Іонні механізми потенціалу дії. Методи фіксації
Информация - Биология
Другие материалы по предмету Биология
?іяв, потрібно досить багато часу (до 30 хвилин), що істотно зменшує корисний період експерименту. І, по-третє, антибіотик ушкоджує мембрану також й у місці зєднання з кінчиком піпетки, що приводить до прискореного руйнування гігаомного контакту й додатково зменшує ефективний експериментальний час. Таким чином, даний варіант методу може бути з успіхом використаний тільки в експериментах, які не вимагають тривалого часу для виявлення досліджуваних явищ.
Nucleated patch
Цікавий різновид patch-clamp - nucleated patch. (Фіксація потенціалу із клітинним ядром).
Метод полягає в наступному. Піпетка підводить до клітини, а потім ривком пробиває мембрану. Після цього кінчик піпетки підводить до клітинного ядра, на піпетку подається невеликий негативний тиск. У результаті піпетка присмоктує до ядра. Потім піпетка з ядром на кінці плавно приділяється назад і виймається із клітини. Піпетку необхідно вивести із клітини таким чином, щоб ділянка мембрани в місці виходу "наділася" на ядро, що присмокталося, і відірвалася, обернувшись довкола нього. У результаті виходить специфічний варіант outsіde-out patch, при якому набагато більший, ніж у звичайному варіанті методу, ділянка мембрани приєднана до кінця піпетки, будучи обгорнутою навколо клітинного ядра.
Фіксація потенціалу й фіксація струму
Коли вивчаються зміни провідності однотипних каналів у відповідь на якісь хімічні впливи або залежність їхньої провідності від різниці потенціалів на мембрані, зручно фіксувати потенціал і вимірювати струм каналу - як ми дотепер й описували. Цей, найчастіший варіант patch-clamp, називається voltage clamp (фіксація потенціалу). Однак, іноді дослідника цікавлять процеси трансмембранного переносу іонів, повязані зі зміною мембранного потенціалу - наприклад, проведення нервового імпульсу. У таких випадках можна надійти протилежним образом: зафіксувати на постійному рівні струм, і вивчати зміни різниці потенціалів при цьому. Такий варіант називається current clamp (фіксація струму).
Приклади записів, одержуваних методом patch-clamp
Запис струму одиночного каналу (гліцинового рецептора)
Запис одиночного каналу рецептора гліцину. Чітко видно два стани: закрите (йому відповідає нульовий струм) і відкрите (йому відповідає струм приблизно в 7 пикоампер). Канал час від часу спонтанно переходить із одного стану в інше, проміжних станів немає. Запис дозволяє одержати дві найважливіші характеристики каналу: провідність (виходячи з величин трансмембранного потенціалу й струму) і ймовірність знаходження у відкритому стані (обумовлене як відношення часу, коли канал відкритий до часу, коли він закритий). До слова, найчастіше активність каналу фізіологічно регулюється шляхом зміни цієї ймовірності.
Запис амилорид-чуттєвого струму в головній клітині збірної трубки бруньки в конфігурації whole-cell.
Запис у конфігурації whole-cell. Клітина епітелію збірної трубки. Трансмембранний потенціал -60 мВ. З інтервалами в 1 хвилину на 30 секунд в оточуючий розчин уводиться амилорид - інгібітор епітеліального натрієвого каналу (час введення показаний темними прямокутниками). До речі, чутливість до інгібіторів - це ще одна з найважливіших характеристик каналу. Введення амилорида щораз призводить до падіння струму до нуля, із чого видно, що практично вся провідність при -60 мВ у даній клітині - це провідність епітеліального натрієвого каналу. На противагу попереднього запису, зміни струму виглядають безперервними - це повязане з тим, що одночасно записується багато каналів (близько 2000), відповідно, є приблизно 2000 рівнів струму - від "усі відкриті" до "усі закриті".
Висновки
- Потенціал дії в більшості клітин виникає за рахунок короткочасного зростання натрієвої провідності, що прагне привести мембранний потенціал до рівня натрієвого рівноважного потенціалу й за яким треба збільшення калієвої провідності, що повертає мембрану в стан спокою.
- Зростання провідностей виникає завдяки потенціалзалежності натрієвих і калієвих каналів: імовірність їхнього відкриття зростає при деполяризації.
- Експерименти на аксоні кальмара з фіксацією потенціалу надали детальну інформацію про потенціалзалежності й тимчасовий хід змін провідностей. При деполяризації мембрани натрієва провідність спочатку швидко активується, а потім інактивується. Калієва провідність активується із затримкою й залишається на високому рівні доти, поки не скінчиться деполяризація.
- Часовий хід і потенціалзалежність змін натрієвих і калієвих провідностей у точності визначають амплітуду й часовий хід потенціалу дії, а також такі характеристики мембрани, як поріг активації й рефрактерний період.
- Теоретично активація натрієвої й калієвої провідностей при деполяризації повинна бути звязана зі зсувом заряду усередині клітини. Ці зсуви, названі воротними струмами, удалося виміряти експериментально.
- Експерименти з використанням методу пэтч-кламп доповнили відомості, отримані в більше ранніх досвідах з фіксацією потенціалу, новими деталями про процес збудження. Так, наприклад, натрієві канали відкриваються на досить короткий час, і ймовірність їхнього відкриття в ході деполяризації спочатку зростає, а потім знижується, відповідно до активації й інактивацією натрієвої провідності в цілій клітині. Різні кінетичні моделі були запропоновані з метою опису процесів активації й інактивації каналів.
- Кал?/p>