Іонні механізми потенціалу дії. Методи фіксації
Информация - Биология
Другие материалы по предмету Биология
мембрани площею приблизно 7 мкм2, струм від іонних каналів у цьому фрагменті можна буде записувати.
Конфігурація "Cell-attached"
Тільки що описана конфігурація називається cell-attached patch-clamp (patch-clamp "із прикріпленою кліткою"). Вона ілюструється схемою 1.
Схема 1. Принципова схема patch-clamp у конфігурації Cell-attached.
Ця конфігурація, однак, має дві незручності. По-перше, вона не дозволяє з достатньою надійністю вимірювати, а, отже, і задавати трансмембранну різницю потенціалів - оскільки обидва електроди - як піпетковий, так і зовнішній, перебувають по одну сторону мембрани. Загалом кажучи, можна, використовуючи оточуючий розчин з іонною композицією, що повторює склад цитоплазми, деполяризувати мембрану поза піпеткою, так що різниця потенціалів між зовнішнім електродом і цитоплазмою зникне, а тоді різниця потенціалів між електродами буде дорівнювати трансмембранному потенціалу - але все це досить приблизно, тому що точний склад цитоплазми нам невідомий.
По-друге, ця конфігурація не дозволяє контролювати склад середовища поза піпеткою - там залишається цитоплазма, склад якої не цілком визначений. У силу цих причин cell-attached mode застосовується досить обмежено.
Конфігурація Іnsіde-out
Однак, якщо піпетку швидким рухом відвести від клітини, то "внутрішній" шматочок мембрани відірветься від клітини й вийде конфігурація іnsіde-out (зовнішня сторона усередині), названа так тому, що внутрішня, звичайно звернена до цитоплазми, сторона мембрани виявиться зовні - в оточуючому розчині, а зовнішня - усередині піпетки. (Схема 2) Альтернативний метод переходу в конфігурацію іnsіde-out полягає в наступному: з конфігурації cell-attached піпетку відводять плавно, формуючи із двох сторін закриту везикулу; потім піднімають піпетку в повітря й опускають у другу ванночку, із внутрішньоклітинним розчином. При переносі зовнішня мембрана везикули руйнується, у результаті формується конфігурація іnsіde-out.
Схема 2. Принципова схема patch-clamp у конфігурації іnsіde-out.
Тепер різниця потенціалів на фрагменті мембрани строго дорівнює різниці потенціалів між електродами. Очевидно, що при використанні такої модифікації піпетку заповнюють розчином, що імітує позаклітинне середовище, тоді як оточуючий розчин роблять близьким по складу до цитоплазми. При цьому, міняючи склад оточуючого розчину, можна вивчати, як такі зміни в цитоплазмі впливають на струм каналів, що цікавлять нас, - адже оточуючий розчин контактує із цитоплазматичною стороною мембрани.
Конфігурація Whole-cell
Якщо за умовами експерименту необхідно міняти склад позаклітинного середовища, можна використати конфігурацію whole cell ("англ. ціла клітина"). У цьому випадку піпетку не відводять від клітини, а подають у неї негативний тиск й у такий спосіб руйнують ізольований фрагмент мембрани.
Схема 3. Принципова схема patch-clamp у конфігурації whole-cell.
Після цього піпетка зєднана із внутрішньоклітинним середовищем; оскільки клітина звичайно маленька, то, завдяки дифузії, склад цитоплазми незабаром виявляється ідентичним складу піпеткового розчину, тому ми, як й у попередньому випадку, знаємо як склад рідин, так і різницю потенціалів. Відзначимо, що якщо в конфігурації іnsіde-out піпетковий електрод був "позаклітинним", а внутрішній - "внутрішньоклітинним", те тепер вони помінялися ролями. З погляду вивчення струму через канали, перевага цього методу полягає в тому, що тут залишаються цілими клітинні структури й регуляторні механізми. Але є й недолік - ми вимірюємо сумарний струм всіх каналів у клітині, а не струми через одиночні канали.
Конфігурація Outsіde-out
Вирішити цю проблему дозволяє конфігурація outsіde-out (зовнішня сторона зовні). Якщо після переходу в whole-cell mode повільно відводити піпетку від клітини, мембрана не відривається відразу, а починає витягуватися в трубку (це видно на фото).
Початкова фаза переходу з Whole-cell в Outsіde-out. Перехід в outsіde-out. Заключна фаза.
Мембранна трубка стала зовсім тонкою й майже невидимою ("протуберанець" у поверхні клітини - це невелика частина цитоплазми, що залишилася в мембранній трубці). У наступну мить трубка порветься, а мембрана зімкнеться на піпетці в "вивернутому" виді - ми опинемось в конфігурації "outsіde-out"
Perforated patch
Perforated patch ("перфорований patch") - це специфічний варіант patch-clamp в whole-cell mode. У цьому випадку, у піпетковому розчині утримується невелика кількість спеціального антибіотика. наприклад, граміцидина. Антибіотики цього класу формують іонні канали в клітинній мембрані на ділянці, приєднаній до мікропіпетки.
Такий підхід дозволяє уникнути заміщення внутрішнього середовища клітини розчином з піпетки-електрода, тобто клітина залишається живою з мінімальними, наскільки це можливо, ушкодженнями. Таким чином, відповіді клітки на подразники є максимально наближеними до природного. У той же час, даному методу властиве ряд недоліків. По-перше, у порівнянні із класичним whole-cell mode, електричний опір доступу (яке складається з опору піпетки й опору в місці зєднання піпетки з мембраною) є значно більш високим. Це знижує якість фіксації потенціалу, підвищує рівень шуму при записі, і збільшує значення всіх помилок, повязаних зі змінами опору повного ланцюга (від електрода в зовнішньому розчині до електрода в піпетці). По-друге, для того, щоб антибіотик по?/p>