Диагностика хламидиоза свиней
Дипломная работа - Сельское хозяйство
Другие дипломы по предмету Сельское хозяйство
?роводиться в отдельной комнате лаборантом или сотрудником лаборатории, не производящим манипуляций в пре-ПЦР помещении ("Правила проведения работ в диагностических лабораториях, использующий метод полимеразнрй цепной реакции).
В мерный цилиндр наливают 25 см3 концентрированного буфера, доводят дистиллированной водой до 500 см3, закрывают цилиндр парафинированной пленкой ("PARAFILM") и перемешивают. Агарозу из одной пробирки набора пересыпают в стеклянную колбу из термостойкого стекла объемом 250 см3, наливают 100 см3 готового буфера и плавят на кипящей водяной бане до полного растворения агарозы, после этого кипятят агарозу еще 20 мин и немного остужают, вращая колбу. Заливают агарозный гель в форму (толщина 5-6 мм), помещают гребенки на расстоянии не менее 3 см друг от друга.
После полного застывания геля (30 мин при комнатной температуре) осторожно вынимают гребенки, не повредив лунки. Помещают полосу готового геля в электрофорезную камеру так, чтобы лунки были обращены в сторону отрицательного электрода (ДНК из лунок будет двигаться к положительному электроду). Наливают приготовленного буфера столько, чтобы он покрыл гель на 4-5 мм. Выставляют пробирки с продуктами амплификации последовательно в штатив. Из-под слоя масла отбирают 15 мкл амплификата и вносят на дно лунки Можно пользоваться одним наконечником, промывая его (пипетируя 1 -2 раза) буфером из камеры после внесения каждой пробы.
Подключают камеру к источнику тока, соблюдая полярность. Если нет нарушения контактов, то при прохождении тока от электродов должны подниматься пузырьки. Электрофорез проводят в градиенте напряжения 10 В/см до того момента, как краситель (ксиленцианол) пройдет примерно половину длины геля. Выключают источник тока, переносят гель на трансиллюминатор, расположив полосы горизонтально лунками вверх и совместив уровень лунок (одна под другой) для удобства учета. Просматривают расположение полос ДНК под ультрафиолетовым излучением. (Глаза и лицо должны быть защищены специальной маской или стеклянной пластиной).
Электрофореграмму фотографируют с оранжевым светофильтром в проходящем ультрафиолете на чувствительную пленку типа "Микрат 300" или поляроидную пленку. Документирование результатов можно проводить с помощью других систем: Insta Doc I, Insta Doc II (фотографирующие), Gel Doc 1000 или Шатер ДВ (компьютерные).
Учет и интерпретация результатов. В дорожке соответствующей положительному контрольному образцу должна быть яркая специфическая светящаяся оранжевая полоса на уровне 300 п.н. Положительными считаются образцы, которые содержат специфическую светящеюся полосу большей или меньшей интенсивности на уровне 300 п.н.
В дорожке, соответствующей отрицательному контрольному образцу не должно быть каких-либо полос. Отрицательными считаются образцы, которые не содержат специфической полосы 300 п.н.
Кроме полосы 300 п.н. в дорожках могут наблюдаться нечеткие размытые пятна праймер-димеров, которые располагаются ниже уровня 100 н.п. (в нижней части дорожки).
При работе с материалом, содержащим много клеток, в ПЦР участвует большое количество неспецифической геномной ДНК. При этом в дорожках геля появляются характерные шмеры, равномерно располагающиеся от лунки до самого низа дорожки или концентрирующиеся около лунки. На фоне такого шмера в положительном образце видна специфическая полоса, а в отрицательном образце полоса отсутствует.
Результаты анализа не учитываются, если:
в дорожке какой-либо пробы отсутствуют обе полосы. Необходимо повторить исследование этой пробы с самого начала. Возможная причина - ошибка на первом этапе работы, приведшая к недостаточной сорбции ДНК или плохой очистке от ингибиторов реакции.
в дорожке любого отрицательного контроля выявляется специфическая полоса. Возможно, произошла контаминация реактивов и проб положительной ДНК или продуктами амплификации положительной ДНК в процессе работы. Для проверки реактивов необходимо поставить не менее трех отрицательных контролей на этапе выделения ДНК и столько же на этапе постановки ПЦР для выявления источника контаминации. Если результат повторяется, необходимо сменить реактивы.
в дорожках появляются неспецифические полосы на разных уровнях. Возможные причины: неправильное проведение "горячего старта" или неверный температурный режим в ячейках амплификатора.
Идентификация хламидий
Идентифицируют хламидии и их антигены методами световой и люминисцентной микроскопии (РИФ), в РДСК, РНСК, РНГА, ИФА или с помощью ПЦР.
Диагноз на хламидиоз считают установленным в одном из следующих случаев:
. При выделении возбудителя из исследуемого материала и его идентификации;
. При получении нарастания титра антител в парных пробах сыворотки крови больных или переболевших животных в РДСК, РНСК, РНГА, ИФА в два и более раз;
. При выявлении ДНК хламидий в ПЦР.
При диагностике хламидиоза предусмотрены следующие сроки исследований:
выявление специфических антител - от 1 до 5 дней;
световая микроскопия - от 30 минут до 2 часов;
люминесцентная микроскопия - до 3 часов;
выделение и идентификация хламидий - от 7 до 40 дней;
выявление ДНК хламидий - от 4 часов до 2 суток.
7. Дифференциальная диагностика
Хламидиоз свиней следует дифференцировать от бруцеллеза, лептоспироза, болезни Ауески, гемофилезного полисерозита и плевропневмонии, сальмонеллеза, листериоза, болезни Тешена, энтеровирусного гастроэнтерита, бо