Авторефераты по всем темам >> Авторефераты по биологии

Рекомбинантные цитокины и цитокин-связывающие белки

Автореферат докторской диссертации по биологии

Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |

7.5 Ингибирование белком VARV-CrmB эффектов MuTNF на колониеобразующую активность клеток костного мозга мышеи Balb/c

Использование этой экспериментальной модели обусловлено тем фактом, что хронические воспалительные процессы (в т.ч. ревматоидный артрит) часто сопровождаются формированием анемии, в основе патогенеза которой лежат TNF-опосредованные нарушения пролиферации и усиление апоптоза эритроидных предшественников (Papadaki H. et al., 2002). Количество коммитированных предшественников в КМ мышей BALB/c оценивали в метилцеллюлозной культуре, обогащенной ростовыми факторами в отсутствии и присутствии MuTNF в концентрациях от 2 до 40 нг/мл, VARV-CrmB в концентрациях от 2 до 24 нг/мл, а также в комбинациях 2 нг/мл MuTNF и белка VARV-CrmB в концентрациях от 2 до 12 нг/мл. Количество колоний гемопоэтических предшественников (БОЕ-Э, КОЕ-Э, КОЕ-ГМ) оценивали на 14 день. Во всех используемых концентрациях MuTNF ингибировал рост эритроидных колоний (БОЕ-Э+КОЕ-Э), а в концентрациях 2 нг/мл и 10 нг/мл стимулировал рост гранулоцитарно-макрофагальных колоний (КОЕ-ГМ), как это представлено на рис. 23A. VARV-CrmB в отсутствии MuTNF не оказывал влияния на костномозговое колониеобразование (данные не приведены). Совместное воздействие MuTNF и VARV-CrmB приводило к

восстановлению MuTNF-индуцированного снижения количества эритроидных колоний (БОЕ-Э+КОЕ-Э) и MuTNF-индуцированного повышения численности КОЕ-ГМ, как это показано на рис. 23Б.

А.

Б.

Wа 2D0-

Iаа IKDE-Э+БОЕ-Э

T Iаа ЮЕ-ГМ

Iаа Юа I IKOF.-Д+ KOF.-Д + КОЕ-ГМ

il-а

700-650 600 550-500-450 400 350-300 250 200-150-100 50-0

I lKCE-эаэв-э

Iаа lKМ-ГМ

Рис. 23 А. Влияние MuTNF на колониеобразующую активность клеток КМ мышей BALB/c. 1: контроль, 2-5: 2, 10, 20 и 40 нг/мл TNF, соответственно. БОЕ-Э и КОЕ-Э - ранние и поздние предшественники эритроидных клеток; КОЕ-ГМ - предшественники колоний гранулоцитов и макрофагов. * Достоверное снижение относительно контроля (р < 0.05); ** Достоверное повышение относительно контроля (р < 0.05).

Б. Влияние VARV-CrmB на TNF-индуцированные изменения колониеобразующей активности клеток КМ мышей BALB/c. 1: контроль, 2: 2 нг/мл TNF, 3-5: 2 нг/мл ТЫБ+2нг/мл, 6 нг/мл и 12 нг/мл VARV-CrmB, соответственно. # Достоверное снижение относительно контроля (р < 0.05); ## Достоверное повышение относительно контроля (р < 0.05); * Достоверное повышение относительно 2 нг/мл TNF (р < 0.05)

7.6а Изучениеа биологическиха свойства ортопоксвирусныха TNF-связывающих белков in vivo

Эффектыаа белковаа CrmBаа ваа экспериментальнойаа моделиаа ЛПС-

индуцированного эндотоксического шока ЛПС-индуцированный эндотоксический шок (реакция Шварцмана) является широко используемой экспериментальной моделью септического шока (Lamping N. et al., 1999). При определении дозы ЛПС (L2880 E.coli серотипа 055:В5; Sigma, США), вызывающей гибель экспериментальных животных (самцы SPF мышей линии Balb/c весом 15-20г), варьировали способ приготовления раствора ЛПС, его сенсибилизирующие и разрешающие дозы. Эксперименты проводили в соответствии с Протоколом, утвержденным Биоэтическим комитетом ФБУН

