Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова биологический факультет на правах рукописи

1   2   3   4   5   6

Фракция I, элюирована при 0,16–0,19 М NaCl. Продукты кислотной и щелочной деградации указывали на поли(рибитфосфатную) природу ТК1 без заместителей (табл. 1). При периодатном окислении ТК1 образовался формальдегид в эквимольном

отношении к фосфору, что указывало на необычное положение фосфодиэфирной связи. Исходя из имеющихся данных о биосинтезе ТК [от соответствующего нуклеотида к растущей цепи переносится D-рибит-5-фосфат (Baddiley, 1972)], в образовании фосфодиэфирной связи должна участвовать гидроксильная группа при С5 рибита. Тогда вторая гидроксильная группа, участвующая в образовании фосфодиэфирной связи, находится при С3 рибита. Молекулярная масса полимера составила 5,6 кДа (рис. 3), соответственно, цепь полимера состояла из 26-27 рибитфосфатных звеньев. Предполагаемая структура подтверждена методами ЯМР-спектроскопии. Таким образом, ТК 1 представляла собой незамещенный 3,5-поли(рибитфосфат) и являлась новой структурой, рис. 6 ж, (Tul’skaya et al., 1995).

Фракция II, элюирована при 0,22 М NaCl. Профили кислотного и щелочного гидролизов фракции указывали на поли(глицерофосфатную) природу ТК2 (табл. 1), в состав которой в качестве заместителя входит глюкозамин. В HF-гидролизатах ТК2 обнаружен гликозид, идентифицированный как GlcpNAc-(1→2)-snGro. Учитывая структуру гликозида, а также факт образования при щелочном гидролизе полимера щелочестабильных фосфодиэфиров глицерина, был сделан вывод, что ТК2 является 1,3-поли(глицерофосфатом), в котором часть глицериновых остатков замещена N-ацетилглюкозамином. Молекулярная масса ТК2 составляла 7,6 кДа, что соответствует, исходя из мольного содержания компонентов полимера, 40-41 глицерофосфатному звену (рис. 3). Спектр ¹³С-ЯМР ТК2 был типичным для замещенного на 10% α-N-ацетилглюкозамином 1,3-поли(глицерофосфата), рис. 6 з, (Tul’skaya et al., 1995).

Фракция III, элюирована при высокой концентрации NaCl (~ 0,3 М). Это указывало на бόльший отрицательный заряд ТК3 из этой фракции, чем у ТК1 и ТК2 (рис. 2), что подтверждадено высокой подвижностью ТК3 в электрическом поле (m_GroP 1,96). Продукты кислотного гидролиза свидетельствовали о поли(рибитфосфатной) природе ТК3 (табл. 1), а идентифицированная при этом пировиноградная кислота, видимо, являлась заместителем в молекуле изучаемой ТК. Устойчивость ТК3 к действию щелочи свидетельствовала об отсутствии свободных гидроксильных групп, соседних с фосфодиэфирными группами (Kelemen and Baddiley, 1961), а устойчивость к периодатному окислению указывала на отсутствие в полимере незамещенных гликольных группировок. Можно было предположить, что рибитные остатки замещены пировиноградной кислотой, связанной кетальной связью, которая стабильна в щелочных условиях (Thurow et al., 1975). Молекулярная масса ТК3 составляла 5,4 кДа, что соответствует примерно 18 повторяющимся звеньям (рис. 3).

ЯМР-спектроскопическое исследование подтвердило предполагаемую структуру: 1,5-поли(рибитфосфат) полностью замещенный по гидроксилам при С2,4 рибита кетально связанной пировиноградной кислотой (рис. 6 и). ТК такой структуры выявлена впервые (Tul’skaya et al., 1995).

Соотношения найденных ТК в клеточных стенках трех изучаемых штаммов, установленные при количественном определении глицерина и рибита в них с учетом полного замещения рибитных остатков пировиноградной кислотой в ТК3, разные. Является ли этот факт штаммовым признаком – предмет дальнейших исследований на большей выборке штаммов одного вида.

N. prasina ВКМ Ас-1880^Т. В кислотных гидролизатах клеточной стенки и ТХУ-препарата обнаружены фосфорные эфиры глицерина и рибита, что могло свидетельствовать о присутствии нескольких ТК. Разделение и очистку ТК, выделенной из целого обезжиренного мицелия, осуществляли с помощью метода ионообменной хроматографии на DEAE-Toyopearl 650M. Были получены две фосфорсодержащие фракции.

