров клеточных стенок, среди представителей данной группы можно выделить подгруппы, соответствующие трем хемотипам клеточной стенки (табл. 8). Интересно отметить, что только в эту группу вошли штаммы, синтезирующие такстомин (табл. 7).
Вторую геногруппу составили штаммы, филогенетически (16S рРНК) близкие к типовому штамму S. setonii ATCC 25497Т, вызывающему паршу обыкновенную картофеля (Takeuchi et al., 1996). Интересно отметить, что S. setonii и S. griseus ssp. griseus имеют 99,7% сходства генов 16S рРНК (Takeuchi et al., 1996; Liui et al., 2005). Для всех членов этой группы характерно наличие в клеточных стенках 1,5-поли(рибитфосфата) в той или иной степени замещенного -глюкозой (табл. 8). У пяти штаммов был дополнительно обнаружен 1,5-поли(рибитфосфат), замещенный по гидроксилам при С2,4 рибита остатком пировиноградной кислоты. Почти все штаммы содержали поли-Kdn с -глюкозой, а также тейхуроновые кислоты, различные по структурам (обнаружены впервые). Исключение составили штаммы “griseus”, в которых тейхуроновые кислоты отсутствовали вовсе. Наконец, штамм Ас-2534 имел более сложные по структуре тейхоевую и тейхуроновую кислоты. Таким образом, по набору и структуре ТК и гликополимеров клеточных стенок исследованные представители группы «Streptomyces setonii-griseus» разделились на 6 хемотипов.
Третья группа (табл. 8) представлена штаммами, входящими в филогенетический кластер « S. violaceusniger». Виды этой группы (S. violaceusniger, S. hygroscopicus ssp. hygroscopicus, S. endus, S. castelarensis и S. melanosporofaciens) известны как типичные сапрофитные обитатели почвы, не входящие в список известных фитопатогенов (Young et al., 1995; 2004). Обнаружение в их клеточных стенках кислого полимера Kdn, замещенного -галактозой и состоящего примерно из 20 повторяющихся единиц, побудило проверить патогенные свойства этих организмов. Было обнаружено, что все взятые в эксперимент штаммы поражают клубни картофеля и ингибируют развитие проростков редиса (табл. 7). Такстомин не был найден, но выялены экстрацеллюлярные целлюлозолитическая и ксиланолитическая активности (Барышникова и др., неопубликованные данные), которые, по-видимому, могут быть причиной поражения клубней при контакте микроорганизмов с клетками растения в условиях модельного опыта.
Таким образом, изученные организмы содержат в клеточных стенках набор анионных углеводсодержащих полимеров: тейхоевых и тейхуроновых кислот, в том числе с пировиноградной или глутаминовой кислотой, усиливающими анионные свойства этих полимеров, а также полимеров/олигомеров Kdn. Подобные кислые структуры, несомненно, участвуют в инфекционном процессе, обусловливая адсорбцию фитопатогена к клетке растения-хозяина. Отличия по структурам ТК и гликополимеров клеточных стенок изученных фитопатогенных штаммов от близких референтных культур, наряду с данными о видоспецифичности таких полимеров для ряда других родов актиномицетов, однозначно указывают на то, что изученные организмы представляют собой несколько видов.