Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии

Структура lux-оперонов и механизмы регуляции типа quorum sensing у морских бактерий

Автореферат докторской диссертации по биологии

СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА

Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |

 

Итоги исследований шаперонов с помощью бактериальных люцифераз.

Х Применение для анализа работы шаперонов в качестве модели бактериальных

люцифераз, гомологичных по аминокислотной последовательности, но значительно различающихся по термостабильности, оказалось весьма перспективным и в настоящее время принято во многих лабораториях мира.

1. Показано, что рефолдинг термоинактивированных бактериальных люцифераз, являющихся гетеродимерами, происходит в клетке с участием шаперонов семейства Hsp70 (DnaKJE), HsplOO (ClpA, ClpB) и малых шаперонов sHspP (IbpAB).
2. Показано, что термостабильные люциферазы характеризуются сравнительно низким уровнем DnaKJE-зависимого рефолдинга в отличие от термолабильных люцифераз, которые восстанавливают активность после термоинактивации практически до 100%.

Биосенсоры: применение lux-биосенсоров для детекции токсических агентов, антибиотиков, аутоиндукторов и других биологически активных веществ.

Проведённые в процессе выполнения диссератационной работы исследования, (в частности, клонирование набора генов, кодирующих люциферазы, и индуцируемых стрессовых промоторов) позволили сконструировать специфические, высокочувствительные /wx-биосенсоры. Выполнен ряд договоров и контрактов

30 хозяйственного назначения по темам, связанным с экологией, определением механизмов токсического воздействия веществ на бактериальную клетку, тестированием разрабатывающихся медицинских препаратов (доклиника) и др.

Lux-биосенсоры широко используются в работах по генетической инженерии и биотехнологии, а также для мониторинга окружающей среды. Lux-биосенсор - это бактериальная клетка, содержащая гибридную плазмиду, в состав которой встроены два основных элемента: регуляторный участок (промотор и оператор и, при необходимости, ген регулятор) и ген (гены)-репортер (рис. 25). В качестве генов-репортеров используются гены /wxCDABE, кодирующие люциферазу и редуктазу. В качестве регуляторных элементов используются различные индуцируемые промоторы, сформированные в процессе эволюции и специфически реагирующие на наличие в среде определенного вида химического вещества. Данная группа биосенсоров характеризуется как специфичностью, так и высокой чувствительностью, что определяется особенностью взаимодействия белка - рецептора (репрессора или активатора транскрипции) с химическим веществом. Сконструированы новые формы lux-биосенсоров, отличающиеся по основным параметрам (пороговая чувствительность и амплитуда ответа) от аналогов lux-биосенсоров, полученных зарубежными фирмами. В таблице приведены основные характеристики lux-биосенсоров, применяющихся для детекции токсикантов, экологического мониторинга и определения механизмов токсического воздействия на клетку. Пример временной зависимости активации люминесценции биосенсора Е.coli MG1655 pAlkA-lux в ответ на добавление токсиканта (ТУ-метил-Ж'-нитро-ТУ-нитрозогуанидина) приведён на рисунке 25.

Таблица. Основные характеристики lux-биосенсоров

Биосенсор E.coli:	Токсический агент	Промо тор	Амплитуд а ответа	Пороговая концентрация	мин
pArsR-lux	As, Sb	arsR	500	10"uMAs	30
pMerR-lux	Hg,Cd	merR	500	10"10MHg	30
pCopA-lux	Cu,Ag	сорА	20-Си 30-Ag	5xlO"7MCu; 2xlO"7MAg	20 7
pTetR-lux	тетрациклин	tetA	1000	0.5 нг/мл	30
pColD-lux	ДНК -повреждающие агенты: УФ, митомицин С, 4-НХО	cda	1000	10"9M митомицин С	25

31

pAlkA-lux	Алкилирующие агенты: МННГ, MMC, нитрозо-мочевина	аША	300	10"8M МННГ	20
plbpA-lux	этанол, температура,	ibpA	100	0,3% этанол	20
	пентахлорфенол			10 мг/л пентахлорфено л	10 15
pFabA-lux	тритон Х-100, фенол и его производные	fabA	3	0,2 мг/л тритон Х-100	30
pKatG-lux	Н202	katG	100	10"6М Н202	7
pSoxS-lux	супероксид-анион	soxS	100	10"6М паракват	15

NaAsO,

Связан

Рисунок 25. Схема специфического lux-биосенсора, сконструированного с применением репортерных генов luxCDABE, индуцируемого промотора ParsR и регуляторного arsR гена, реагирующего ионы мышьяка. Приведена зависимость интенсивности биолюминесценции биосенсора Е. coli (pArsR-lux) от концентрации ионов мышьяка (NaAs02). Пунктиром обзначена кривая инактивации люминесценции контрольных клеток, в которых гены luxCDABE находятся под контролем конститутивного промотора.

