Виготовлення лікарських препаратів на основі амілолітичних ферментів
Курсовой проект - Медицина, физкультура, здравоохранение
Другие курсовые по предмету Медицина, физкультура, здравоохранение
?ежити динаміку поведінки білкової макромолекули [1]. Розробляються в даний час програми компютерного моделювання білкових молекул на основі результатів кристалографії дозволяють одержувати наочні тривимірні зображення досліджуваних обєктів, і по-новому осмислити дані експериментальних досліджень кінетики-термодинамічних властивостей ряду ферментів, отримані за останнє десятиліття, а, отже, виявити додаткові аспекти молекулярних механізмів ферментативного перетворення субстрату. У звязку з цим метою даної роботи є аналіз топології амілолітичні ферментів з використанням програми MolScript по даних рентгеноструктурного аналізу. Підвищений інтерес до амілаза зумовлений їх широким застосуванням у медицині, харчовій і легкій промисловості як ефективні біокаталізаторів. Дослідження фізико-хімічних властивостей, кінетика-термодинамічних параметрів, особливостей фермент-субстратні взаємодій при здійсненні акту каталізу амілолітичні ферментами сприяли суттєвому зміни й удосконалення багатьох існуючих технологій і створення нових. Однак, очевидним є брак інформації про просторової організації макромолекул ферментів даної групи.
Обєктом наших експериментальних досліджень є глюкоамілаза з Aspergillus awamori, препарат Г-20Х виробництва Ладижинського заводу ферментних препаратів. Для визначення активності глюкоамілази використовували глюкозооксідазний метод. Визначення загальної кількості білка в ферментні препарати проводили за методом Лоурі. Дослідження співвідношення типів вторинної структури здійснювали методом інфрачервоної спектроскопії на спектрометрі Specord M-80 (Німеччина). Визначення молекулярної маси глюкоамілази, а також вивчення четвертинної структури ферменту з використанням додецилсульфату натрію у концентрації 3,5 10-5 моль / л для руйнування надмолекулярних рівня організації, проводили за допомогою гель-хроматографії на сефадексе G-200. Кількісне визначення SH-груп здійснювали методом, заснованому на вимірюванні приросту оптичної щільності в області 255 нм при приєднанні n-меркурібензоата до SH-групам. Для кількісного визначення SS груп використовували метод, заснований на вимірюванні оптичної щільності (l = 412нм.) При утворенні нітротіобензоата. Визначення числа йоногенних груп проводили на автоматичної установки, розробленої на кафедрі біофізики та біотехнології ВДУ, шляхом порівняння кривих титрування білка. Вивчення просторової структури глюкоамілази здійснювали з використанням програми MolScript.
Програма MolScript використовується для моделювання протеїнових і протеідових структур. Вихідними даними для програми є *. in файл, в якому вказується файл рентгеноструктурного аналізу, обєкти для виводу і точну їх опис за допомогою графічних параметрів. Для створення в першому наближенні вхідних файлів MolScript використовується програма MolAuto. Ця програма розпізнає вторинну структуру у файлі pdb і виводить відповідні команди для схематичного опису даної структури. MolAuto має кілька ключів, які дозволяють впливати на властивості обєктів. Програма не здатна вибирати зручний ракурс, тому користувачеві необхідно вибирати його самостійно. MolAuto може бути частиною потоку UNIX з програмою MolScript: наприклад для швидкого отримання зображення структури в режимі OpenGL. Кожен формат, підтримуваний MolScript, володіє своїми специфічними властивостями. Тому вибір формату проводиться з урахуванням встановленого програмного забезпечення і бажаного набору властивостей отриманої моделі.
Програма MolScript використовує одну фіксовану правостороннім систему координат з ціною ділення 1 ангстрем. Точка огляду зафіксована і змінитися не може. Для перегляду молекули з різних ракурсів атомні координати необхідно трансформувати, тобто повернути і / або транслювати в межах системи координат. Молекулярні координати зчитуються з pdb файлу, а самі координати атомів і залишків, що входять в дане зображення, використовуються графічними командами. Координати обраних атомів трансформуються матрицею, визначеної однією або кількома операціями.
При вивченні топології для двовимірних статичних і тривимірних моделей проводилося розпізнавання субодиниць ферментів в різних масштабах по різних напрямах. Топологічні питання розглядалися як для фрагментів, так і для цілісних молекул амілолітичні ферментів, що дозволило ввести позначення функціонально значущих груп.
Класичні методи вивчення особливостей перебігу ферментативного каталізу дозволяють розглядати широке коло питань. Так, експериментальним шляхом нами було досліджено вплив різних фізико-хімічних факторів на конформацію макромолекули глюкоамілази з Aspergillus awamori та повязаних з нею механізмів активації та інактивації даного ферменту; Вивчено кінетику-термодинамічні аспекти реакції гідролізу крохмалю. Методом гель-хроматографії визначена молекулярна маса глюкоамілази, що становить 106 кДа. Дослідження амінокислотного складу глюкоамілази показало, що молекула ферменту містить 26,8% амінокислотних залишків з алкільних бічними ланцюгами (Ala, Val, Leu, Met, Ile), що визначають високу стійкість ферменту до органічних розчинників. Виявлено високий вміст у молекулі глюкоамілази Ser і Thr. Результати наших експериментів і аналіз даних літератури з секвенування глюкоамілази (А. Е. Альошин та ін, 1994) дозволяють зробити висновок про те, що молекула ферменту має 6 SH-груп та 4 дисульфідних звязку, що стабілізують його третинну структуру. Вивчення надмолекулярних рівня організації глюкоамілази показало наявність чет?/p>