Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии

Структура lux-оперонов и механизмы регуляции типа quorum sensing у морских бактерий

Автореферат докторской диссертации по биологии

СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА

Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |

 

Низкомолекулярные химические вещества, относящиеся к классу ацильных производных лактона L-

10 гомосерина (N-AHL), свободно диффундируют через клеточные мембраны и обеспечивают условия, при которых клетка способна реагировать на изменение внутриклеточной концентрации этих веществ и соответственно включать или выключать те или иные группы генов. Одним из основных результатов настоящей работы является доказательство, что в сборке нативной формы белка LuxR участвуют шаперонин GroEL/ES и протеазы Lon. Эти белки модуляторы внесены в схему, представленную на рисунке1.

На рис. 2 представлены структуры /wx-оперонов бактерий A. fischeri (AF) (GenBank AF170104), A. logei (AL) - согласно данным секвенирования 11 т.п.н. фрагментов, содержащих /wx-опероны штаммов ВМ1 и KChl (GenBank HQ450520), и A salmonicida (AS) (GenBank AF452135).

Рисунок 2. Структуры /wx-оперонов A.fischeri (AF), A. logei, штаммы Kchl и BM1 (AL), и A. salmonicida (AS)

Сравнение структуры /wx-оперона штаммов BM1 и KChl со структурами lux-оперонов бактерий A. fischeri и A. salmonicida показывает полное сходство структур lux-оперонов A. logei и A. salmonicida и значительные отличия структур этих /wx-оперонов со структурой /wx-оперона A. fischeri. В структуре /wx-оперонов A. logei и A. salmonicida отсутствует ген lux\ перед геном /wxC, но непосредственно за геном luxG расположен фрагмент с генами luxR2 -lux\. Кроме того, спейсер между первым геном /wxRl и промотором Prl значительно превышает таковой у A.fischeri (более 500 н.п. против 200 н.п.). Отметим, что патогенные для лососей бактерии A. salmonicida занимают отличную от A. fischeri и A. logei экологическую нишу и не люминесцируют в природных условиях.

Для изучения QS системы психрофильных бактерий A. logei, были сконструированы гибридные плазмиды, содержащие регуляторные области /wx-оперона штамма KChl: ген luxRl, lux-box и промотор Prl (pMVl) и ген luxR2, lux-бокс и промотор

11 Pr2 (pSV16) (рис. 3), слитые с генами luxCDABE, кодирующими термостабильную люциферазу Photorhabdus luminescens. Для сравнения чувствительности к АИ регуляторных областей психрофильных бактерий A. logei с мезоф ильными использовалась плазмида pVFRl, содержащая регуляторную область /wx-оперона A. fischeri. Для конструирования был использован вектор pDEW201, содержащий lux-кассету luxCDABE P. luminescens, полилинкер для клонирования промотора и четыре терминатора транскрипции для снижения фонового протекания клонированных промоторов.

Рисунок 5. Зависимость активации Рг промоторов lux оперонов A. fischeri и A. logei (luxR2 и luxRl) от концентрации АИ в среде. Ночную культуру клеток Е. coli с плазмидами pVFRl (fischeri), pSV16 (luxR2 - синие ромбики), pSV17 (luxR2 - голубые крестики) и pMVl (luxRl) инокулировали с начальной OD = 0.01 и растили в среде LB с ампициллином (100 мкг/мл) с аэрацией при 28 С до средней логарифмической фазы (OD = 0,4-0,5). Затем инкубировали 30 мин при 42 С и после добавления различных концентраций АИ продолжали инкубацию без перемешивания при 22 С. Через час инкубации измеряли интенсивность биолюминесценции.

Данные рисунков 4 и 5 свидетельствуют о том, что активация основного Prl промотора, с которого транскрибируются структурные гены luxCDABEG A. logei с помощью белка LuxRl, возможна лишь при высоких концентрациях АИ, весьма редко возникающих в природных условиях. При этом активация белком LuxR2 промотора Рг2, с

13 которого считывается luxl ген, кодирующий синтетазу АИ, характеризуется высокой амплитудой ответа на появление АИ в среде, а также способностью к активации, начиная с концентраций АИ 10" М. Для проверки возможности активации промотора Prl белком LuxR2 штамм Е. coli с биосенсорной плазмидой pMVl, содержащей luxRl с основным Prl промотором, был трансформирован совместимой плазмидой pMV2 (на основе ori р15) с геном luxRl под собственным промотором (рис. 6). Оказалось, что промотор Prl активируется как LuxRl так и LuxR2, причём чувствительность к АИ и амплитуда ответа промотора Prl определяется в основном белком LuxR2 (рис. 7).