ТК из фракции I (элюирована при 0,17 М NaCl) и фракции II (элюирована при 0,22 М NaCl) соответствовали таковым из клеточных стенок N. alba, что было подтверждено химическими и ЯМР-спектроскопическими методами исследования (рис. 6 ж, з). ТК1 представляла собой незамещенный 3,5-поли(рибитфосфат), но с бóльшей молекулярной массой − 9,4 кДа, что соответствует 41 рибитфосфатной единице. ТК2 являлась 1,3-поли(глицерофосфатом), на 10% замещенным α-N-ацетилглюкозамином и на 5%  О-ацетильными остатками, последнее, также как и несколько мéньшая молекулярная масса (6,0 кДа, что соответствовало 33 глицерофосфатным единицам), отличало эту ТК от ТК2 из N. alba (Тульская и др., 2000).

N. composta ВКМ Ас-2520 и N. composta ВКМ Ас-2521^T. Продукты кислотного и щелочного гидролизов клеточных стенок этих организмов, также как и препаратов ТК из них свидетельствовали о глицерофосфатной природе ТК (табл. 1), замещенной глюкозамином. Образовавшиеся при HF-гидролизе гликозид, идентифицированный как GlcpNAc-(1→2)-snGro, а при щелочном гидролизе фосфодиэфир глицерина с N-ацетилглюкозамином, указывали, что данные ТК являются 1,3-поли(глицерофосфатами), замещёнными глюкозамином, что было подтверждено ЯМР-спектроскопическими методами. По интегральной интенсивности сигналов концевых и срединных остатков длина 1,3-поли(глицерофосфатной) цепи была оценена в 10 единиц.

Итак, клеточные стенки N. compostа ВКМ Ас-2520 и N. compostа ВКМ Ас-2521^T содержали единственную ТК – 1,3-поли(глицерофосфат), на 10% замещённый -N-ацетилглюкозамином (Tul’skaya et al., 2007).

N. metallica ВКМ Ас-2522^T. В кислотных гидролизатах клеточных стенок и препарата ТК найдены фосфорные эфиры рибита, пировиноградная кислота, а также в небольшом количестве фосфорные эфиры глицерина. Это указывало на возможное присутствие нескольких ТК, что подтверждали данные электрофоретического исследования: обнаружены две фосфорсодержащие зоны с подвижностью I m_GroP 0,93 и II m_GroP 1,27. Препарат из клеточной стенки был подвергнут ЯМР-спектроскопическим исследованиям.

Основные сигналы спектра ЯМР ¹³С препарата были идентифицированы как принадлежащие 1,5-поли(рибитфосфату) с 2,4-пируват-кетальными заместителями. Минорные сигналы в спектре принадлежали полимеру с 1,3-поли(глицерофосфатными) цепями, где часть (30%) глицериновых остатков замещена по гидроксилу у С-2 остатками -GlcpNAc. Мольное соотношение основного и минорного полимеров оценено как 7,5 : 1.

Итак, клеточная стенка N. metallica ВКМ Ас-2522^T содержала две ТК. Основная – 1,5-поли(рибитфосфат), каждая рибитфосфатная единица которого несёт 2,4-кетально связанную пировиноградную кислоту и минорная – 1,3-поли(глицерофосфат) на 30% замещённый -N-ацетилглюкозамином, рис. 6 з, и (Tul’skaya et al., 2007).

N. trehalosi ВКМ Ас-942. В продуктах кислотного гидролиза клеточной стенки и ТК из нее кроме фосфорных эфиров глицерина была обнаружена глюкоза. Полимер частично гидролизовался щелочью с образованием небольшого количества моно- и бисфосфатов глицерина. Молекулярная масса полимера составила около 8,0 кДа, что соответствует приблизительно 40 глицерофосфатным звеньям.

В ¹³С ЯМР-спектрах ТК идентифицированы все сигналы, характерные для 1,3-поли(глицерофосфата) на 60% замещенного β-глюкозильными остатками, рис. 6 д, (Стрешинская и др., 1998).


5.2. Структуры тейхоевых кислот клеточных стенок видов рода Glycomyces

В настоящем разделе приведены структуры ТК клеточных стенок 4-х штаммов, принадлежащих двум валидно описанным видам (Labeda et al., 1985) рода Glycomyces, установленные нами.

G. rutgersensis ВКМ Ас-1248. Профиль кислотного гидролиза клеточной стенки и ТК (табл. 1) соответствовал наличию поли(глицерофосфата), а обнаружение в гидролизатах глюкозы предполагало замещение остатков глицерина этим сахаром. ТК была полностью устойчива к щелочному гидролизу, что указывало на полное замещение полимера глюкозой. В продуктах HF-гидролиза идентифицирован гликозид Г1, определенный как α-глюкозилглицерин, с гликозидной связью по гидроксилу при С2 глицерина и С1 глюкозы. Молекулярная масса ТК составила около 6,0 кДа, что, учитывая структуру полимера, составляет 19-20 повторяющихся звеньев. Таким образом, предположительно ТК была 1,3-поли(глицерофосфатом) полностью замещенным α-глюкозой (такая конфигурация гликозидного центра глюкозы найдена впервые у актиномицетов) по гидроксилу при С2 глицерина, что было подтверждено методами ЯМР-спектроскопии (Тульская и др., 1993).

