Диагностика хламидиоза свиней
Дипломная работа - Сельское хозяйство
Другие дипломы по предмету Сельское хозяйство
?той крышкой.
Проверяют состояние сорбента - при отстаивании он должен занимать приблизительно половину объема суспензии. После этого приступают к выделению ДНК.
В ряд полипропиленовых пробирок объемом 1,5 см3 вносят по 100 мкл предварительно подготовленных исследуемых проб, а также по 100 мкл контрольных проб 1-го этапа анализа ("контролей выделения"): отрицательные пробы - элюи-рующий буфер и физиологический раствор (последний вносят в случае подготовки пробы с его использованием), положительная проба - ДНК Chlamydia (из набора №4), разведенная 1:10 элюирующим буфером. Добавляют по 300 мкл лизирующего раствора (в каждую пробу отдельным наконечником с аэрозольным барьером) и тщательно пипетируют 5-10 раз до полного лизиса пробы, стараясь при этом не вспенивать раствор. Прогревают пробирку 5 мин при 65 С, тщательно перемешивают на вортексе до полного растворения материала. Добавляют 20 мкл ресуспендированного на вортексе сорбента (в каждую пробирку отдельным наконечником), хорошо перемешивают. содержимое пробирки на вортексе и оставляют в штативе на 2 мин для осаждения сорбента, еще раз перемешивают и отстаивают 5-7 мин. Осаждают сорбент на "Микроспине" в течение 30 сек и отбирают супернатант из каждой пробирки отдельным наконечником (удобно использовать вакуумный отсос с колбой-ловушкой для отбираемой жидкости). Добавляют по 200 мкл отмывочного раствора №1, перемешивают на вортексе до полного ресуспендирования (если сорбент плохо разбивается, тогда его разбивают при помощи наконечника пипетки), осаждают на "Микроспине" в течение 30 с и отбирают супернатант. Добавляют по 800 мкл отмывочного раствора №2, перемешивают на вортексе до полного ресуепендирования сорбента, осаждают на микроцентрифуге при 10000 об/мин в течение 30 с, отбирают супернатант. Повторяют процедуру отмывки раствором №2, тщательно отбирают супернатант и высушивают осадок сорбента при открытых крышках пробирок в термостате при 65 С, в течение 5-7 мин. Добавляют 50 мкл элюирующего буфера, ресуспендируют, помещают в термостат при 65 С на 5 мин, встряхивая на вортексе через каждую минуту. Осаждают на микроцентрифуге при 10000 об/мин в течение минуты. Проба готова к постановке ПЦР, супернатант содержит очищенную ДНК.
Подготовить положительный контрольный образец для ПЦР, для чего развести К+ ДНК в 100 раз в буфере для элюции ДНК и вместе с ДНК-пробами перенести в комнату для постановки ПЦР.
ЭТАП 2. Постановка ПЦР (амплификация ДНК).
Пробирку с воском ставят в термостат при 95 С до полного расплавления. Готовят "нижнюю" реакционную смесь, используя стерильные наконечники (полистирол выдерживает автоклавирование при 120 С):
для амплификации ДНК Chlamydia: к 0,25 см3 праймеров "Chia" добавляют 0,25 см3 нуклеотидов, смешивают на вортексе;
Раскапывают в микропробирки для ПЦР по 5 мкл "нижней" смеси, наслаивают сверху по 10 мкл расплавленного воска так, чтобы он полностью накрыл жидкость, закрывают крышки, на верхней части которых наносят пометки "Chia", Если воск покрыл жидкость неровно или образовались пузыри, прогревают -пробирки в амплификаторе 5 мин при 95 С и охлаждают. В таком виде, пробирки хранятся в морозильнике -несколько месяцев, можно приготовить сразу 50-100 штук.
Готовят "верхнюю" смесь: к 0,5 см3 5-кратного реакционного буфера добавляют 0,45 см3 деионизованной воды и 0,05 см3 Taq-полимеразы, хорошо перемешивают на вортексе. Смесь хранится при 2-8 С в течение месяца (не замораживать!). Выставляют ряд пробирок с "нижними" смесями ("Chia") в штатив по числу испытуемых проб, включая контрольные из 1-го этапа анализа ("контроли выделения"), и добавляют пробирки для "контролей ПЦР" (деионизованная вода и ДНК Chlamydia, разведенные деионизованной водой 1:10), нумеруют их. Раскапывают на поверхность застывшего воска по 10 мкл "верхней" смеси, при этом она не должна проваливаться под воск и смешиваться с "нижней" смесью. Сверху раскапывают по 1 капле масла. Под масло вносят по 10 мкл проб -испытуемых и контрольных и 10 мкл К+ ДНК, подготовленной для постановки ПЦР, т.е. разведенной 1:100 буфером для элюции. Для отрицательного контроля амплификации вместо ДНК-пробы добавляют 10 мкл деионизованной воды (из набора №2). .Набирают на амплификаторе нужную программу:
Амплификаторы с регулированием температуры по матрице (скорость нагрева-охлаждения - не менее 1 С/сек:) "MiniCycler", "РТС-100" (MJ Re-search)Амплификаторы с активным регулированием (по раствору в пробирке): "GeneAmp PSR System 2400" (Рег-kin Elmer); "Omn-E (Hibaid); "Терцик" (ДНК-технология)95С- пауза 95 С - 2мин 1 цикл 95 С-45с 62С-45с} 40циклов 72 С - 45 с 10 С -12-14 час (хранение)95 С - пауза 95С - 2мин 1 цикл 95 С-10 с 62 С-10 с} 40циклов 72С-10 с 10 С -12-14 час (хранение)
Через 1-2 мин после запуска программы, (когда температура в ячейке амплификатора достигнет 95 С), ставят программу на паузу, помещают пробирки в ячейки, закрывают крышку прибора, убирают паузу и ждут окончания реакции (примерно 2,5 часа на амплификаторе с регулированием температур по матрице и 1 час 40 мин на амплификаторе с активным регулированием). После окончания реакции (в тот же день или после хранения утром следующего дня) собирают пробирки в отдельный пакет и отправляют в комнату для анализа продуктов ПЦР, который проводится разделением фрагментов ДНК в агарозном геле.
Длина амплифицированного специфического фрагмента ДНК:- ЗОО п.н.
ЭТАП 3. Электрофоретический анализ продуктов ПЦР.
Работа с амплифицированными ДНК должна ?/p>