Geum.ru
   Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии

Структура lux-оперонов и механизмы регуляции типа quorum sensing у морских бактерий

Автореферат докторской диссертации по биологии

  СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА  
 Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
 

Обсуждение

Анализ биолюминесцентных, биохимических и генетических характеристик психрофильных светящихся бактерий штаммов ВМ1, ВМ2, KChl и KCp рода Aliivibrio (изоляты акваторий Белого, Берингова и Охотского морей) показал, что эти штаммы принадлежат виду A. logei. Отметим, что в акваториях Белого, Охотского и Берингова морей бактерии данного вида изолированы впервые. Фенотипически бактерии вида A. logei очень близки бактериям вида A. fischeri, однако, в отличие от бактерий A. fischeri являются ярко выраженными психрофилами, так как растут при 4 С и не растут при 30 С, что первоначально и послужило выделению этих бактерий в отдельный вид {Bang S.S., et al 1978).аа На близость видов A. logei и A. fischeri указывает также тот факт, что сравнительно часто бактерии этих видов находят в качестве совместных симбионтов в фотофорах кальмаров рода Sepiola (Fidopiastis P.M. et al 1998.). Однако наиболее близкий генетически A. logei является не светящийся, патогенный для промыслового атлантического лосося вид A. salmonicida. На основе сравнения фенотипических характеристик и данных секвенирования (филогенетические исследования проводились по пяти домашним генам, 16S рРНК и luxAB), можно предположить, что эволюционно близкие виды A. logei и A. salmonicida, заняв разные экологические ниши, приобрели заметные различия в фенотипах (в том числе потеря способности к люминесценции A. salmonicida). И наоборот, сходство фенотипических признаков A. logei и A. fischeri возникло в результате существования этих видов в сходных экологических нишах. При этом сохраняется главное отличие (разные температурные оптимумы роста), позволяющее избегать конкуренции бактериям A. logei и A. fischeri.

Основное отличие QS систем психрофильных штаммов по сравнению с мезофильными заключается в наличии двух luxR регуляторных генов. Филогенетический анализ штаммов A. logei показывает, что спейсерная часть между геном luxRl и последовательностью Шайна-Дальгарно luxC гена подвержена высокой скорости перестроек ДНК (гомология между различными штаммами составляет около 75-85 %), в тоже время последовательности обоих генов luxR (как и структурных генов всего оперона) практически идентичны (гомология 98-100%). Тот факт, что дупликация гена luxR подвержена стабилизирующему отбору (как правило, при возникновении дупликаций


36 одна из копий гена быстро теряется или перестаёт экспрессироваться) в /wx-оперонах психрофильных бактерий свидетельствует о необходимости обоих генов для штатной работы QS системы. Предполагается, что наличие двух регуляторных генов в /wx-оперонах психрофильных бактерий может быть связано с необходимостью активировать QS в условиях низких температур.

Исследования шаперонина GroEL/ES и протеазы Lon как модуляторов QS A.fischeri позволяют предположить следующую последовательность событий получения нативной формы белка LuxR. На первой стадии в результате синтеза на рибосоме образуется структура с полностью сформированным С-доменом и слабо упакованным (лрыхлым) N-доменом белка LuxR. На второй стадии N-домен LuxR контактирует с шаперонином GroEL/ES, что обеспечивает последующий процесс фолдинга белка, завершаемый формированием компактной структурой N-домена белка LuxR. Или контактирует с Lon-протеазой, в случае если по какой-то причине не может связаться с GroEL/ES и подвергается протеолизу. Такой белок LuxR еще не способен активировать транскрипцию /wx-генов, так как N-домен частично закрывает С-домен, блокируя формирование комплекса С-домена с /wx-боксом. На третьей стадии N-домен белка LuxR образует комплекс с молекулой АИ, что обеспечивает мономерам белка способность к формированию активного димера (LuxR-AH)2, в котором N-домены обеспечивают контакт мономеров между собой и с ?-субъединиц РНК-полимеразы, а открытые С-домены формируют комплекс с /wx-боксом. Такой комплекс (LuxR-AH)2 уже резистентен к действию Lon протеазы.

Необходимо отметить, что N-домен белка LuxR характеризуется очень низкой константой диссоциации при комплексировании с АИ: пороговая концентрация АИ, при которой активируется экспрессия lux-генов, составляет порядка 10" М (что соответствует примерно 3-4 молекулам АИ в расчете на объем бактериальной клетки).