ГН - ВБ Вектор. Окончательная схема экспериментов выглядела

следующим образом: экспериментальным животным внутрибрюшинно вводили сенсибилизирующую и через 16 час разрешающую дозы ЛПС, равные 300 и 350 мкг/мышь, соответственно. В таких условиях смертность животных контрольной группы составила 70-80%. Препараты белков CrmB вводили в дозах 0.2 и 2 мкг/мышь за 30 мин до введения разрешающей дозы ЛПС. Наблюдение за животными продолжалось 72 ч. Патоморфологическая картина изменений внутренних органов экспериментальных животных соответствовала описанной в литературе при развитии экспериментального эндотоксического шока у мышей (Барштейн и др., 1990). Динамику содержания TNF, IL-lЯ и IFNy в сыворотке крови экспериментальных животных при индукции эндотоксического шока изучали методом иммуноферментного анализа, используя коммерческие тест-системы. Уровень IFNy и IL-lЯ после индукции шока во всех исследованных образцах сывороток крови были ниже порога чувствительности используемых тест-систем. Определение концентрации TNF в сыворотках крови животных в тех же условиях выявило, что непосредственно после введения разрешающей дозы ЛПС происходит повышение содержания TNF с последующим его снижением через 3, 6 и 24 часа практически до фонового уровня. Установлено, что максимально достигаемый уровень TNF составляет 500-600 пкг/мл. На рис. 24 приведены результаты учета гибели животных в проведенных экспериментах. Введение животным совместно с БСА рекомбинантных белков CrmB в дозе 2 мг/мышь не вызывает гибели животных. Не удалось обнаружить какого-либо терапевтического действия белков CPXV- и MPXV-CrmB. Введение препаратов VARV-CrmB в дозах 0.2 или 2 мкг достоверно уменьшает смертность экспериментальных животных.




L..........................
		:z~zzhzzzz::

100 ,90

!М

жl 70

к SO

ш 50

1а 40

^30

10 ж

4S время.часы

	100
:<	90
	ЯП


Ш	->\\

	Ц0
1 III	;0
:ж	4П

Ш	30
	20
	10
	0

9н

24аа 48аа 72аа 96

PBS+ CPXV-CrmB или MPXV-CrmB, 2мкг/мышь

LPS+BSA

LPS+CPXV-CrmB (0.2 или 2 мкг/мышь)

LPS+MPXV-CrmB (0.2 или 2 мкг/мышь}

время, часы PBS+ VARV-CrmB, 2 мкг/мышь LPS+PBS

LPS+VARV-CrrriB [2мкг/мышь) LPStVARV-CrnnB С а2мкг/мышь}

А.а Б.

Рис. 24 Выживаемость экспериментальных животных при ЛПС-индуцированном эндотоксическим шоке после введении рекомбинантного белка CPXV-CrmB и MPXV-CrmB (А) и VARV-CrmB (Б). Стандартное отклонение рассчитано с использованием независимого критерия Стьюдента для уровня значимости р<0.05.

Ингибирование белком VARV-CrmB индуцируемую MuTNF подвижности клеток Лангерганса Одна из популяций дендритных клеток кожи - эпидермальные резидентные клетки Лангерганса (КЛ) -образуют плотную сеть, локализованную в базальном и супрабазальном слоях эпидермиса, и составляют 3-5% от популяции эпидермальных клеток (Merad M. et. al., 2008). Цитоплазматические отростки КЛ внедряются между кератиноцитами, образуя непрерывную сеть, что позволяет им постоянно контролировать возможные нарушения гомеостаза внутри эпидермиса. При повреждениях кожи, вторжении патогенов, контакте с аллергенами происходит локальный выброс провоспалительных цитокинов TNF и IL-IЯ, которые индуцируют мобилизацию КЛ в лимфоидную ткань. Известна экспериментальная модель, позволяющая определять интенсивность миграции КЛ в зависимости от применяемого стимула (Вязовая Е.А. и др., 2007). В этой экспериментальной модели изучали способность белка VARV-CrmB ингибировать MuTNF-индуцируемую подвижность КЛ. На дорзальную поверхность ушей животных апплицировали PBS (группа I), MuTNF (250нг;

группа II), VARV-CrmB (500нг; группа III) и последовательно MuTNF и через 30 мин VARV-CrmB (250нг + 500нг, соответственно; группа IV). Результаты подсчета клеток, мигрировавших из кожного лоскута (через 2 часа после аппликации), представлены на рис.25. Нанесение MuTNF на участок кожи мышей линии Balb/c вызывает миграцию КЛ из кожного лоскута, под действием белка VARV-CrmB миграции клеток не происходит, а последовательное нанесение на поверхность кожи MuTNF и белка VARV-CrmB достоверно снижает MuTNF- индуцируемую миграцию клеток.

Uа контроль

25 20 15

Iа II IIIа IV

Рис. 25 Миграция клеток из кожного лоскута дорзальной части уха мышей Balb/c. По оси ординат: количество клеток хЮОО. По оси абцисс: экспериментальные группы животных. I - PBS; II - MhTNF (250 нг); III - VARV-CrmB (500 нг); IV - MnTNF+VARV-CrmB (250 нг+500 нг, соответственно).

Изучение свойств нового класса TNF-антагонистов - поксвирусных TNF-связывающих белков - открывает перспективу фундаментальных исследований, направленных на изучение взаимодействия вирусных иммуномодуляторных белков с иммунной системой теплокровных. Несомненный терапевтический потенциал белка VARV-CrmB позволяет рассматривать его как базовый элемент для разработки нового поколения иммунокорректирующих терапевтических средств.

выводы

Предложен способ эффективной экспрессии генов в составе искусственного полицистронногоа оперона,а ваа котором последовательность SD дистального гена перекрывается с терминирующим ко доном проксимального.
Получены рекомбинантные плазмиды (pIF6/8, pDS381IFN, p381/2IFN, pDS280IF, pDS1623IF, pIF16), обеспечивающие в клетках E.coli SG20050 конститутивный синтез интерферона a-2b человека, составляющий 10-60% от суммарного клеточного белка. Штамм-продуцент рекомбинантного интерферона а-2Ь человека E.coli SG20050/pIF16 депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (коллекционный номер В-5809).
Получены рекомбинантная плазмида p280GM, содержащая синтетическийаа гена гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека, и штамм E.coli SG20050/280GM - продуцент соответствующего цитокина с уровнем синтеза целевого продукта около 15% от суммарного белка клетки. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (коллекционный номер В-6613).
Показано, что продукт экспрессии синтетического гена гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека в клетках E.coliвидоспецифическиаа стимулируетаа дифференцировку гемопоэтических стволовых клеток.
Получены и депонированы в музее Культур клеток микроорганизмов ФБУН ГН - ВБ Вектор рекомбинантные бакуловирусы BTRI67, BTRz96 и BTRgr90, детерминирующие синтез растворимых TNF-связывающих белков вирусов натуральной оспы, оспы обезьян и оспы коров (коллекционные номера VB-01, VB-03 и VB-02).
Показано,а чтоа видоспецифическиеаа аминокислотныеа заменыа ваа TNF-

связывающих белках вирусов натуральной оспы, оспы коров и оспы

обезьян выражаются в различных физико-химических и биологических

свойствах этих белков: -степеньаа ингибированияаа связыванияаа hTNFаа саа собственными поликлональными антителами уменьшается в ряду VARV-CrmB->СРХ V-CrmB^MPXV-CrmB;

-различается эффективность ингибирования цитотоксического действия человеческого, мышиного, кроличьего TNF и LTa человека на клетки мышиных фибробластов линии L929;

-только белок VARV-CrmB оказывает выраженный лечебный эффект на проявления ЛПС-индуцированного эндотоксического шока у мышей линии Ва1Ь/с, достоверно увеличивая процент выживших животных.

7.а Показано, что белок VARV-CrmB, синтезирующийся в клетках

насекомых, обладает олигомерной структурой и гликозилирован.

8.а Рекомбинантный белок VARV-CrmB нейтрализует in vitro:

-цитототоксическоеаа действиеаа hTNFаа н культуреаа клетокаа мышиных

фибробластов линии L929 с эффективностью на 2-3 порядка превышающей аналогичные эффекты растворимых клеточных TNF-рецепторов 1-го и П-го типов и соизмеримой с активностью TNF-нейтрализующего моноклонального антитела MAKI95;

-Mu-TNF-опосредованые эффекты в экспериментальной модели костномозгового колониеобразования мышей Ва1Ь/с, увеличивая количество эритроидных и уменьшая количество гранулоцитарно-макрофагальных колоний до базального уровня.

