Диагностика хламидиоза свиней
Дипломная работа - Сельское хозяйство
Другие дипломы по предмету Сельское хозяйство
т в 5 см3 буфера №2 получая разведение 1:200.
Растворенный антиген , сыворотки , антивидовой конъюгат хранят при 4-6 С в течении 3-4 дней.
Разведение проб сыворотки крови.
Испытуемую сыворотку крови разводят 1:200 буфером №2 в отдельных пробирках или микропанели.
Постановка иммуноферментной реакции.
Затраты времени на постановку реакции не превышают 24 часа.
Сорбция антигена на микропанели.
Промывание микропанели.
Микропанели освобождают от содержимого путем вытряхивания. Каждую лунку заполняют буфером №2. Выдерживают 1 мин. Затем вытряхивают. Промывание повторяют 4-5 раз.
Можно использовать автоматическое или полуавтоматическое промывающее устройство.
Разведение сывороток.
В три лунки микропанели вертикального ряда А1, В1, С1, вносят по 0,1 см3 специфической положительной сыворотки (положительный контроль), а в три следующие лунки D1, E1, F1 вносят по 0,1 см3 отрицательной сыворотки (отрицательный контроль). Сыворотки подготовлены согласно п.3.4.2. В лунки G1, Н1, которые служат контролем субстрата, вносят по 0,1 см3 буфера №2. В горизонтальные ряды А, Е вносят, начиная с лунок А2 и Е2 по 0,2 см3 исследуемых парных проб сыворотки, подготовленных как указано в п.3.4.3. и проводят раститровку по вертикальным рядам, начиная с разведения 1:200 до 1:6000.
Микропанели закрывают крышкой и выдерживают при 37С в термостате в течении часа.
Внесение конъюгата.
Все лунки микропанелей промывают как указано в п. 3.5.2.
Во все лунки вносят по 0,1 см3 рабочего раствора иммуноферментного конъюгата подготовленного согласно п.3.4.2., и инкубируют в термостате при 37С в течении 1 часа.
Промывают 5 раз как указано в п. 3.5.2.
Проявление реакции.
Готовят субстратно-индикаторный раствор согласно п. 3.4.1.
Во все лунки микропанелей вносят по 0,1 см3 субстратно-индикаторный раствора и выдерживают в темноте при комнатной температуре 30-40 мин.
В каждую лунку вносят по 10 мкл стоп-раствора.
Учет результатов реакции.
Результаты учитываются в течении 30-40 мин. после внесения стоп-раствора.
Визуальный учет: при наличии специфических антител наблюдается оранжево-коричневое окрашивание как в положительном контроле.
Отрицательными считаются пробы, не изменившие окраску или имеющие слабое пожелтение, аналогичное цвету отрицательного контроля.
Спектрофотометрический учет: регистрацию результатов реакции проводят на специальных фотометрах с вертикальным лучом при длине волны 490 нм. Результат выражают в единицах оптической плотности (ОП490).
Положительными считаются пробы, ОП490 которых в два и более раза превосходят уровень оптической плотности отрицательного контроля, но при этом не должен быть ниже 0,200 оптических единиц.
Сомнительные пробы - ОП 490 которых выше отрицательного контроля и составляют 0,150-0,199 оптических единиц.
Уровень оптической плотности ниже 0,150 оптических единиц свидетельствуют об отрицательной реакции.
Интерпретация результатов ИФА.
Основанием для постановки предварительного диагноза на хламидиоз является увеличение титра антител в парных пробах сывороток в 2-4 раза. При этом учитывается эпизоотическая ситуация в хозяйстве, наличие клинических и патологоанатомических признаков заболевания.
Сыворотки, давшие сомнительную реакцию, подлежат повторному исследованию и при подтверждении первоначального результата считаются положительными.
Животных, с сыворотками крови которых получены положительные и сомнительные результаты, исследуют повторно прямыми методами диагностики для постановки окончательного диагноза.
Молекулярно-генетический метод.
Метод предназначен для выявления ДНК хламидий с помощью полимеразной цепной реакции ПЦР в патологическом материале от животных.
Суть ПЦР заключается в амплификации, т.е. увеличении числа копий строго определенных фрагментов молекулы ДНК или РНК (праймеров) искомого агента in vitro с последующей индикацией амплификона (амплифицируемый участок ДНК) методом электрофореза или другим методом.
ПЦР позволяет идентифицировать возбудитель в количестве 1 бакт. клетки в пробе, специфичность 100%.
В ПЦР используют следующие наборы:
набор для выделения ДНК (набор № 1);
набор для проведения ПЦР (набор № 2);
набор для электрофоретического анализа продуктов ПЦР (набор № 3);
набор контрольных образцов (набор №4).
Набор для выделения ДНК состоит из следующих компонентов:
лизирующий раствор -1 пробирка, 30 см3;
отмывочный раствор №1-1 пробирка, 20 см3;
концентрат для отмывочного раствора №2 -1 пробирка, 20 см3;
суспензия сорбента - 2 пробирки по 2 см3;
буфер для элюции ДНК с сорбента - 2 пробирки по 5 см3.
Набор.для проведения ПЦР состоит из следующих компонентов:
смесь праймеров "Chla" -1 пробирка, 0,25 см3;
смесь нуклеотидов - 1 пробирка, 0,25 см3;
5-кратный реакционный буфер -1 пробирка, 0,5 см3;
деионизованная вода -1 пробирка, 1 см3;
фермент Taq-полимераза -1 пробирка, 0,05 см3;
воск для ПЦР -1 пробирка, 1,0 см3;
масло минеральное -1 пробирка, 5,0 см3.
Набор для электрофоретического анализа продуктов ПЦР состоит из следующих компонентов:
концентрат буфера с бромидом этидия - 3 флакона по 25 см3;
агароза для электрофореза - 3 пробирки по 2 г.
Набор контрольных образцов состоит из следующих компонентов:
ОКО (отрицательный контрольный образец) -1 пробирка, 1 см3;
положительный контрольный образец для ПЦР- К+ ДНК (ДНК Chlamydia psittaci) - 1 пробирка, 0,1 см3.
Отбор материала для исследования. При от?/p>