В настоящей работе показано, дефицит GroEL может быть скомпенсирован высокой концентрацией АИ (10" М против концентрации 10-9М характерной для штамма gro+). Однако концентрации АИ порядка 10" М имеют место лишь при полном открытии системы QS. Следовательно, в природных условиях нормальный процесс формирования нативной формы LuxR происходит двухэтапно: в начале с участием шаперонина groEL, а затем молекулы АИ. Поэтому можно считать роль шаперонинов GroEL/ES и протеазы Lon ключевой в регуляции QS систем первого типа.

Результаты этого раздела позволяют предположить неслучайное возникновение механизма протеолитического контроля и шаперонного ОТК для N-концевого регуляторного домена белка LuxR, который, по-видимому, критичен для оценки целого


37 ряда параметров,а в том числе астрессовогоа состояния клетки.а Позднее зарубежными авторамиа былиа полученыа данныеа оба участии Lonа протеазыа иа шаперонова Hsp60а в регуляции QS у ряда других бактерий (Bertani I et al 2007; Pinto UM and Winans SC 2009). Применение для анализа работы шаперонов в качестве модели бактериальных юцифераз, гомологичных по аминокислотной последовательности, но значительно различающихся по термостабильности, оказалось весьма перспективным и в настоящее время принято во многих лабораториях мира. С помощью этого метода в настоящей работе было показано, что рефолдинг термоинактивированных бактериальных люцифераз, являющихся гетеродимерами, происходит в клетке с участием шаперонов семейства Hsp70 (DnaKJE), HsplOO (ClpA, ClpB) и малых шаперонов sHspP (IbpAB).

Показано также, что термостабильные люциферазы характеризуются сравнительно низким уровнем DnaKJE-зависимого рефолдинга в отличие от термолабильных люцифераз, которые восстанавливают активность после термоинактивации практически до 100%. Можно предположить, что более протяжённое гидрофобное ядро термостабильной люциферазы P. luminescens определяет термодинамическую выгоду от взаимодействия с подобными белками (самоассоциация и формирование агрегатов) по сравнению с взаимодействием с белками - шаперонами DnaKJE. В случае термолабильной люциферазы A. fischeri, по-видимому, денатурированным молекулам выгоднее взаимодействовать с белками -шаперонами, что и обеспечивает высокий уровень рефолдинга даже при длительном выдерживании бактерий при высокой температуре (46С).

Сконструированные входе выполнения диссертационной работы Ых-биосенсоры на основе Ых- генов и специфически регулируемых промоторов применимы для экологического мониторинга, а также для выполнения специальных задач (детекция токсичного компонента ракетного горючего -1,1 -диметилгидразина ( гептила) и его производных, детекция диоксина и его производных в пищевой промышленности, антибиотиков - в молочной промышленности, тяжелых металлов и металлоидов - при экологическом мониторинге и детекции ОВ и др.)

Полученные экспериментально данные по оценке чувствительности сконструированных биосенсоров при действии на бактериальные клетки контрольными химическими препаратами показали, что lux-биосенсоры характеризуются высокой чувствительностью и одновременно специфичностью. Сконструированные lux-биосенсоры по характеру ответа на действие токсических веществ можно разбить на две группы: 1) высоко специфичные биосенсоры, реагирующие на очень ограниченный круг химических веществ. К ним относятся биосенсоры с промоторами PtetR, ParsR, PmerR,


38 PluxR, PkatG, PsoxS. В механизме работы этих биосенсоров задействованы белки-репрессоры или активаторы транскрипции генов, инактивирующиеся при реакции с химическими веществами строго определенной природы, например, только с ионами мышьяка, ртути, антибиотика тетрациклина, перекиси водорода, супероксид-анион-радикала, или активируемые при специфическом комплексировании с химическим соединением, как, например. LuxR-AH-1;

и 2) биосенсоры, реагирующие на более широкий спектр химических веществ, но также с достаточно высокой степенью избирательности. К ним относятся биосенсоры с промоторами PrecA, PrpoE, PgrpE,PcolD, PfabA. Эти биосенсоры лотвечают на действие более широких по химическим свойствам групп токсических веществ. Например, только на агенты, повреждающие ДНК, или только на агенты, повреждающие белки, или только на агенты, повреждающие мембраны клетки.

Обе группы lux-биосенсоров имеют свои области применения. Например, важно дифференцировать на какие компоненты клетки действует токсикант, содержащийся в среде - на генетический аппарат (ДНК) или на белки. В этом случае необходимо использовать для детекции биосенсоры с промоторами PcolD, PrecA, PrpoE, PgrpE. Если же стоит задача - уточнить природу ОВ в среде или наличие тяжелого металла, то необходимо использовать узко специфические биосенсоры с промоторами типа РсорА, ParsR, PmerR.