G. harbinensis ВКМ Ас-1247^Т, G. harbinensis NRRL 16897 и G. harbinensis IFO 14487^T. Качественный состав компонентов клеточных стенок всех трех штаммов был одинаков. В кислотных гидролизатах клеточных стенок и выделенных из них ТК были обнаружены фосфорные эфиры глицерина и глюкоза. В продуктах HF-гидролизе ТК всех трех штаммов обнаружено по два гликозида: Г1 – α-глюкопиранозил-(1→2)-глицерин и Г2 – α-глюкопиранозил-(1→1)-глицерин. Обнаружение двух гликозидов свидетельствовало о присутствии в клеточных стенках двух ТК (ТК1 и ТК2), имеющих одинаковый поли(глицерофосфатный) кор и одинаковые заместители – α-глюкопиранозу, которая присоединена к глицериновым остаткам по-разному. Фосфодиэфирную связь в полимерах локализовали с помощью ЯМР-спектроскопии. Таким образом, в трех штаммах G. harbinensis обнаружено по две ТК: ТК1 – 1,3-поли(глицерофосфат), полностью замещенный по гидроксилу при С2 глицерина остатками α-глюкозы; а также ТК2 – 2,3-поли(глицерофосфат) с остатками α-глюкозы по гидроксилу при С1 глицерина (Тульская и др., 1993; Потехина и др., 1998).


5.3. Структуры тейхоевых кислот клеточных стенок видов рода Nocardioides

В этом разделе представлены сведения о структурах ТК, обнаруженных нами у изученных представителей рода Nocardioides (Prauser, 1976).

N. albus ВКМ Ас-805^Т. Продукты кислотного гидролиза клеточных стенок и препарата ТК из них свидетельствовали о наличии ТК глицерофосфатной природы (табл. 1), имеющей заместители (обнаружены галактоза, глюкоза и пировиноградная кислота). Отсутствие среди них дифосфата глицерина и обнаружение в щелочных гидролизатах лишь монофосфорного эфира глицерина (Э1) указывало на поли(гликозилглицерофосфатную) природу ТК (табл.1). Эфир Э1 состоял из монофосфата глицерина, галактозы, глюкозы и пировиноградной кислоты в эквимолярном количестве. Вероятно, Э1 являлся основным повторяющимся звеном ТК. Полная структура полимера была установлена ЯМР-спектроскопическими методами. Сигналы при 70,6-72,2 и 67,85 м.д. были типичными для резонанса С1 и С3 глицериновых остатков в спектре поли(гликозилглицерофосфатной) цепи с гликозильными заместителями при С1 глицерина (Naumova et al., 1990). Сигналы при 25,9 (СН₃-С), 101,9 (О-С-О) и 174,7 м.д. (С=О) были идентифицированы как принадлежащие остатку пировиноградной кислоты, локализованному в положениях 4,6 пиранозы (Шашков и др., 1992). Сигналы при 22,0 и 176,7 м.д. принадлежали О-ацетильным группам. Сигнал малой интенсивности при 109,1 м.д. обнаруживал присутствие -галактозы в фуранозной конфигурации (Bock and Pedersen, 1983). Спектры выявили присутствие -галакто- и -глюкопираноз как главных углеводных компонентов полимера. Было определено также, что -галактофураноза является минорным сахарным компонентом полимера, соотношение -Galp и -Galf составляет 7:1 (рассчитано по интенсивности сигналов при 104,2 + 102,5 м.д. и 109,1 м.д.). Таким образом, основная повторяющаяся единица полимера имеет следующую структуру:

OAc_(0,5)



2

-3)--D-Galp-(11)-snGro-(3-P-

4



-D-Glcp(4,6Pyr)-1

-галактопиранозильные остатки О-ацетилированы по гидроксилу при С2 примерно на 50%. Остаток -галактофуранозы, вероятно, является терминальным на растущем конце цепи полимера и служит сигналом для прекращения его роста. Возможность существования галактофуранозного -1,6-связанного олигомера на конце цепи подтверждается анализом ТК из клеточной стенки N. luteus  другого вида этого рода. ТК указанной структуры обнаружена впервые (Шашков и др., 1999; Tul’skaya et al., 2003).

N. luteus ВКМ Ас-1246^Т и 12 других штаммов с идентичной ТК. Профиль продуктов кислотного гидролиза клеточной стенки и ТК из неё указывал на наличие ТК поли(рибитфосфатной) природы с галактозой и пировиноградной кислотой в качестве заместителей (табл. 1). Среди продуктов HF-гидролиза ТК был выявлен гликозид Г1 и идентифицирован как галактозилглицерин. При щелочном гидролизе, кроме фосфорных эфиров рибита (табл.1), найдены эфиры Э1 (основной) и Э2 (минорный, подробно не изучен), имеющие одинаковый качественный состав. Э1 был монофосфатом галактозилрибита с пировиноградной кислотой. Локализация фосфодиэфирных связей и пировиноградной кислоты, наличие О-ацетильных групп (≈20%) при гидроксилах по С3 рибита, конфигурация гликозидной связи и ее положение установлены с помощью ЯМР-спектроскопии, кроме того, было показано наличие -1,6-связанного олигомера, состоящего ≈ из 6 остатков галактофуранозы (соотношение Galp:Galf составляло 3(5) : 1). Молекулярная масса ТК составила 8,6-8,9 кДа, что соответствовало 18-ти повторяющимся звеньям.

-1-Rbo-5-P-

4



-D-Galp(4,6 Pyr)-1

ТК данной структуры обнаружена впервые (Шашков и др., 2000 ; Tul’skaya et al., 2003):

«N. albus». ВКМ Ас-806. В клеточных стенках этого штамма с использованием химических и ЯМР-спектроскопических методов были обнаружены как минимум две ТК. ТК1 – такая же по структуре как и в N. luteus, однако соотношение Galp:Galf составляло 1 : 1, и ТК2 – полимер поли(рибитфосфатной) природы с рамнозой в качестве заместителя (Tul’skaya et al., 2003).


5.4. Структуры анионных полимеров клеточных стенок некоторых видов рода Streptomyces

К началу наших исследований наибольшее количество ТК было изучено именно у представителей рода Streptomyces (Наумова, Шашков, 1997), относящихся к различным филогенетическим и фенотипическим группам. В настоящей работе были исследованы представители близких видов этого рода.

S. castelarensis ВКМ Ас-832^Т (ранее S. rutgersensis ssp. сastelarensis). В кислотных гидролизатах клеточной стенки и препарата анионных полимеров из нее обнаружен глицерин и его фосфорные эфиры, глюкозамин, лизин, галактоза. Разделение в электрическом поле препарата полимеров, выделенном из клеточной стенки, выявило две фосфорсодержащие зоны, что свидетельствовало о наличии как минимум двух ТК поли(глицерофосфатной) природы. Было предпринято дробное выделение полимеров из целого обезжиренного мицелия с последующим дробным осаждением 96%-ным этанолом и очисткой методом переосаждения в ледяной воде. Это позволило получить препараты, преимущественно содержащие ту или другую ТК. Дополнительную очистку ТК осуществляли методом ионообменной хроматографии на DEAE-Toyopearl 650M в линейном градиенте NaCl.

Препарат 1, имеющий электрофоретическую подвижность m_GroP 1,2-1,3, при кислотном и щелочном гидролизах дал продукты, характерные для незамещенной глицеринтейхоевой кислоты 1,3-типа (табл. 1). Мольное соотношение фосфор – глицерин было 1 : 1. Следовало иметь ввиду присутствие в этом препарате незамещенного 2,3-поли(глицерофосфата), так как последний дает аналогичные результаты при его химических исследованиях, за исключением диглицеринтрифосфата при щелочном гидролизе. Вопрос был решен ЯМР-спектроскопическими методами.

Препарат 2, с электрофоретической подвижностью m_GroP 0,9, в составе кислотных гидролизатов имел глицерин и его фосфорные эфиры, глюкозамин и лизин. HF-гидролиз препарата 2 привел к образованию двух гликозидов: Г1 – GlcpNAc-(1→2)-snGro и Г2 – GlcpNН-(1→2)-snGro и фрагмента цепи ТК – Lys-(1→2)-Gro. Эти данные в совокупности с результатами изучения продуктов щелочного гидролиза препарата 2, среди которых были найдены два фосфодиэфира глицерина с глюкозамином, причем лишь один из фосфодиэфиров был нингидрин положительным, привели к предположению, что ТК из этого препарата является 1,3-поли(глицерофосфатом) частично замещенным глюкозамином, только часть остатков которого ацетилирована. Молекулярная масса этой ТК составила 6,0 кДа, что соответствует ~25 глицерофосфатным единицам.

Независимо оба препарата были исследованы методом ЯМР-спектроскопии. В результате химическими и ЯМР-спектроскопическими исследованиями удалось установить, что клеточная стенка S. castelarensis ВКМ Ас-832^Т содержит набор различных ТК. Минорные – незамещенные 1,3- и 2,3-поли(глицерофосфаты), основная – 1,3-поли(глицерофосфат), треть мономеров имеет по гидроксилам при С2 глицерина глюкозаминильные остатки, только часть которых N-ацетилирована. ТК такой структуры найдена впервые (Tul’skaya et al., 1991).

S. melanosporofaciens ВКМ Ас-1864^Т, S. hygroscopicus ВКМ Ас-831^Т, S. violaceusniger ВКМ Ас-583^Т, S. endus ВКМ Ас-1331^Т, S. endus ВКМ Ас-129. Продукты кислотного и щелочного гидролизов клеточных стенок и суммарных препаратов из них свидетельствовали (табл. 1) о присутствии 1,3-поли(глицерофосфата), а обнаруженные галактоза и глюкозамин – что ТК, замещена сахарными остатками. Электрофорез выявил три фракции, которые были накоплены методом препаративного электрофореза, элюированы, лиофилизованы и исследованы отдельно.

Фракция 1 (m_GroP 1,3-1,4) представляла собой, скорее всего, смесь свободных 1,3- и 2,3-поли(глицерофосфатных) цепей (Тульская и др., 1997), о чем свидетельствовали продукты ее кислотного и щелочного гидролизов (табл. 1). Фракция 2 (основная ТК, m_GroP 0,82-0,9) – идентифицированы 1,3-поли(глицерофосфатные) цепи, частично замещенные α-глюкозамином, причем часть глюкозаминильных остатков N-ацетилирована в той или иной степени (кроме штамма Ас-1864^Т, в ТК которого все глюкозаминильные остатки N-ацетилированы). В продуктах деградации основной ТК из S. hygroscopicus, S. endus Ас-1331^Т и Ас-129, S. violaceusniger с помощью гидроксамовой реакции были обнаружены О-ацетильные остатки. Фракция 3 имела электрофоретическую подвижность m_GroP 0,3 и окрашивалась реактивом Ишервуда в серый цвет. При кислотном гидролизе обнаружена галактоза, а также в следовом количестве продукты деградации ТК из фракции 2 – это свидетельствовало о том, что последняя не была основным компонентом этой фракции.

Суммарные препараты клеточных стенок каждого исследуемого стрептомицета были изучены методами ЯМР-спектроскопии. Эти исследования подтвердили предварительные предположения, основанные на химических методах. Таким образом, клеточные стенки исследуемых стрептомицетов содержали одновременно четыре анионных углеводсодержащих полимера. Три ТК: незамещенные 1,3- и 2,3-поли(глицерофосфаты) и 1,3-поли(глицерофосфат) с большей или меньшей степенью замещения остатками α-глюкозамина, часть которых N-ацетилирована (табл. 6). Четвертый – обнаруженный впервые в природе полимер Kdn, замещенный β-Galp, состоящий ~ из 20 мономерных звеньев (Тульская и др.. 2007а).

Итак, ТК данной группы стрептомицетов были аналогичны таковым у S. castelarensis ВКМ Ас-832^Т, а в клеточных стенках последнего была также найдена галактоза, поэтому было предпринято повторное исследование препаратов полимеров этого штамма на предмет обнаружения полимера Kdn. В результате методами ЯМР-спектроскопии в препаратах из клеточной стенки S. castelarensis также был идентифицирован полимер Kdn той же структуры, что и у вышеупомянутых штаммов (Тульская и др.. 2007а).

S. sparsogenes ВКМ Ас-1744^Т. Профили кислотного и щелочного гидролизов клеточной стенки и препарата ТК свидетельствовали (табл. 1) о присутствии полностью замещенной гликозильными заместителями поли(глицерофосфатной) цепи 1,3-типа. В качестве гликозильных заместителей были выявлены глюкозамин, галактозамин и глюкоза. Дополнительная информация была получена при изучении продуктов гидролиза ТК 47%-ной HF. Идентифицировано два соединения. Соединение 1 было идентично GlcpNAc-(1→2)-snGro, полученному нами ранее из ТК2 S. castelarensis. Соединение 2 содержало галактозамин и глюкозу. ЯМР-спектроскопические исследования препарата из клеточной стенки и соединения 2 позволили установить повторяющуюся единицу основной ТК:


β-D-Glcp-(1→3)-α-D-GalpNAc-(1→3)-β-D-GalpNAc-(1→6)-α-D-GlcpNAc-1

↓

2

-1)-sn-Gro-(3-P-

ТК такой структуры обнаружена впервые (Шашков и др., 1998). Электрофорез выявил присутствие минимум двух ТК в клеточной стенке стрептомицета: кроме основной ТК обнаружено минорное количество незамещенного 1,3-поли(глицерофосфата), что было подтверждено ЯМР-спектроскопическим исследованием. Молекулярная масса основной ТК составила 9,8 кДа, что соответствует приблизительно 11 повторяющимся звеньям.

Streptomyces sp. ВКМ Ас-2274 (=МБ-8). Продукты кислотного и щелочного гидролизов клеточной стенки и ТХУ-препарата указывали на присутствие 1,3-поли(глицерофосфатных цепей), табл. 1, а обнаружение галактозы, 3-О-метилгалактозы (мадурозы), глюкозамина предполагало, что либо эти сахариды являются заместителями в молекуле ТК, либо они образуют некий гликополимер. ТХУ-препарат в электрическом поле разделился на три фракции, которые были накоплены и исследованы отдельно.

Фракция 1 (минорная, m_GroP 1,3). При кислотном гидролизе идентифицированы моно-, бисфосфаты глицерина и неорганический фосфат. Образование таких же продуктов, а также диглицеринтрифосфата при щелочном гидролизе могло свидетельствовать о том, что фракция 1– незамещенный 1,3-поли(глицерофосфат) (Kelemen and Baddiley, 1961). Фракция 2 (основная, m_GroP 0,82). После кислотного гидролиза обнаруживались глицерин, его моно- и бисфосфаты, неорганический фосфат и глюкозамин. Изучение продуктов HF- (гликозид Г1) и щелочного гидролизов (фосфодиэфир Э1) привело к предположению, что ТК этой фракции – 1,3-поли(глицерофосфат), частично замещенный -N-ацетилглюкозамином. Фракция 3 (m_GroP 0,56). Окрашивалась реактивом Ишервуда в серый цвет. Кислотный гидролиз привел к образованию, галактозы, 3-O-метилгалактозы, а также следовых количеств продуктов деградации ТК из фракции 2. Следовательно, ТК не являлась основным полимером этой фракции.

Суммарный препарат полимеров, а также фракции 2 и 3 исследовали ЯМР-спектроскопическими методами, кроме того, фракция 3 была подвергнута MALDI TOF масс-спектроскопическому анализу. В результате проведенных исследований оказалось, что клеточная стенка исследуемого стрептомицета содержит в своем составе две ТК. Основная – 1,3-поли(глицерофосфат), на 60% замещенный -D-N-ацетилглюкозамином; минорная – незамещенный 1,3-поли(глицерофосфат). Кроме того – олигомер 3-дезокси-D-глицеро-D-галакто-нон-2-улопиранозоновой кислоты (Kdn), имеющий следующую структуру:

(-D-Galp3OMe) -D-Galp-1 1--D-Galp3OMe (-D-Galp)

 

9 9

-Kdn-(24)--Kdn

Кислый олигосахарид такой структуры обнаружен впервые (Shashkov et al., 2002).

Streptomyces sp. МБ-2, МБ-5, МБ-6, МБ-7, МБ-10. В кислотных гидролизатах клеточных стенок были идентифицированы рибит, его моно- и бисфосфаты, ангидрорибитфосфат, неорганический фосфат, ангидрорибит, глюкоза, галактозамин, пировиноградная кислота (для трех штаммов: МБ-2, МБ-5, МБ-6), а также неидентифицированное нингидрин-положительное соединение. Кислотный гидролизат суммарных препаратов из клеточных стенок этих стрептомицетов содержал тот же набор продуктов. Однако количество глюкозы было бόльшим, чем количество рибитфосфата во всех случаях, кроме МВ-5. Полученные данные однозначно свидетельствовали о наличии рибиттейхоевой кислоты с глюкозой в составе суммарных препаратов, и не исключали присутствия полимеров иного строения, в структуру которых также входит глюкоза. Таким образом, можно было предположить, что эти организмы содержат в клеточных стенках похожий набор анионных полимеров. Электрофорез суммарных препаратов из каждого организма в отдельности выявил несколько фракций, которые были накоплены методом препаративного электрофореза, элюированы, лиофилизированы и исследованы отдельно.

Фракция 1 (m_GroP 1,3), стрептомицеты MB-2, MB-5, MB-6. Продукты кислотного гидролиза (табл. 1) свидетельствовали о том, что фракция 1, вероятно, является 1,5-поли(рибитфосфатом), несущим остатки пировиноградной кислоты. Предположение было подтверждено данными ЯМР-спектроскопического анализа. Фракция 2, (m_GroP 0,9-1,1), все 5 стрептомицетов. Профили продуктов кислотного и щелочного гидролизов этой фракции указывали на поли(рибитфосфатную) природу ТК из нее. Образование при щелочном гидролизе фосфорного эфира, идентифицированного как глюкозилрибитфосфат, а при HF-гидролизе гликозида, определенного как глюкозилрибит, свидетельствовало о том, что полимером фракции 2, вероятно, являлся 1,5-поли(рибитфосфат), замещенный глюкозой, что было подтверждено ЯМР-спектроскопическими исследованиями. Фракция 3 (m_GroP 0,45-0,52), для 4-х стрептомицетов, кроме МБ-10. Кислотный гидролиз привел к образованию галактозамина, а также неидентифицированного нингидрин положительного соединения, и, кроме того, следовых количеств продуктов деградации ТК из фракции 2. Структура полимера этой фракции была установлена методами ЯМР-спектроскопии для каждого организма. Это была тейхуроновая кислота: →4)-β-D-ManpNAcA-(1→3)-α-D-GalpNAc-(1→, найденная ранее (Шашков и др., 2001) у стрептомицетов. Фракция 4 (m_GroP 0,34), для всех стрептомицетов, за исключением МВ-5. Окрашивалась реактивом Ишервуда в серый цвет, в кислотных гидролизатах этой фракции найдена глюкоза и неидентифицированное соединение, окрашивающееся азотнокислым серебром. Структура полимера этой фракции была расшифрована с помощью ЯМР-спектроскопических исследований. Им оказался полимер 3-дезокси-D-глицеро-D-галакто-нон-2-улопиранозоновой кислоты (Kdn), замещенный -глюкозой (Shashkov et al., 2000).

Итак, клеточные стенки 5-ти стрептомицетов содержали по два-четыре анионных углеводсодержащих полимера. Среди них ТК: 1,5-поли(рибитфосфат), разной степени замещения β-Glcp, встречающийся во всех изученных организмах; а также 1,5-поли(рибитфосфат), несущий кетально связанную по гидроксилам при С2-С4 рибита пировиноградную кислоту, который был обнаружен в клеточных стенках лишь трех (МБ-2, МБ-5, МБ-6) стрептомицетов. Для 4-х изученных организмов характерно наличие в клеточных стенках тейхуроновой кислоты. Клеточные стенки почти всех изученных стрептомицетов (кроме МБ-5) содержат полимер Kdn, замещенный β-Glcp (табл. 9, Тульская и др, 2003).

Streptomyces sp. ВКМ Ас-2534 (=Ив-219). Продукты кислотного гидролиза клеточной стенки и суммарного препарата полимеров указывали на присутствие ТК поли(рибитфосфатной) природы (табл. 1), видимо, с глюкозой и глюкозамином в качестве заместителей, а также неидентифицированного нингидрин положительного соединения. Электрофорез суммарного препарата привел к разделению на две фракции, которые были накоплены электофоретически, элюированы, лиофилизированы и исследованы отдельно.

Фракция 1 (m_GroP 1,10), минорная, содержала ТК рибитфосфатной природы, вероятно, несущей в качестве заместителей глюкозу и глюкозамин, о чем свидетельствовали продукты кислотного гидролиза (табл. 1). При аммонолизе фракции образовались лизин и амид лизина, последний, по-видимому, входил в структуру ТК. Изучение продуктов дефосфорилирования (HF-гидролиз) привело к обнаружению двух гликозидов, идентифицированных как: Г1 – глюкозилрибит; Г2 – N-ацетилглюкозаминилрибит. Можно было предположить, что полимер этой фракции представляет собой 1,5-поли(рибитфосфатную) ТК, отдельные рибитфосфатные остатки которой несут глюкозу, в то время как другие – замещены N-ацетилглюкозамином. Фракция 2 (m_GroP 0,52), преобладающая, была проявлена реактивом Ишервуда в виде белого пятна на фореграмме. Кислотные гидролизаты этой фракции содержали лишь следовые количества продуктов деградации фракции 1, а также неидентифицированное нингидрин положительное соединение. Таким образом, ТК не являлась основным компонентом этой фракции.

Тип фосфодиэфирной связи, положение гликозильных заместителей и их конфигурация в ТК фракции 1, а также структура полимера из фракции 2 были определены с помощью ЯМР-спектроскопии.

Таким образом, было доказано, что клеточная стенка изучаемого фитопатогенного стрептомицета содержит два анионных углеводсодержащих полимера. Минорный полимер – ТК, 1,5-поли(рибитфосфатные) цепи которой несут по гидроксилам при С-2(4) рибита β-глюкопиранозу, однако некоторые рибитфосфатные звенья полимера замещены β-N-ацетилглюкозамином, нарушая тем самым его регулярность. Второй полимер, преобладающий, представлял собой тейхуроновую кислоту, повторяющейся единицей которой является дисахарид:


 4)--D-Manp2,3NAcyA-(13)--D-GalpNAc-(1, где Acy – ацетил или L-Glu


Полимер такой структуры обнаружен впервые у грамположительных бактерий (табл. 9, Тульская и др., 2007б).


5.5. Тейхоевая кислота и полисахарид клеточной стенки Kineosporia aurantiaca ВКМ Ас-702^Т.

К началу наших исследований имелись сведения (Евтушенко и др., 1984) о том, что клеточная стенка Kineosporia aurantiaca ВКМ Ас-702^Т, представителя семейства Kineosporiaceae подпорядка Frankineae, содержит ТК глицерофосфатной природы. Однако структурные исследования последней, а также возможных других гликополимеров, имеющихся в ней, ранее не проводили.

