Диагностика хламидиоза свиней
Дипломная работа - Сельское хозяйство
Другие дипломы по предмету Сельское хозяйство
К заключается в том, что неполные (блокирующие) антитела, содержащиеся в сыворотке крови больных или переболевших животных образуют комплекс антиген-антитело, не связывая комплемент, поэтому они не могут быть обнаружены методом РДСК. Для выявления таких антител в реакцию вводят дополнительный компонент в виде позитивной сыворотки, содержащей полные антитела против возбудителя хламидийной инфекции (условно-индикторная сыворотка). При наличии в испытуемой сыворотке неполных антител их взаимодействие с антигеном происходит без участия комплемента, который оставшись свободным обеспечивает гемолиз эритроцитов в гемолитической системе (реакция положительная). Если испытуемая сыворотка не содержит неполные антитела, то антиген соединяется с антителами введённой позитивной (индикаторной) сыворотки, образуя комплекс антиген-антитело-комплемент, в результате гемолиз эритроцитов не произойдёт (реакция отрицательная).
.В РНСК используют следующие компоненты: комплементсвязывающий группоспецифический хламидийный антиген, контрольный антиген, позитивную (иммунную) сыворотку крови содержащую группоспецифические хламидийные антитела, негативную (отрицательную) сыворотку крови, комплемент (свежая консервированная или лиофильно высушенная сыворотка крови морской свинки), гемолизин, эритроциты барана, испытуемые сыворотки, физиологический раствор. Специфический и контрольный антигены, позитивную и негативную сыворотки изготавливают биофабрики, выпускающие их в специальных наборах. Антиген применяют в РНСК и РДСК в рабочих титрах, указанных на этикетке.
3.Гемолизин в РНСК используют в удвоенном титре.
.Эритроциты барана отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования при 2500-3000 об/мин в течение 10-15 минут до полной прозрачности надосадочной жидкости. Для РНСК применяют 2,5%-ную взвесь эритроцитов из осадка.
5.Приготовление гемолитической системы. Перед работой смешивают одну часть 2,5%-ной взвеси эритроцитов и одну часть гемолитической сыворотки в удвоенном титре. Полученную гемолитическую систему ставят в водяную баню (термостат) при 37С на 30 минут для сенсибилизации. Во время работы гемолитическую систему хранят при комнатной температуре или в холодильнике при 2-4С.
6.Для серологического исследования пригодны свежие испытуемые сыворотки. Допускаются к исследованию и замороженные (однократно). Мутные, проросшие или гемолизированные сыворотки для исследования непригодны.
.Физиологический раствор для разведения компонентов (0,85%-ный раствор химически чистого хлорида натрия в дистиллированной воде, рН 7,2-7,4) готовят и кипятят в течение 5 минут за день или в день постановки реакции.
.Титрование комплемента. Сухой биофабричный комплемент растворяют физиологическим раствором до первоначального объема, указанного на этикетке и готовят основное разведение 1:20. Каждую сыворотку, разведённую 1:5 (1 мл сыворотки + 4 мл физиологического раствора) и инактивированную при 58-60С 30 минут, разливают по 0,2 мл в два ряда пробирок штатива Флоринского.
Титрование комплемента начинают с дозы 0,02 мл до 0,2 мл с интервалом по 0,02 мл. Добавляют в каждую пробирку недостающее до 0,2 мл количество физиологического раствора. В первые ряды пробирок с позитивной, негативной и испытуемыми сыворотками (взятыми из опыта) разливают специфический антиген в рабочем разведении по 0,2 мл и по 0,2 мл физиологического раствора, а во вторые ряды по 0,4 мл физиологического раствора. Пробирки встряхивают и ставят в водяную баню на 60 минут при 37-38С. Затем во все пробирки разливают гемолитическую систему по 0,4 мл, встряхивают и ставят в водяную баню на 30 минут при 37-38С.
Титром (единицей) комплемента считают наименьшую дозу его, которая дает полный гемолиз эритроцитов с негативной и испытуемыми сыворотками в пробирках первого и второго рядов и с позитивной сывороткой - в пробирках второго ряда (без антигена). В примере, приведенном в таблице 2, титр комплемента, разведенного 1:20, равен 0,1 мл, что и будет являться его рабочей дозой.
Примечание: если в первом ряду пробирок с сыворотками из опыта получена ясно выраженная задержка гемолиза эритроцитов более чем на два интервала по сравнению с безантигенным рядом, это значит, что испытуемые сыворотки содержат специфические (к данному антигену) антитела. И в таком случае рабочую дозу комплемента определяют по негативной сыворотке и безантигенным рядам позитивной и испытуемых сывороток.
Расчет количества чистого комплемента, необходимого для постановки главного опыта, делают по формуле:
Х=АхВ/С,
где А - рабочая доза комплемента, В - количество пробирок, занятых в реакции, С - основное разведение комплемента.
Пример: 0,1х100/20=0,5. Количество разведенного комплемента, требуемое для всей реакции (в данном примере 100 пробирок), равно 20 мл (0,2х100), поэтому к 0,5 мл чистого комплемента следует добавить 19,5 мл физиологического раствора.
.Главный опыт РНСК. Сыворотки исследуют в разведении 1:5 и 1:10 со специфическим антигеном, 1:5 с контрольным антигеном и без антигена. Реакция протекает в три этапа. На первом этапе инкубируют испытуемые сыворотки со специфическим антигеном в дозах по 0,2 мл в течение 60 мин при 37-38С. На втором этапе в реакцию вводят дополнительно позитивную (индикаторную) сыворотку, разведенную физиологическим раствором до предельного титра, по 0,2 мл, и одновременно во все пробирки разливают комплемент по 0,2 мл в рабочем разведении согласно результату титрования ег?/p>