39 Выводы

  1. Впервые определена структура /wx-оперона у психрофильных светящихся морских бактерий. В отличие от /wx-оперонов мезофильных морских бактерий, содержащих в своём составе одну копию гена /wxR, в /wx-оперонах психрофильных бактерий содержится две копии гена /wxR, причём белки LuxRl и LuxR2 различаются как по аминокслотной последовательности, так и по активности по отношению к регулируемому ими промотору.
  2. Показано, что криптическая люминесценция патогенных морских бактерий Aliivibrio salmonicida (бактерии люминесцируют лишь при добавлении в среду субстрата люциферазы длинноцепочечного альдегида) связана с дефектом в гене luxD, кодирующем одну из субъединиц редуктазы.
  3. Показано, что АТФ-зависимая протеаза Lon участвует в негативной регуляции систем QS у морских бактерий. Доказано, что шаперонин GroEL/ES участвует в сборке нативной формы белка LuxR.
  4. Основную регуляторную функцию в белке LuxR несет N - домен (162 аминокислотных остатка), являющийся мишенью для Lon-протеазы и определяющий контакт полипептида с шаперонином GroEL, необходимым для сборки нативной структуры LuxR.
  5. Впервые для анализа работы шаперонов были использованы в качестве модели бактериальные люциферазы, гомологичные по аминокислотной последовательности, но значительно различающиеся по термостабильности.
  6. Рефолдинг термоинактивированных бактериальных люцифераз происходит в клетке с участием шаперонов семейства Hsp70 (DnaKJE), HsplOO (ClpA, ClpB) и малых шаперонов sHsp (IbpAB).
  7. Термостабильные люциферазы характеризуются сравнительно низким уровнем DnaKJE-зависимого рефолдинга в отличие от термочувствительных люцифераз, которые восстанавливают активность после термоинактивации практически до 100%.
  8. Сконструированы новые формы lux-биосенсоров, отличающиеся по основным параметрам (пороговая чувствительность и амплитуда ответа) от аналогов lux-биосенсоров, полученных зарубежными фирмами. С помощью данных биосенсоров впервые был исследован механизм токсического действия на клетку 1,1-диметилгидразина (компонент ракетного топлива) и наночастиц диоксида титана. Показано, что основная роль в токсическом действии этих агентов связана с образующимися активными формами кислорода (перекись водорода и суперокид-анион).

40 Список публикаций.

  1. ЗавильгельскийГ.Б., Манухов ИВ. "Ouorum sensing", или как бактерии "разговаривают" друг с другом. //Мол. Биол. 2001 Т. 35 №2. С. 268-277.
  2. Г. Б. Завильгельский, В. Ю. Котова, М. М. Мажу ль, И. В. Манухов Роль шаперонов Hsp70 (DnaK-DnaJ-GrpE) и HsplOO (ClpA и ClpB) в рефолдинге и повышенной термостабильности бактериальных люцифераз в клетках Escherichia coli. II Биохимия 2002 67(9):986-92.,
  3. Г. Б. Завильгельский, А. П. Зарубина, И. В. Манухов Определение и сравнительный анализ нуклеотидной последовательности Zwx-оперона Photorhabdus luminescens, штамм ZM1. ERIC - элементы как предполагаемые горячие точки рекомбинации. //Молекулярная биология 2002 36(5):792-804.,
  4. Завильгельский, В. Ю. Котова, И. В. Манухов. Влияние регуляторных белков RcsA и RcsB на экспрессию /wx-опреона Vibrio fischeri в Escherichia coli. II Молекулярная биология 2003 37(4):704-11.

5)а Г.Б. Завильгельский, В. Ю. Котова, М. М. Мажуль, И. В. Манухов. Влияние

белков семейства С1р на DnaK-зависимый рефолдинг бактериальных люцифераз. //

Молекулярная биология 2004 38(3):507-14.

  1. . Manukhov IV, Mamaeva DV, Rastorguev SM, Faleev NG, Morozova EA, Demidkina TV, Zavilgelsky GB. A gene encoding L-methionine gamma-lyase is present in Enterobactenaceae family genomes: identification and characterization of Citrobacter freundii L-methionine gamma-lyase. // J Bacteriol. 2005 187(11):3889-93
  2. И. В. Манухов, В.Ю. Котова, Г.Б. Завильгельский. Роль шаперонов GroEL/GroES и протеазы Lon в регуляции экспрессии /wx-оперона Vibrio fischeri в клетках Escherichia coli. //Молекулярная биология 2006 40(2); 277-83.