В кислотных гидролизатах клеточной стенки и суммарного препарата из неё обнаружены галактоза и манноза, а также некоторое количество глицерина, его моно- и бисфосфатов, неорганический фосфат и глюкозамин. Электрофорез суммарного препарата обнаружил наличие двух фракций, которые были накоплены методом препаративного электрофореза, элюированы, лиофилизированы и исследованы отдельно.

Фракция 1 (минорная, m_GroP 0,93) при кислотном гидролизе дала продукты, позволяющие предположить наличие глицеринтейхоевой кислоты, замещенной глюкозамином (табл. 1). Ценная информация о структуре ТК была получена при изучении фосфорных эфиров, полученных после щелочного гидролиза фракции 1, а также гликозидов, полученных после ее обработки 47%-ной HF. Полученные продукты гидролизов, изученные по схеме, приведенной для S. сastelarensis, оказались идентичными таковым для названного стрептомицета. Таким образом, следовало думать, что полимер из фракции 1 является 1,3-поли(глицерофосфатом) частично замещенным α-глюкозаминильными остатками, только часть которых N-ацетилирована. Это предположение было подтверждено ЯМР-спектроскопическими исследованиями. Фракция 2 (основная) была электронейтральна и проявлена на фореграмме AgNO₃ в нейтральной области. При кислотном гидролизе найдены галактоза и манноза в соотношении ~ 1 : 2. Абсолютная конфигурация галактозы и маннозы определена методом ГЖХ после их превращения в ацетилированные (S)-октан-2-ил гликозиды сравнением с октан-2-ил D-гликопиранозами (Gerwig et al., 1979). Эти результаты показали, что данная фракция вероятнее всего содержит нейтральный полисахарид. Структура последнего была полностью расшифрована с помощью ЯМР-спектроскопии.

Моносахаридная последовательность в повторяющейся единице полисахарида установлена на основании анализа ¹H, ¹H ROESY и ¹H, ¹³C HMBC спектров:

→3)-β-d-Galp-(1→6)-β-d-Manp-(1→4)-β-d-Manp-(1→3)-β-d-Galp-(1→4)-β-d-Manp-(1→4)-β-d-Manp-(1→.

Одинаковая D-конфигурация каждого из моносахаридных остатков подтверждена при определении гликозилирующих эффектов в ¹³C ЯМР спектрах полисахарида (Lipkind et al., 1988; Shashkov et al., 1988). Структура данного нейтрального полисахарида описана впервые (Tul’skaya et al., 2005).

  

Анализ собственных результатов и литературных данных указывает на широкое распространение тейхоевых кислот в клеточных стенках представителей порядка Actinomycetales: более 80% всех изученных нами к настоящему времени штаммов актиномицетов содержат эти полимеры, причем до 70% всех обнаруженных тейхоевых кислот составляют глицеринтейхоевые кислоты. Рибиттейхоевые кислоты менее распространены в клеточных стенках бактерий. И, наконец, тейхоевые кислоты, содержащие другие полиолы (эритрит, арабит, маннит, 6-О-метил-галактит) в коре полимера, выявлены у актиномицетов в редких случаях, рис. 4.



Рис. 4. Известные в настоящее время полиолы, входящие в состав тейхоевых кислот.


Заметим, что именно для глицеринтейхоевых кислот обнаружено наибольшее разнообразие (рис. 4.) в локализации фосфодиэфирных связей: 1,3- и 2,3-поли(глицеринфосфаты), поли(гликозилглицеринфосфаты), поли(глицеринфосфат-гликозилглицеринфосфаты). Недавно найден новый тип тейхоевых кислот: поли(ацилгликозилглицерофосфат), фосфодиэфирная связь в котором осуществляется по гидроксилу при С2 глицериновой кислоты, ацилирующей хиновозамин в коре полимера, и гидроксилу при С3 остатка глицерина (Козлова и др., неопубликованные данные).

Итак, глицеринтейхоевые кислоты наиболее широко распространены в природе, и среди них выявлено наибольшее разнообразие структур.

Интересные данные были получены в наших совместных работах с сотрудниками группы чл.-корр. РАН И.С.Кулаева (Кулаев и др., 1996; Степная и др., 1997, 2004). Бактерии с глицеринтейхоевой кислотой были практически не подвержены действию комплекса литических ферментов, тогда как наличие рибиттейхоевой и/или тейхуроновой кислот приводило к усиленному лизису микроорганизмов. Возможно, глицеринтейхоевые кислоты защищают микробную клетку от лизиса.

Являются ли глицеринтейхоевые кислоты наиболее значимыми для выживания микроорганизмов в их экологической нише по сравнению с другими тейхоевыми кислотами, в коре которых имеются другие полиолы,  предмет дальнейших исследований.