Борьба с инфекционной бурсальной болезнью кур
Курсовой проект - Сельское хозяйство
Другие курсовые по предмету Сельское хозяйство
ставят микрометодом с использованием микротитратора Такачи. При этом, в первый ряд лунок панели готовят в объеме 0,025 мл двукратное разведение испытуемого материала от 1:2 до 1:128. Для этого в каждую лунку вносят 0,025 мл 0,85%-ного раствора натрия хлорида, содержащего 0,5% глицерина. В первую лунку вносят 0,025 мл испытуемого материала и, перемешивая, 0,025 мл переносят в другую лунку и т.д. (до разведения 1:128. Во втором ряду таким же образом готовят безвирусную суспензию. К каждому разведению обоих рядов добавляют 0,025 мл иммунной сыворотки, разведенной на 1-2-кратных разведений меньше, чем ее предельный титр в РНГА. Панель со смесями встряхивают и помещают в термостат на 60 мин. при 37С. Учет реакции осуществляют после оседания эритроцитов.
Реакция считается положительной, если в первом ряду с испытуемым материалом произойдет торможение агглютинации в первых двух-трех лунках при условии полной агглютинации второго ряда.
Реакция агглютинации латекса используется для индикации вирусного антигена. Патологический материал гомогенизируют в 0,01 М фосфатно- солевом буфере (рН=7,2) в соотношении 1:1, трижды замораживают и оттаивают. Вируссодержащую суспензию центрифугируют при 3000 об./мин. 30 минут. Надосадочную жидкость сливают для постановки РАЛ.
Гипериммунную сыворотку к вирусу ИББ получают иммунизацией цыплят инактивированной масляно-эмульсионной вакциной. Из сыворотки выделяют гамма-глобулиновую фракцию осаждением сульфатом аммония.
Латексный антительный диагностикум готовят, смешивая суспензию латекса (2%-ная концентрация частиц) с равным объемом гамма- глобулиновой фракции в соответствующем буферном растворе. Смесь инкубируют 16-18 часов при 4С, затем центрифугируют 30 минут при 3000 об./мин. и трижды промывают осадок буферным раствором. Сенсибилизированный латекс ресуспендируют в этом же растворе до конечной концентрации частиц(0,5- 2,0%) и добавляют 0,05% азида натрия. Готовый диагностикум хранят в холодильнике при 4С.
Реакцию агглютинации латекса ставят на предметном стекле. На него наносят дозатором 25 мкл антигена в разведении от 1:2 до 1:512, добавляют 25 мкл латексного антительного диагностикума и смешивают, плавно поворачивая. Результаты реакции учитывают через 2-5-минут по трехбалльной системе: резко положительная реакция (+++) - четкая агглютинация, крупные хлопья в прозрачной жидкости; положительная (++) - агглютинация видна, однако фон полностью не просветляется; отрицательная (-) - мутная гомогенная жидкость. Контролем служат смесь латекса с 0,85%-ным раствором натрия хлорида (контроль диагностикума), с положительным и отрицательным антигенами (положительный и отрицательный контроль).
Реакция иммунодиффузии (РИД). Данная методика широко используется как с целью индикации и идентификации вируса болезни Гамборо, так и для определения специфических антител. При постановке РИД используют наборы для диагностики болезни Гамборо ВНИВИП или ВНИИЗЖ.
В лаборатории патологический материал взвешивают, добавляют эквивалентное количество 0,85%-ного раствора натрия хлорида или дистиллированной воды, гомогенизируют, промораживают и центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 10 минут. Надосадочную жидкость сливают и используют для исследования в РИД.
Для постановки реакции используют 1,25%-ный агар с 8% натрия хлорида и 0,5% фенола. Чашки Петри заполняют за 24-72 часа до использования, предварительно растворяя агар на пару и заливают по 20 мл в чашки. Слой агара должен быть не менее 3 мм.
Для исследования проб используют линейный порядок расположения лунок. Делают 3 ряда вертикальных лунок диаметром 5 мм, на расстоянии 5 мм. Агаровые пробки удаляют иглой или пинцетом.
Каждую пробу испытуемой диагностической сыворотки разводят физиологическим раствором (0,85% раствор натрия хлорида) сначала 1:2, а затем последовательно двукратным шагом до 1:256.
Сухие эталонные антигены перед использованием растворяют дистиллированной водой или 0,85%-ным раствором натрия хлорида до объема 0,5 мл. Сухие диагностические сыворотки сначала разводят дистиллированной водой в объеме, указанном на этикетке, а затем готовят ряд последовательных двукратных разведений.
При исследовании патологических материалов в центральный ряд лунок вносят положительную сыворотку в рабочем разведении в 0,05 мл, а в периферические ряды - нормальный, положительный (по 1 лунке) и исследуемые антигены в объеме 0,05 мл. При исследовании сывороток крови птиц, в центральный ряд лунок вносят положительный антиген в рабочем разведении в объеме 0,05 мл, а в периферические ряды - нормальный, положительный (по 1 лунке) и исследуемые сыворотки в разведениях в объеме 0,05 мл.
После заполнения лунок, чашки Петри помещают в термостат при температуре 37С. Учет реакции проводят через 24 и 48 часов после постановки реакции. Чашки просматривают на темном фоне в направленном луче света. Реакцию учитывают только при наличии линий преципитации между положительным антигеном и положительной сывороткой в контроле и отсутствии линий преципитации между положительным антигеном и нормальной сывороткой кур, а также положительной сывороткой и нормальным антигеном.
За положительный результат при исследовании патологических материалов на выявление вирусного антигена принимают образование 1-2-х линий преципитации между лунками с исследуемым материалом и положительной сывороткой, а при выявлении противовирусных антител - наличие линий преципитации между лунками с исследуемой сывороткой и положительным антигеном.
Вст?/p>