8)а Манухов ИВ., Мамаева Д. В., Морозова Е. А., Расторгуев С. М., Фалеев Н. Г.,

Демидкина Т. В., Завильгельский Г. Б. L-метионин-гамма-лиаза. //Биохимия 2006 71(4);

842-851 .Citrobacterfreundii: клонирование гена и кинетические параметры фермента.

9)аа И. В. Манухов, В.Ю. Котова, Г.Б. Завильгельский. Внутриклеточные факторы

регуляции экспрессии /wx-оперона Vibrio fischeri в клетках Escherichia coli. II

Микробиология 2006 75(4): 525-31.

10)аа Zavilgelsky G.B., Kotova V.Yu., and Manukhov I.V. Action of asymmetric 1,1-

dimethylhydrazine on bacterial cells is determined by hydrogen peroxide. // Mutation Research.

2007 634(1-2): 172-6.


41

  1. И. В. Манухов, В. Ю. Котова, Д. Г. Мальдов, А. В. Ильичев, А. П. Бельков, Г. Б. Завильгельский. Индукция окислительного стресса и SOS-ответа в бактериях Escherichia coli растительными экстрактами: роль гидроперекисей и эффект синергизма при совместном действии с цисплатиной. // Микробиология 2008 Т.77, № 5, с. 1-8.
  2. Манухов ИВ., Балабанов В.П., Котова В.Ю., Хрульнова С. А., Мелькина О.Е., Крайнов А. А., Пустовойт К.С, Кречетов П.П., Королёва Т.В., Шатров Т.Я., Чалкин С.Ф., Завильгельский Г. Б. Использование Lux-биосенсоров для детекции НДМГ в почве. // Двойные технологии 2008 44(3): с. 50-56
  3. В.Ю. Котова, И. В. Манухов, О. Е. Мелькина, Г.Б. Завильгельский. Мутация clpA::kan в гене, кодирующем шаперон семейства HsplOO, уменьшает эффективность DnaK-зависимого рефолдинга белков в клетках Escherichia coli. II Молекулярная биология 2008 42(5); 1018-22.
  4. Манухов ИВ., Котова В.Ю., Завильгельский Г. Б. Lux-биосенсоры для детекции SOS-ответа, теплового шока и окислительного стресса. // Биотехнология 2009, №6, С. 16-25.
  5. С.А. Хрульнова, ИВ. Манухов, А. П. Зарубина, Г. Б. Завильгельский. Aliivibrio logei, штамм KChl (изолят Камчатка): биохимические и люминесцентные характеристики, клонирование /wx-оперона. //Микробиология. 2010, №. 79, С 349-355.
  6. О. Е. Мелькина, И. В. Манухов, Г. Б. Завильгельский. Протеолитический контроль экспрессии генов /wx-оперона Vibrio fischeri в клетках Escherichia coli. II Генетика 2010, том 46, № 8, с. 1-6.
  7. О. Е. Мелькина, И. В. Манухов, Г. Б. Завильгельский. С - домен LuxR, активатора транскрипции /wx-оперона Vibrio fischeri, не является мишенью для Lon -протеазы. // Молекулярная биология 2010 т.44 № 3 С. 1-5.
  8. Пуа V. Manukhov, Ol'ga Е. Melkina, Ignatii I. Goryanin, Ancha V. Baranova, and Gennadii B. Zavilgelsky. The N-terminal domain of the Aliivibrio fischeri LuxR is a target of the GroEL chaperonin. // Journal of Bacteriology 2010, Vol. 192, No. 20 p. 549-51.
  9. В.Ю. Котова ИВ. Манухов Г.Б. Завильгельский, Использование специфических индуцируемых Lux-биосенсоров для определения механизма токсичности наночастиц. //Нанотехника 2010, №4(24) С.35-38
  10. Г.Б. Завильгельский, В.Ю. Котова, ИВ. Манухов, Наночастицы диоксида титана (??02) индуцируют в бактериях стрессовые реакции, фиксируемые специфическими lux-биосенсорами. // Российские Нанотехнологии 2011, т 6 №5-6 С. 401-405.

42 21)а Manukhov IV, Khrul'nova SA, Baranova A, Zavilgelsky GB. Comparative analysis of the lux operons in Aliivibrio logei KChl (Kamchatka isolate) ana Aliivibrio salmonicida. //JBacteriol. 2011 193(15):3998-4001.

  СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА  
 Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
     Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии