Борьба с инфекционной бурсальной болезнью кур
Курсовой проект - Сельское хозяйство
Другие курсовые по предмету Сельское хозяйство
?ечный иммуноэлектрофорез используют как с целью индикации и идентификации вируса болезни Гамборо, так и для определения специфических антител. Сущность методики заключается в одновременном движении в агаре белковых молекул с различной электрофоретической подвижностью с образованием преципитата из гомологичных антигенов и антител. Для постановки ВИЭФ используют приборы ПЭФ-3, ЭФ-2 или аналогичных марок и набор диагностикумов для постановки РИД. Реакцию ставят на стеклянных пластинах, покрытых 1%-ным раствором агара на 0,85 М веронал-мединаловом буфере (рН=8,6). В агаре вырезают лунки диаметром 4 мм, на расстоянии 4 мм друг от друга.
В лунки у анода вносят положительный антиген и исследуемые сыворотки, а у катода - положительный антиген и исследуемый патологичекий материал. Электрофорез проводят 1,5 ч при силе тока 4 мА/ см. Контролями служат отрицательные антиген и сыворотка
Пластины просматривают в косо проходящем свете на темном фоне. Реакцию считают положительной, если между лунками с испытуемым антигеном или сывороткой и положительной сывороткой или антигеном образуются одна или две линии преципитации.
Реакция непрямой гемагглютинации основана на способности антител агглютинировать эритроциты, сенсибилизированные специфическим антигеном. РНГА может применяться как для серологической диагностики, так и для изучения серологической эпизоотологии болезни Гамборо.
При постановке РНГА используют эритроцитарный антиген и контрольные (положительная и отрицательная) сыворотки из диагностического набора БелНИИЭВ для диагностики инфекционного бурсита (болезни Гамборо).
Реакцию ставят микрометодом в микротитраторе Такачи. В лунках горизонтальных рядов плексигласовых пластинок из исследуемых пластинок готовят последовательные двукратные разведения (от 1:2 до 1:1024) на 0,85%- ном растворе натрия хлорида, содержащем 1% глицерина, в объеме 0,025 мл (1 капля). В первые лунки вносят 0,025 мл исследуемой сыворотки, перемешивают, и 0,025 мл смеси переносят в следующие лунки и т.д. Из последних лунок после перемешивания 0,025 мл содержимого удаляют в дезинфицирующий раствор. В каждую лунку с соответствующим разведением сыворотки добавляют 0,025 мл 1%-ной взвеси сенсибилизированных вирусом эритроцитов и встряхивают.
Одновременно готовят: контроль эритроцитарного антигена на спонтанную агглютинацию (в 2-3 лунках вносят 0,025 мл отрицательной сыворотки и 0,025 мл эритроцитарного антигена); положительный контроль (в 2-3 лунках вносят 0,025 мл положительной сыворотки и 0,025 мл эритроцитарного антигена); отрицательный контроль (в 2-3 лунки вносят 0,025 мл отрицательной сыворотки и 0,025 мл эритроцитарного антигена).
Плексигласовые пластинки с компонентами помещают в термостат на 1- 1,5 часа при t=37С до оседания эритроцитов.
Учет реакции ведут только в том случае, когда контроль эритроцитарного антигена на спонтанную агглютинацию и с заведомо отрицательной сывороткой отрицательные, а контроль с положительной сывороткой --положительный.
Положительная реакция характеризуется появлением осадка эритроцитов в виде зонтика на дне лунки. Отрицательная реакция проявляется выпадением эритроцитов в осадок в виде точки или колечка с ровными краями.
При агглютинации эритроцитов испытуемыми сыворотками в разведении 1:8 и выше РНГА считают положительной, а 1:4 и ниже - отрицательной.
Иммуноферментный анализ широко применяют в качестве наиболее специфичного теста для выявления в сыворотке крови иммунной птицы специфических противовирусных антител. Для постановки данной реакции используют набор диагностикумов ВНИИЗЖ для определения антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни (болезни Гамборо) методом ИФА. Сущность данной методики заключается в выявлении комплекса антиген- антитело на поверхности лунок полистиролового планшета. Образовавшийся специфический комплекс взаимодействует с антивидовым иммунопероксидазным коньюгатом против Ig G кур и вызывает разложение субстрата, окрашивая содержимое лунок планшета.
Перед приготовлением рабочих растворов набор с компонентами выдерживают 30 мин. при комнатной температуре (18-20С).
Раствор №1. В 1000 см3 дистиллированной воды растворяют 0,97 г трис (оксиметил) аминометана (флакон 5.1), 6,61 г трис (оксиметил) аминометана гидрохлорида (флакон 5.2) и 11,7 г хлорида натрия (флакон 5.3). После измерения рН полученного раствора (которое должно быть в пределах 7,4-7,6), к нему добавляют 1,0 мл жидкого детергента твин-20 (флакон 7). Данный раствор используют для разведения контрольных сывороток, испытуемых проб, антивидового коньюгата и межэтапной промывки.
Раствор №2. Для приготовления субстратного буфера 5,37 г дигидрофосфата натрия (флакон 6.1) растворяют в 50 мл дистиллированной воды. Содержимое флакона 6.2 (1,51 г лимонной кислоты) также растворяют в 50 мл дистиллированной воды. Затем смешивают 224,3 мл раствора натрия дигидрофосфата с 25,7 мл раствора лимонной кислоты, добавляют 50 мл дистиллированной воды. Полученный раствор должен иметь рН=4,9-5,0. При необходимости добавляют кислый или щелочной компоненты.
Раствор №3. В 0,5 мл раствора №1 растворяют 1,0 см3 цельной леофилизированной положительной сыворотки против болезни Гамборо (флакон 1). Допускается хранение полученного раствора в течение 3 суток при 4 С.
Раствор №4. В 0,5 мл раствора №1 растворяют 1,0 см3 цельной леофилизированной отрицательной сыворотки против болезни Гамборо (флакон 1). Допускается хранение полученного раствора в течение 3 суток при 4 С.
Раствор №5 С