ремя, мин.

Рисунок 26. Клетки Е. coli МС1061 (pAlkA-lux) выращивали до ранней логарифмической фазы, добавляли к аликвотам (по 200 мкл) ТУ-метил-Ж'-нитро-ТУ-нитрозогуанидина до конечных концентраций 5, 1, 0,1,и 0,01 мкг/мл. Измеряли люминесценцию образцов в течение 2 часов. На графике показана зависимость люминесценции образцов от времени инкубации.

С помощью подобных биосенсоров впервые был исследован механизм токсического действия на клетку 1,1 -диметилгидразина (компонент ракетного топлива) (НДМГ) и наночастиц диоксида титана. Показано, что основная роль в токсическом действии этих агентов связана с образующимися активными формами кислорода (перекись водорода и су перокид-анион).

Рисунок 27. Зависимость интенсивности люминесценции клеток биосенсора Е. coli MG1655 pKatG-lux от времени инкубации (А) и от концентрации (В) в среде 1,1 диметилгидразина (НДМГ). () - контроль (о) - + НДМГ 3 мМ (d) - + перекись водорода 0,5 мМ (ж) - + каталаза, + НДМГ 3 мМ

На рисунках 27 и 28 представлены данные, свидетельствующие о том, что основное генотоксическое действие НДМГ на бактериальную клетку связано с образованием активных форм кислорода в процессе восстановления атмосферного кислорода. Добавление каталазы в икубационную среду полностью снимает как окислительный стресс (рис. 27 (А)), так и SOS -ответ бактериальных клеток (рис. 28)

90 120аа 150

Время, [мин]

Рисунок 28. Кинетика индукции (усиления) биолюминесценции биосенсора Е. coli

MG1655 (pRecA-lux) в зависимости от времени инкубации с НДМГ (концентрация НДМГ

= 5 мкМ).

() - контроль

(о) - НДМГ 3 мМ

(d) - перекись водорода 0,5 мМ

(ж) - каталаза, + НДМГ 3 мМ

(?) - митомицин С 10" М

Однако токсическое действие НДМГ на живую клетку не ограничивается воздействием активных форм кислорода, возникающих в процессе окисления НДМГ в аэробных условиях. В процессе окисления возникают промежуточные формы окисленного НДМГ, в том числе, нитрозодиметиламин, который является алкилирующим агентом для ДНК. На рисунке 29 представлены данные по активации промотора PalkA как чистым НДМГ, так и продуктами его окисления, возникающими при обработке перекисью водорода. Показано, что чистый, не окисленный НДМГ, не обладает алкилирующим действием на ДНК. Восстановление атмосферного кислорода НДМГ с образованием перекиси водорода достаточно, чтобы возник SOS-ответ клетки, в первые, часы инкубации в растворе с НДМГ (рис 28). В случае если происходит более глубокое

34 окисление НДМГ в присутствии экзогенно добавленной перекиси водорода, возникают продукты окисления, которые были охарактеризованы как при помощи биосенсоров так и на хроматомасс-спектрометре. Показано, что продукты окисления НДМГ перекисью водорода обладают высокой алкилирующей способностью и вызывают активацию PaikA промотора (рис. 29). Максимальная амплитуда ответа биосенсора наблюдается в случае, когда концентрации НДМГ и перекиси водорода эквимолярны. Перекись водорода не вызывает индукцию PaikA промотора, так как не может являться алкилирующим агентом, и PaikA не индуцируется окислительным стрессом, однако в случае больших концентраций Н2О2 избыток перекиси водорода приводит к гибели клеток, уменьшая наблюдаемую биолюминесценцию.

Рисунок 29. Зависимость люминесценции Е. coli МС1061 (pAlkA-lux) от времени

инкубации в присутствии несимметричного диметилгидразина (НДМГ) и перекиси

водорода.

К клетками, coli МС1061 pAlkA-lux добавляли НДМГ 7,5 мМ и различные концентрации

окислителя - перекиси водорода (20; 10; 7.5; 5; 2.5; 1; 0.5 мМ). Измеряли люминисценцию

образцов в течение 4 часов.

Итоги прикладных исследований диссертационной шаботы.

1. Сконструированы lux-биосенсоры, отличающиеся высокой чувствительностью чувствительность и амплитудой ответа, при этом специфично реагирующие на различные классы токсических и биологически активных веществ.
2. С помощью lux-биосенсоров впервые был исследован механизм токсического действия на клетку 1,1 -диметилгидразина (компонент ракетного топлива) и

35 наночастиц диоксида титана. Показано, что основная роль в токсическом действии этих агентов связана с образующимися активными формами кислорода (перекись водорода и суперокид-анион).

СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА

Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |

     Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии