Борьба с инфекционной бурсальной болезнью кур
Курсовой проект - Сельское хозяйство
Другие курсовые по предмету Сельское хозяйство
?терильные пробирки и проверяют на стерильность путем посева 0,2 мл жикости на МПА и МПБ. Принадлежность выделенного агента к вирусу болезни Гамборо определяют путем постановки РН и РИД.
Заражение культур клеток. Для изоляции вируса используют 24-48-часовые культуры фибробластов КЭ. Срок наступления ЦПД зависит от дозы вируса и числа пассажей. При первичном его выделении специфические изменения наблюдаются после 2-3 пассажей вируссодержащего материала. ЦПД проявляется через 48-72 часа после заражения культуры клеток и характеризуется вакуолизацией и округлением клеток, явлениями кариопикноза и кариолизиса. Специфичность цитопатических изменений подтверждают постановкой РН.
Биопроба на цыплятах. Для заражения используют 21-дневных SPF- цыплят или 35-40-дневную птицу из промышленного стада с хорошо развитыми Фабрициевыми бурсами. Для этого из общего количества цыплят, предназначенных для биопробы, произвольно вылавливают 5-10 голов, убивают, определяют индивидуальные абсолютные массы тела и бурсы, выводят бурсальный индекс (БИ) по формуле:
БИ = 1000,
где Мс - масса Фабрициевой бурсы (г),
Мт - масса тела птиц
Цыплят, в стаде которых индекс бурсы 4 и выше, используют для постановки биопробы. Заражение цыплят с индексом ниже 4 не вызывает острого течения болезни. Определение бурсального индекса имеет важное диагностическое значение, так как у зараженных цыплят отмечается снижение данного показателя в 3- 9 раз.
Перед заражением у отобранных для биопробы 10-20 птиц отбирают пробы сыворотки крови для серологического исследования (РИД, РН, РНГА, ИФА) на наличие антител к вирусу болезни Гамборо. Исследуемый материал вводят интраназально в дозе 0,5 мл.
Биопробу считают положительной, если у зараженных цыплят через 2-5 суток развиваются характерные клинические признаки болезни (диарея, обезвоживание, общее угнетение, грязно-серый перьевой покров). При вскрытии больной и переболевшей птицы отмечают характерные патологоанатомические изменения.
Через 15 дней после заражения у оставшихся в живых цыплят проводят повторное серологическое исследование сыворотки крови для выделения диагностического (4-кратного) увеличения титра специфических антител и затем их убивают с целью установления патологоанатомических изменений.
Реакция нейтрализации. Ее используют для идентификации вируса болезни Гамборо и для обнаружения специфических противовирусных антител. Реакцию ставят на куриных эмбрионах. В ней используют нормальную и специфическую гипериммунную сыворотки, а в качестве антигена выделенный на КЭ вирус. Перед постановкой реакции сыворотки инактивируют в водяной бане при +56С (30 мин), после чего в них добавляют пенициллин (1000 ЕД/ мл) и стрептомицин (1мг/мл).
Гипериммунную и нормальную сыворотки разливают сухими стерильными пипетками по 0,5 мл в стерильные пробирки. Затем в каждую из них по 0,5 мл испытуемого антигена в разведениях от 10-1 до 10-9. После встряхивания пробирки выдерживают при +37С в течение 30 минут. Полученные смеси в дозе 0,2 мл вводят в аллантоисную полость 9- суточных эмбрионов. Дважды в сутки проводят овоскопию. Павшие эмбрионы вскрывают. На 10-й день для выявления специфических изменений в органах и тканях все эмбрионы вскрывают. Результаты РН выражают индексом нейтрализации, который определяют по общепринятой методике. Реакция считается положительной, если разница в титрах с нормальной и гипериммунной сыворотками составляет 2 lg и более.
Реакция иммунофлюоресценции. Является методом экспресс- диагностики, так как позволяет установить диагноз в течение 2-3 часов с момента доставки патологического материала.
Из бурсы Фабрициуса павших или убитых с диагностической целью птиц на тонких, сухих, обезжиренных предметных стеклах готовят мазки-отпечатки (не менее 3), фиксируют 10-20 минут в ацетоне, дважды отмывают в двух сменах 0,01 М фосфатно- солевого буфера (рН=7,2-7,4), затем высушивают и окрашивают по общепринятой методике. Контрольные мазки- отпечатки готовят из бурсы здоровых цыплят.
Реакцию считают положительной, если на всех препаратах обнаружено не менее 3-х лимфоцитов со специфическим ярко- зеленым свечением антигена в цитоплазме (мелкие гранулы или диффузный ореол вокруг ядра).
Кроме мазков- отпечатков для РИФ можно исследовать криосрезы бурсы Фабрициуса. Для этого орган замораживают в петролейном эфире, охлажденном до минус 76С в смеси ацетона и сухого льда. Затем их примораживают к блоку микротома. Срезы готовят толщиной 4-5 мкм.
Реакция торможения непрямой гемагглютинации. Данная методика может применяться для индикации вирусного антигена в патологическом материале, а также идентификации вируса, выделенного в КЭ и КК.
Из патологического материала от больных и павших птиц, хорион-аллантоисных оболочек павших после заражения КЭ готовят гомогенат на стерильном 0,85%-ном растворе натрия хлорида (рН=7,2-7,4) в соотношении 1:1. После трехкратного замораживания и оттаивания гомогенат центрифугируют при 5000 об./мин. в течение 25 минут. Надосадочную жидкость сливают для исследования в РТНГА. Пробы аллантоисных жидкостей используются в нативном виде после центрифугирования 15-20 минут при 3000 об./мин. Таким же способом готовят суспензии от контрольных птиц и КЭ. Кроме того, используют специфическую иммунную сыворотку к вирусу болезни Гамборо и положительный эритроцитарный антиген из набора диагностикумов БелНИИЭВ для серологической диагностики данной болезни в РНГА.
РТНГА