Диагностика хламидиоза свиней
Дипломная работа - Сельское хозяйство
Другие дипломы по предмету Сельское хозяйство
±оре образцов материала, а также при подготовке проб для исследования необходимо соблюдать меры, предупреждающие обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями по данному вопросу.
Для исследования используют:
паренхиматозные органы павших или вынужденно убитых животных, кусочки плодовых оболочек, паренхиматозные органы и перевязанный с двух сторон сычуг абортированных плодов, сперму замороженную (или пробы эякулята), мочу от производителей, подозрительных по заболеванию, соскобы слизистых оболочек (конъюнктивы, урогенитального тракта).
Жидкости для исследования отбирают в объеме 20 см3, из тканей и органов вырезают кусочки размером 3х3х3 см3 (при невозможности толщина кусочков может быть меньше).
Материалы доставляют в лабораторию в день взятия или на следующий день, сохраняя при 4 С. Допускается хранение материала при минус 20 С в течение 30 дней. Пробы мочи доставляют в тот же день.
Подготовка исследуемого материала
Все манипуляции, связанные с подготовкой проб, проводятся пипе-точными дозаторами переменых объёмов (типа "Ленпипет") с использованием одноразовых полипропиленовых пробирок на 1,5 см3 и 10,0 см3 (ПО "Ленполимер") и наконечников с аэрозольным барьером. Одноразовая пластиковая посуда (пробирки, наконечники) должна сбрасываться в специальный контейнер, содержащий дезинфицирующий 10%-ный раствор хлорной извести или 5%-ный раствор хлорамина Б.
Пробы исследуемых жидкостей, в объеме 10 см3 центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10-15 мин. При необходимости объем проб доводят до требуемого путем добавления физиологического раствора. Супернатант осторожно сливают, оставив над осадком примерно 0,2 см3 жидкости. Если осадок практически не виден, то в эту же пробирку вносят еще 10 см3 материала и повторяют центрифугирование. Осадок суспендируют в оставшейся надосадочной жидкости (или физиологическом растворе) и 100 мкл его используют для выделения ДНК.
Пробы паренхиматозных органов, плодовых оболочек, размером 3х3х3 мм3 помещают в пробирки типа "эппендорф", тщательно растирают отдельными стеклянными палочками, добавляют по 1 см3 физиологического -раствора и тщательно перемешивают. Смесь отстаивают при температуре 20-25С в течение 20 мин, после чего 100 мкл верхней фазы используют для выделения ДНК.
Сперму в объеме 0,5 см3 разводят равным объемом физиологического раствора, осаждают на микроцентрифуге при 10000-12000 об/мин в течение 8-10 мин, осадок ресуспендированный в 100 мкл физиологического раствора используют для выделения ДНК.
Соскоб слизистых оболочек разводят в 0,5-1,0 см3 физиологического раствора, осаждают на микроцентрифуге при 11000-12000 об/мин в течение 8-10 мин. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок ресуспендируют в 100 мкл физиологического раствора и используют для выделения ДНК. Если слизь очень густая (не всасывается в отверстие наконечника пипетки), то пробу обрабатывают 1-2 см3 раствора 0,1М меркаптоэтанола, добавив его в "эппендорф". Размешивают на вортексе, выдерживают при комнатной температуре 3-5 мин и центрифугируют в вышеуказанном режиме. Осадок в 100 мкл физиологического раствора используют для выделения.
Проведение ПЦР-анализа. ПЦР-анализ проводят в три этапа в трех отдельных помещениях (зонах), для работы, в которых дополнительно требуются следующие материалы и оборудование:
Для выделения ДНК из испытуемого материала - ЗОНА 1:
настольный бокс с бактерицидной лампой;
термостат для, пробирок типа "эппендорф" на 25-100 С;
микроцентрифуга до 12000-16000 об/мин;
центрифуга/вортекс "Микроспин";
отдельный набор автоматических пипеток переменого объема от 0,001 см3 до 1 см3;
одноразовые наконечники с аэрозольным барьером;
одноразовые полипропиленовые пробирки на 1,5 см3 типа "эппендорф";
штативы для пробирок, наконечников;
отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки;
холодильник на 2-8 С с морозильной камерой.
Для проведения амплификации (ПЦР) - ЗОНА 2;
амплификатор;
ПЦР-бокс или отдельный стол с УФ-лампой;
отдельный халат и одноразовые перчатки;
отдельный набор автоматических пипеток переменного объема от 0,001 см3 до 1см3;
одноразовые наконечники в штативах;
одноразовые микропробирки для ПЦР на 0,5 см3;
штативы для микропробирок на 0,5 см3;,
холодильник на 2- 8 С, морозильник на минус 20 С для выделенных ДНК;
термостат для микропробирок с воском на 95 С.
Для электрофоретического анализа продуктов ПЦР - ЗОНА 3:
камера для горизонтального электрофореза;
источник постоянного тока на 150-200 В;
ультрафиолетовый трансиллюминатор для просмотра гелей;
фотоаппарат для фотографирования гелей и, фотопленка;
бачок для проявления пленки, проявитель, фиксаж;
аквадистиллятор;
отдельный халат и одноразовые резиновые перчатки;
отдельная автоматическая пипетка 10-40 мкл и наконечники в штативе;
мерный цилиндр на 1л;
колба коническая из термостойкого стекла для плавления агарозы;
электроплитка или микроволновая печь для плавления агарозы.
Порядок работы.
ЭТАП 1. Выделение ДНК из исследуемого материала.
Выделение ДНК из 100 мкл подготовленного материала проводят с помощью набора №1. Предварительно готовят отмывочный раствор №2, смешав в отдельном флаконе 20 см3 концентрата из набора, 80 см3 дистиллированной воды и 100 см3 96% этилового спирта. Смесь хорошо перемешивают и хранят при температуре 20-22 С под плотна закр?/p>