Диагностика хламидиоза свиней
Дипломная работа - Сельское хозяйство
Другие дипломы по предмету Сельское хозяйство
?. Смесь (испытуемая сыворотка, антиген, позитивная индикаторная сыворотка и комплемент) инкубируют в течение 60 мин при температуре 37-38С. На третьем этапе добавляют гемолитическую систему по 0,4 мл и реакцию выдерживают 30 мин в водяной бане при 37-38С.
10.Контроли главного опыта РНСК. Контроли негативной и позитивной сывороток для каждой реакции ставят в двух вариантах: в одном варианте на втором этапе добавляют во все пробирки 0,2 мл индикаторной сыворотки, а во втором - 0,2 мл физиологического раствора. Контроли антигена и гемолитической сыворотки ставят с добавлением во все пробирки 0,2 мл физиологического раствора.
.Учёт реакции.
Таблица 1. Процент гемолиза.
КомпонентыНомера пробирок123456789Гемолизированая жидкость, мл0,10,20,30,40,50,60,70,80,9Физиологический раствор, мл0,90,80,70,60,50,40,30,20,1Процент гемолиза102030405060708090
Из реакции выбирают пять пробирок, где произошёл 100%-ный гемолиз эритроцитов, их содержимое сливают в одну пробирку. Из её готовят разведение с меньшим процентом гемолиза по схеме (см. таблицу 1) и готовят перед учётом реакции.
Степень гемолиза в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют путём сравнения со степенью гемолиза в стандартных пробирках. Процент гемолиза выражают в крестах.
+ + + + - гемолиз эритроцитов 0-10%
+ + + - гемолиз эритроцитов 10-40%
+ + - гемолиз эритроцитов 40-70%
+ - гемолиз эритроцитов 70-90%
- гемолиз эритроцитов 90-100%
Учёт реакции РНСК проводят визуально дважды: первый раз - сразу после извлечения штативов из водяной бани, второй - после оседания эритроцитов на дно пробирки (3-4 часа после бани).
Оценка результатов по проценту гемолиза:
Положительная - от двух крестов до полного гемолиза в разведении 1:10.
Сомнительная - в разведении 1:5 от трёх крестов до полного гемолиза эритроцитов, в разведении 1:10 на три креста.
Отрицательная - четыре креста в разведениях 1:5 и 1:10.
Дважды сомнительная считается положительной.
При выделении положительной сыворотки в реакции проводится раститровка её до предельного титра (см. положительный контроль).
В случае нарастания титра антител в парных пробах сыворотки в два и более раза диагноз считается установленным серологическим методом.
Иммуноферментный анализ применяют для ретроспективной диагностики хламидиоза. Используют твердофазный метод в направлении идентификации антигена и антител.
Сущность ИФА заключается в специфическом взаимодействии антител и антигена с псоледующим присоединением к полученному комплексу антивидового иммуноглобулина, меченного ферментом, способным вызывать разложение субстрата с образованием цветного продукта ферментативной реакции.
Техника постановки ИФА
Для проведения ИФА используют следующие наборы и оборудование:
В состав набора входят:
специфический антиген хламидиозный, лиофилизированный - 1 амп.;
специфическая положительная сыворотка, лиофилизированная -1 амп.;
отрицательная сыворотка, лиофилизированная -1 амп.;
пероксидазный антивидовой конъюгат,, лиофилизированный -1 амп.;
Химический набор, в состав которого входят:
КН2 РО4 - 1 амп.;
К2НРО4 - 1 амп.;- 1амп.;
Твин - 20 (-40,-80, Тритон Х- 100) - 1 амп.;
Лимонная кислота - 1 амп.;
К2НРО4 - 1 амп.;
О- фенилендиамин 2 амп.;
гидроперит - 1 табл.;
две 96- луночные полистироловые планшеты с плоским дном для ИФА;
стоп- раствор - 1 флакон.
Оборудование:
одноканальные и многоканальные пипетки (дозаторы) объемом от 0,05 см3 до 1 см3;
стеклянные пипетки на 1-2 см3;
промывающее устройство;
спектрофотометр с вертикальным лучом и фильтром 492 нм.
Приготовление рабочих растворов:
Буфер № 1 - ( 0,01М калий фосфатный, рН 7,2 - 7,4) предназначен для растворения антигена. Содержимое ампул 5,6,7 растворяют в 2500 см3 дистиллированной воды, фильтруют, проверяют рН. При необходимости рН корректируют 0,1 N КОН или НСI.
Буфер №2 - предназначен для растворения сывороток, конъюгата, а также для промывки микропанелей. К 2000 см3 буфера №1 добавляют содержимое ампулы №8.
Буфер №3 - (фосфатно- цитратный) предназначен для приготовления субстрата (рН 5,0 - 5,2). Состоит из двух компонентов: А и Б.
А - содержимое ампулы №9 растворить в 50 см3 дистиллированной воды в мерной колбе.
Б - содержимое ампулы №10 растворить в 50 см3 дистиллированной воды в мерной колбе, затем к 24,3 см3 раствора А добавить 25,7 см3 раствора Б и 50 см3 дистиллированной воды, проверить рН. В случае необходимости добавить небольшими порциями кислотный (А) или щелочной (Б) буфера до установления требуемого рН. Изменение цвета субстратного раствора (пожелтение до внесения в микропанели) является следствием использования для его приготовления недостаточно чистой посуды. В таком случае раствор подлежит замене. Готовят непосредственно перед использованием, хранению не подлежит.
Приготовление субстратно-индикаторного раствора. Готовят непосредственно перед употреблением. Применяют для цветного проявления реакции на последней стадии. Содержимое ампулы №11 растворить в 2 см3 спирта-ректификата и добавить 48 см3 буфера №3, внести 0,8 см3 перекиси водорода, полученной путем растворения 1 таблетки №12 в 10 см3 дистиллированной воды.
Буферные растворы хранят при температуре 4-6 С не более 3 мес.
Подготовка биологических компонентов реакции:
Содержимое ампулы со специфическим антигеном растворяют в 20 см3 буфера №1.
Содержимое ампулы с антивидовым конъюгатом растворяют в 20 см3 буфера №2.
Положительную и отрицательную сыворотки растворяю