Іонні механізми потенціалу дії. Методи фіксації
Информация - Биология
Другие материалы по предмету Биология
?ровідність.
Винахід методу фіксації потенціалу
Той факт, що фіксація трансмембранного потенціалу дозволить вимірювати мембранну провідність по змінах струму при постійній напрузі, був уперше усвідомлений ще в 30-х рр. XX століття, і тоді ж англійські дослідники Алан Ходжкін й Ендрю Хакслі (Alan Hodgkіn and Andrew Huxley) почали експерименти із двухелектродною фіксацією потенціалу (2-electrode voltage clamp).
Суть методу полягає в наступному. У клітину вводяться два електроди, ще один - електрод порівняння - залишається поза клітиною. Перший внутрішньоклітинний електрод служить для виміру трансмембранної різниці потенціалів (тобто різниці потенціалів між ним й електродом порівняння), другий може подавати струм. Спеціальний пристрій - генератор сигналу - задає командний потенціал, якому повинен бути рівен трансмембранний потенціал. Обмірюваний трансмембранний потенціал подається на вхід пристрою порівняння, що віднімає обмірюваний потенціал з командного й, залежно від величини різниці, подає струм на струмовий електрод так, щоб компенсувати цю різницю. Монітор струму, у свою чергу, постійно вимірює величину струму, що для цього необхідна. В 1930-х й 40-х роках, коли працювали Ходжкін і Хакслі, не існувало мікроелектродів, тому як внутрішньоклітинні електроди використалися тонкі дроти. Це визначило вибір обєкта - гігантський аксон кальмара діаметром 1 мм, усередину якого й вводилися ці дроти. На цьому обєкті методом двохелектродної фіксації потенціалу дослідники виконали експерименти, у яких була встановлена іонна природа потенціалу дії й уперше постульоване існування іонних каналів (Нобелівська премія 1963 р., поділена із Дж. Екклзом, що получили її за дослідження в області синапатичної передачі). Двохелектродна фіксація потенціалу застосовується й у цей час, з використанням гострих скляних мікроелектродів, однак навіть із ними ця методика має істотні обмеження: по-перше, два електроди можуть бути уведені тільки в досить велику клітину (наприклад, овоцит жаби).
Дослідження провідності одиночних калієвих і натрієвих каналів під час потенціалу дії проводилися в умовах фіксації потенціалу ділянки мембрани. Спостережувані при цьому принципи роботи окремих каналів відповідають результатам, отриманим раніше в експериментах з фіксацією потенціалу цілої клітки: при деполяризації ймовірність відкриття натрієвих і калієвих каналів зростає. Зростання ймовірності відбувається з тим же тимчасовим ходом, що й відповідні струми в умовах фіксації потенціалу. Так, натрієві канали найбільше часто відкриваються на початку деполяризуючого імпульсу й імовірність таких відкриттів падає в міру розвитку натрієвої інактивації.
Первісний короткочасний викид струму являє собою ємнісний струм, обумовлений зміною заряду на мембрані в результаті зміни мембранного потенціалу. Якщо підсилювач зворотного звязку здатний проводити більші струми, то ємнісний струм триває дуже недовго. На практиці викид ємнісного струму триває близько 20 мс, і за ним треба невеликий, але стійкий вихідний струм.
Цей вихідний струм, що протікає через провідності, активні при потенціалі спокою, називається струмом витоку. Здебільшого це струм іонів калію й натрію, що має лінійну залежність від величини зсуву потенціалу фіксації від потенціалу спокою й з на всьому протязі стрибка потенціалу. Більшу частину часу, однак, цей струм замаскований іншими, набагато більшими по величині іонними струмами.
Ходжкін і Хакслі показали, що друга й третя стадії струму обумовлені спочатку входом іонів натрію, а потім виходом іонів із клітини. Їм також удалося виділити індивідуальні компоненти струму й розрахувати їхню величину й часовий хід. Одним із зручних способів домогтися цього послужило видалення з розчину більшої частини іонів натрію й заміна їх на іони холіну (які не проходять через мембрану). Знизивши зміст позаклітинного натрію, удалося домогтися того, що натрієвий рівноважний потенціал зрівнявся з деполяризованим мембранним потенціалом. Таким чином, сумарний струм зрівнявся нулю.
Метод петч-кламп (patch - clamp)
Наприкінці сімдесятих років XX в. Эрвін Неєр (E.Neher) і Берт Сакман (B.Sakmann) виявили, що конусоподібні скляні піпетки з діаметром кінчика 1-2 мікрона можуть утворювати контакти із клітинною мембраною (границі "мембрана - скло") з опором у декілька гігаом - це так званий гігаомний контакт. Він дозволяє ізолювати від зовнішнього середовища й від іншої частини мембрани той її фрагмент, що перебуває усередині піпетки. Відмежований піпеткою фрагмент мембрани й називається patch - "фрагмент", слово clamp (фіксація) у назві методу можна інтерпретувати і як захоплення й ізоляцію цього фрагмента, так й як фіксацію трансмембранного потенціалу в ізольованому фрагменті, або, як буде описано пізніше, потенціалу або струму на цілій клітині. У піпетку, заповнену розчином електроліту, міститься хлор-срібний електрод, другий електрод розміщується позаклітинно, в оточуючій рідини. Відмінність електричної схеми від раніше описаної для двохелектродної фіксації полягає в тім що той самий електрод використовується як для виміру різниці потенціалів, так і для подачі струму.
Величезна сфера, частина якої видна на моніторі в центрі фотографії - це клітина (овцит жаби Xenopus laevіs), що перебуває в цей момент на предметному столику мікроскопа, до нього підведена patch-піпетка, її діаметр у носика - близько 3 мікронів. Після встановлення гігаомного контакту вона ізолює фрагмент