Сравнительная характеристика некоторых биохимических признаков риса
Курсовой проект - Разное
Другие курсовые по предмету Разное
p>
.Для получения ацетатного буфера с заданной рН, обратились к справочной литературе [Лурье], для того чтобы получить буфер с рН = 4, но СМ = 0,1. Поэтому вначале приготовили 0,1М раствор с рН = 4, а затем разбавили его в два раза, получив при этом необходимый 0,2М буфер с рН = 4.
Для приготовления ацетатного буфера смешивали 18мл раствора 0,2М CH3COONa и 82мл раствора 0,2М СН3СООН:
Необходимую массу соли и объем воды для получения 0,2М раствора CH3COONa рассчитывали по формуле:
См = ? = Cм V
? (CH3COONa) = 0,018л. 0,2М = 0,0036моль
? = m = Mr ?
m (CH3COONa) = 0,0036моль 82г/моль = 0,2956г ? 0,30г
m (Н2О) = 18г - 0,30г = 17,70г или 17,70мл, т. к. ?(Н2О) = 1г/мл
Необходимый объем кислоты и воды для приготовления раствора 0,2 М СН3СООН рассчитывали по формуле:
? (разбавл. кислоты) = 0,2М 0,082л = 0,0164 моль
V (рабочей кислоты, которую имеем в лаборатории) =
См раб. кислоты взяли в справочнике [Лурье], но сначала определили ее плотность, при помощи ареометра.
V (рабочей кислоты) = = 0,00199л = 1,99 мл? 2мл
V (Н2О) = 82мл - 2мл = 80мл
Приготовили 100 мл 0,2 М раствора ацетатного буфера с рН = 4, затем разбавили в два раза и получили 200 мл 0,1М раствора ацетатного буфера с рН = 4
.Для приготовления 25мл сернокислой меди, 0,06г CuSO4 растворили в 10-12мл воды, добавили 0,25г аскорбиновой кислоты и объем довели до метки.
.Для приготовления 1%-ого раствора молибденовокислого аммония в 0,05н. H2S04, 1г чистого молибденовокислого аммония поместили в мерную колбу на 100мл и довели объем до метки 0,05н H2S04
.Для приготовления 0,05н раствора H2S04, 0,140мл H2S04 (? = 1,84) разбавили водой до 100мл
.Для приготовления стандартного раствора, растворили 0,044 гКН2Р04 в 100мл воды, фосфат калия предварительно высушили при 100С, 2 часа.
Ход анализа
,1 мл вытяжки, 5 мл ацетатного буфера, 0,5 мл 1 %-го молибдата аммония и 0,5 мл раствора аскорбиновой кислоты. Общий объем получили 6,1 мл и через 10 мин раствор колориметрировали с красным светофильтром при 660 нм, в кювете с толщиной слоя 5 см относительно бидистиллярованой воды.
Построение калибровочной кривой
Для построения калибровочной кривой брали объемы фосфата от 0,05 до 0,5 мл. Объем ацетатного буфера изменяли от 5,45 до 5 мл в зависимости от взятого объема фосфата. Общий объем смеси (фосфат + реактивы) равен 6,5 см3 (табл. 1). В 1 мл приготовленного рабочего раствора содержится 0,025 мг фосфора. Затем колориметрировали (табл. 2) и строили калибровочный график (рис. 22.). При построении калибровочного графика на оси абсцисс откладывают концентрацию фосфора, а на оси ординат - оптическую плотность растворов.
Таблица 1
Соотношение реактивов в пробирках
Название раствораНомер пробирки12345678910Ацетатный буфер мл5,455,405,355,305,255,205,155,105,055,00Стандартный р-р мл0,050,100,150,200,250,300,350,400,450,50Молибдат аммония мл0,5Аскорбиновая к-та мл0,5Общий объем мл6,5
Таблица 2
Молибденово-синяя шкала окраски
ПоказательНомер пробирки12345678910Стандартный р-р мл0,050,100,150,200,250,300,350,400,450,50С (КН2РО4) 10-3 мг/мл0,1920,3850,5770,7690,9621,1541,3461,5381,7311,932Оптическая плотность Е660нм0,130,150,170,190,210,230,250,270,290,31
Рис. 22. Калибровочная кривая для определения Р2О5
Содержание фосфора (мг/100г) вычисляют по формуле:
;
где С - концентрация фосфора, найденная по калибровочной кривой, мг/мл;
V - общий объем пробы, мл;
V1- объем пробы, взятой для определения фосфора мл;
V2 - конечный объем перед колориметрированием (10 мл);
н - масса навески, г.
.2.2 Определение активности фосфорилазы (КФ 2.4.1.1)
Фосфорилаза катализирует превращение крахмала в глюкозо-1-фосфат в присутствии неорганического фосфата:
Эта реакция обратима. Однако фосфорилаза синтезирует крахмал из глюкозо-1-фосфата только при наличии в реакционной смеси следов крахмала в качестве затравки. Концентрация водородных ионов оказывает влияние на равновесие реакции. Принцип метода основан на определении изменений в содержании неорганического фосфора или крахмала в реакционной смеси под действием фосфорилазы.
Реактивы:
) реактив А (27,15мл 0,1М фосфатного буфера с рН 7,2 + 72,40мл 0,9%-го раствора NaCl + 0,45мл 0,8%-го раствора MgS04);
) 3%-й раствор крахмала;
) 0,1М раствор фтористого натрия;
) 10%-й раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ).
Приготовление реактивов:
.Для получения 0,1М фосфатного буфера с рН 7,2, смешали 17,7мл 0,1М КН2РО4 и 12,3мл 0,1М КОН;
.Для приготовления раствора 0,1М КН2РО4, растворили 0,24г соли в 17,7мл воды;
.Для получения раствора 0,1М КОН растворили 0,07г щелочи в 12,3мл воды;
.Для получения 0,9%-ого раствора NaCl, растворили 0,9г соли водой в мерной колбе на 100мл;
.Для получения 0,8 % - ого раствора MgS04, растворили 0,2 г соли водой в мерной колбе на 25 мл;
.Для приготовления 3%-ого раствора крахмала, 3г крахмала смешивали с 10мл холодной воды, получив насыщенную кашицу, которую влили в 87мл горячей воды, немного прокипятили и охладили;
.Для получения 0,1М раствора NaF, 0,1г соли растворили в мерной колбе на 25мл;
.Для получения 10% ТХУ, растворили 10г кристаллической трихлоруксусной кислоты в мерной колбе на 100мл;
Ход анализа
В опытную пробирку налили 1мл 3%-го раствора крахмала, 2мл реактива А, 1мл 0,1М раствора фтористого натрия и 1мл вытяжки исследуемого объекта, выдержали в течение 2 ч при температуре 37С, перемешали затем в пробирку прилили 5мл 10%-го раствора ТХУ, перемешали и довели содержимое пробирки водой до объема 10мл, затем осадок отделили на центрифуге. Далее определяли фосфор по методу Лоури и Лопесу в модификации Скулачева.
Параллельно проводили контрольное определение, д