9.а Рекомбинантный белок VARV-CrmB in vivo нейтрализует MuTNF-

индуцируемую миграцию клеток из кожного лоскута мышей линии

Ва1Ь/с.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в научных журналах:

Гилева И.П., Мизенко Г.А., Серпинский О.И., Амосов А.Д., Кравченко В.В. Усиление экспрессии клонированных генов в результате использования системы искусственного полицистронного оперона // Доклады АН СССР. 1986. Т. 288. № 3. С. 734-737.
Кравченко В.В., Гилева И.П., Шамин В.В., Лихошвай В.А., Куличков В.А., Добрынин В.Н., Филиппов С.А., Чувпило CA., Коробко В.Г. Конструирование и свойства искусственных полицистронов на основе укороченных генов триптофанового оперона E.coli и белка оболочки фагаМЗ //Биоорган, химия. 1987. Т. 13. № 9. С. 1176-1185.
Кравченко В.В., Гилева И.П., Шамин В.В., Лихошвай В.А., Куличков В.А., Добрынин В.Н., Филиппов С.А., Чувпило С.А., Коробко В.Г. Дупликация синтетического гена лейкоцитарного интерферона человека и его экспрессия в составе полицистронной мРНК с сопряженной системой трансляции//Биоорган, химия. 1987. Т. 13. № 9. С. 1186-1193.
Акименко З.А., Зыков CA., Шапров В.В., Офицеров В.И., Гилева И.П., Кравченко В.В. Химически синтезированный ген обеспечивает в E. coli синтез полипептида со свойствами лейкоцитарного интерферона человека альфа-2 // Доклады АН СССР. 1991. Т. 319. С. 1248-1251.
Гилева И.П., Бондарь Т.С, Блинова H.H., Халдояниди С.К., Кравченко В.В., Ястребов СИ., Офицеров В.И., Коробко В.Г. Экспрессия синтетическогоаа генаа гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора в E. coli' // Доклады АН СССР. 1994. Т. 336. С. 254-256.
Гилева И.П., Рязанкин И.А., Максютов З.А., Тотменин A.B., Агеенко В.А., Нестеров А.Е., Щелкунов СН. Сравнительное изучение свойств ортопоксвирусных растворимых рецепторов фактора некроза опухолей // Доклады РАН. 2003. Т. 390. № 5. С. 1-5.

Гилева И.П., Рязанкин И.А., Непомнящих Т.С, Тотменин A.B., Максютов З.А., Лебедев Л.Р., Афиногенова Г.Н., Пустошилова Н.М., Щелкунов С.Н. Экспрессия генов TNF-связывающих белков ортопоксвирусов в клетках насекомых и изучение свойств рекомбинантных белков //Молек. биол. 2005. Т. 39. С. 245-254.
Гилева И.П., Малкова Е.М., Непомнящих Т.С, Виноградов И.В., Лебедев Л.Р., Кочнева Г.В., Гражданцева A.A., Рябчикова Е.И., Щелкунов С.Н. Изучение действия TNF-связывающего белка вируса натуральной оспы на развитие ЛПС-индуцированного эндотоксического шока//Цитокины и воспаление. 2006. Т. 5. С. 44-48.
Gileva I.P., Nepomnyashchkh Т.С, Antonez D.V., Lebedev L.R., Kochneva G.V., Grazhdantseva A.A., Shchelkunov S.N. Properties of the recombinant TNF-binding proteins from variola, monkeypox and cowpox viruses are different//Biochemical and Biophisica Acta. 2006. V. 1764. P. 1710-1718.

lO.CaxHO Л.В., Леплина О.Ю., Тихонова M.A., Распай Ж.М., Гилева И.П., Никонов С.Д., Жданов O.A., Останин A.A., Черных Е.Р. Характеристика дендритных клеток, генерируемых в присутствии интерферона-a, у больных туберкулезом легких // Проблемы туберкулеза и болезней легких. 2007. №3. С. 42-46.