Низкомолекулярные химические вещества, относящиеся к классу ацильных производных лактона L-

10 гомосерина (N-AHL), свободно диффундируют через клеточные мембраны и обеспечивают условия, при которых клетка способна реагировать на изменение внутриклеточной концентрации этих веществ и соответственно включать или выключать те или иные группы генов. Одним из основных результатов настоящей работы является доказательство, что в сборке нативной формы белка LuxR участвуют шаперонин GroEL/ES и протеазы Lon. Эти белки модуляторы внесены в схему, представленную на рисунке1.

На рис. 2 представлены структуры /wx-оперонов бактерий A. fischeri (AF) (GenBank AF170104), A. logei (AL) - согласно данным секвенирования 11 т.п.н. фрагментов, содержащих /wx-опероны штаммов ВМ1 и KChl (GenBank HQ450520), и A salmonicida (AS) (GenBank AF452135).

Рисунок 2. Структуры /wx-оперонов A.fischeri (AF), A. logei, штаммы Kchl и BM1 (AL), и A. salmonicida (AS)

Сравнение структуры /wx-оперона штаммов BM1 и KChl со структурами lux-оперонов бактерий A. fischeri и A. salmonicida показывает полное сходство структур lux-оперонов A. logei и A. salmonicida и значительные отличия структур этих /wx-оперонов со структурой /wx-оперона A. fischeri. В структуре /wx-оперонов A. logei и A. salmonicida отсутствует ген lux\ перед геном /wxC, но непосредственно за геном luxG расположен фрагмент с генами luxR2 -lux\. Кроме того, спейсер между первым геном /wxRl и промотором Prl значительно превышает таковой у A.fischeri (более 500 н.п. против 200 н.п.). Отметим, что патогенные для лососей бактерии A. salmonicida занимают отличную от A. fischeri и A. logei экологическую нишу и не люминесцируют в природных условиях.

Для изучения QS системы психрофильных бактерий A. logei, были сконструированы гибридные плазмиды, содержащие регуляторные области /wx-оперона штамма KChl: ген luxRl, lux-box и промотор Prl (pMVl) и ген luxR2, lux-бокс и промотор

Рисунок 5. Зависимость активации Рг промоторов lux оперонов A. fischeri и A. logei (luxR2 и luxRl) от концентрации АИ в среде. Ночную культуру клеток Е. coli с плазмидами pVFRl (fischeri), pSV16 (luxR2 - синие ромбики), pSV17 (luxR2 - голубые крестики) и pMVl (luxRl) инокулировали с начальной OD = 0.01 и растили в среде LB с ампициллином (100 мкг/мл) с аэрацией при 28 С до средней логарифмической фазы (OD = 0,4-0,5). Затем инкубировали 30 мин при 42 С и после добавления различных концентраций АИ продолжали инкубацию без перемешивания при 22 С. Через час инкубации измеряли интенсивность биолюминесценции.

Данные рисунков 4 и 5 свидетельствуют о том, что активация основного Prl промотора, с которого транскрибируются структурные гены luxCDABEG A. logei с помощью белка LuxRl, возможна лишь при высоких концентрациях АИ, весьма редко возникающих в природных условиях. При этом активация белком LuxR2 промотора Рг2, с

13 которого считывается luxl ген, кодирующий синтетазу АИ, характеризуется высокой амплитудой ответа на появление АИ в среде, а также способностью к активации, начиная с концентраций АИ 10" М. Для проверки возможности активации промотора Prl белком LuxR2 штамм Е. coli с биосенсорной плазмидой pMVl, содержащей luxRl с основным Prl промотором, был трансформирован совместимой плазмидой pMV2 (на основе ori р15) с геном luxRl под собственным промотором (рис. 6). Оказалось, что промотор Prl активируется как LuxRl так и LuxR2, причём чувствительность к АИ и амплитуда ответа промотора Prl определяется в основном белком LuxR2 (рис. 7).

СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА

Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |

     Авторефераты по всем темам  >>  Авторефераты по биологии