П.Топоркова Л.Б., Орловская H.A., Сенников СВ., Сахно Л.В., Козлова

Ю.Н., Лебедев Л.Р., Гилева И.П. Изучение in vitro биологических

свойстваа рекомбинантногоа гранулоцитарно-макрофагального

колониестимулирующего фактора//Иммунология. 2009. № 4. С. 203-205.

12.Гилева И.П., Непомнящих Т.С, Рязанкин И.А., Щелкунов С.Н. Рекомбинантный TNF-связывающий белок вируса натуральной оспы как потенциальный TNF-антагонист нового поколения // Биохимия. 2009. Т.74. С. 1664-1671.

13. Топоркова Л.Б., Петухова A.A., Гилева И.П., Орловская Л.Б. Рекомбинантный белок вируса натуральной оспы нейтрализует эффекты

фактора некроза опухолей на модели костномозгового гемопоэза мышей Balb/c // Мед. Иммунология. 2010. Т. 12. № 4-5. С. 275-280.

14. Цырендоржиева Д.Д.,а Сенникова СВ., Вязовая Е.А., Гилева И.П.,

Щелкунов С.Н., Рязанкин И.А., Лебедев Л.Р., Топоркова Л.Б., Курилин

В.В., Петухова A.A., Орловская И.А. Влияние рекомбинантного TNF-

связывающего белка вируса натуральной оспы на миграционную и

окислительно-восстановительную функции лейкоцитов крови мышей

при эпикутанной аппликации фактора некроза опухолей // Бюллетень

СО РАМН. 2011. Т. 31. № 3. С. 73-79. Работы, опубликованные в сборниках научных трудов:

Гилева И.П., Кравченко В.В., Шамин В.В. Роль структуры матричных РНК в регуляции биосинтеза белка у прокариот. // Генетическая инженерия, молекулярная биология, селекция промышленных микроорганизмов: Обзорн. информ. М.: ВНИИСЭНТИ. 1990. Вып. I. С. 1-22.
Романов В.П., Андреева И.С, Гилева И.П., Порываев В.Д., Пучкова Л.И., Закабунин АН. Разработка методов повышения стабильности продуцента и способа выделения рекомбинантного альфа-2-интерферона человека // Сборник науч. тр. сотрудников НИКТИ БАВ. Посвящается 25-летию института. Бердск. 1996. С. 55-63.

Патенты:

Гилева И.П., Бондарь Т.С, Коробко В.Г., Кравченко В.В., Сандахчиев Л.С. Рекомбинантная плазмидная ДНК p280GM, кодирующая полипептид со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека, и штамм E.coli SG20050/p280GM - продуцент полипептида со свойствами гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека. Патент РФ 2091488 опубл. 27.09.1997, бюлл. № 27.
Кравченко В.В., Гилева И.П. Сандахчиев Л.С, Петренко В.А., Коробко В.Г., Добрынин ВН. Рекомбинантная плазмидная ДНК pIF16,

кодирующая полипептид со свойствами интерферона-альфа2 человека, и штамм E.coli SG20050/pIF16 - продуцент полипептида со свойствами интерферона-альфа2 человека. Патент РФ № 2054041. опубл. 10.02.1996, бюлл. № 4.

Пикалова М.И., Наумова Н.В., Доманова З.М., Хайбулина И.И., Гилева И.П., Колокольцов A.A. Способ промышленного получения рекомбинантного GM-CSF человека. Патент РФ 2144083, опубликован 10.01.2000, бюлл. №1.
Гилева И.П., Щелкунов С.Н., Рязанкин И.А., Максютов З.А., Тотьменин A.B., Нестеров А.Е., Агеенко В. А. Рекомбинантная плазмидная ДНК pFastBac-G2R, содержащая фрагмент генома вируса натуральной оспы, кодирующий белок-аналог рецептора ФНО, и штамм бакуловируса BTRI67, продуцирующий растворимый рецептор ФНО вируса натуральной оспы. Патент РФ № 2241754, опубл. 10.12.2004, бюлл. № 34.

СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА

Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |

Авторефераты по всем темам >> Авторефераты по биологии

Blog

Рекомбинантные цитокины и цитокин-связывающие белки