Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии
Рекомбинантные цитокины и цитокин-связывающие белки
Автореферат докторской диссертации по биологии
|
Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТАГИЛЕВА Ирина Павловна
РЕКОМБИНАНТНЫЕ ЦИТОКИНЫ И ЦИТОКИН-СВЯЗЫВАЮЩИЕ
БЕЛКИ
03.01.03 - молекулярная биология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Кольцове - 2011
Работаа выполненаа ва Федеральнома бюджетнома учрежденииа науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии Вектор
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор
Щелкунов Сергей Николаевич
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
доктор биологических наук, профессор
доктор биологических наук, профессор
Загребельный Станислав Николаевич
Кратасюк Валентина Александровна
Меркулова Татьяна Ивановна
Ведущая организация: ФГУП Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов, г. Санкт-Петербург.
Защита состоится л11 ноября 2011 года в 9-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.020.01 при ФБУН ГН - ВБ Вектор по адресу: 630559, р.п. Кольцово, Новосибирского района, Новосибирской области, тел.: (8-383)336-74-28.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФБУН ГН - ВБ Вектор.
Автореферат разослан
2011г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор
Г.П. Трошкова
2
Актуальность проблемы. Гормоны и цитокины обеспечивают
согласованность действия иммунной, эндокринной и нервной систем
человека в нормальных условиях и в ответ на патологические
воздействия. Недостаток гормонов и цитокинов является причиной
многих заболеваний человека (например, диабет при недостатке
инсулина или нарушение гемопоэза при недостатке гемопоэтических
факторов), коррекция которых возможна соответствующими
препаратамиаа экзогенногоаа происхождения.аа Антивирусная,
иммуномодулирующая и антипролиферативная активность цитокинов -интерферонов, фактора некроза опухолей (TNF), факторов кроветворения - делает перспективными их использование в качестве лекарственных средств. Выделение биологически активных веществ (БАВ) белковой природы из природных источников (донорского материала или тканей животных) малоэффективно из-за низких концентраций целевых продуктов или невозможна из-за иммунологической несовместимости. С другой стороны, гиперпродукция цитокинов лежит в основе патогенеза многих тяжелых заболеваний человека (в случае гиперпродукции TNF - ревматоидного артрита, менингита, септического шока, кахексии и др.).
Фундаментальные достижения молекулярной биологии, молекулярной генетики и энзимологии легли в основу возникновения в 70-х гг. прошлого века генетической инженерии или технологии создания рекомбинантных молекул. Суть этой технологии состоит в соединении in vitro фрагментов ДНК из различных источников и последующем введении лискусственной ДНК в живую клетку, где она способна реплицироваться, а кодируемая ею информация экспрессироваться. Наиболее наглядным примером успеха такой методологииаа являетсяаа созданиеаа новыхаа эффективныхаа лекарственных
3
средств на основе БАВ белковой природы - рекомбинантных гормонов и цитокинов.
К моменту начала работ по теме диссертации было показано, что экспрессия в клетках Escherichia coli генов цитокинов - интерферона ос-2 (Nagata et al, 1980; Goeddel D.V. et. al, 1981) или GM-CSF (Burgess A.W. et. al., 1987) позволяет выделить из бактериальных клеток биологически активные рекомбинантные белки. Сотрудниками ГН - ВБ Вектор (р.п. Кольцово, Новосибирская область) и Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина (г. Москва) методом прямого химического синтеза был получен и клонирован в бактериальной плазмиде (pLelFlac) синтетический ген ifn ?-2 человека (Колосов М.Н. и др., 1984). Необходимым продолжением этих работ является разработка стратегии создания высокопродуктивных штаммов E. coli, обеспечивающих синтез таких важнейших для медицины БАВ, какими являются интерферон и GM-CSF.
В работах ряда исследователей (Щелкунов С.Н., 1995; Alcami А., 2003; Lukas A., McFadden G., 2004) высказаны предположения о возможности использования вирусных иммуномодуляторных белков для антицитокиновой терапии. Получение таких белков в биологически активной форме возможно в ряде случаев только в эукариотических клетках. Удобной системой для решения этой задачи является бакуловирусная система экспрессии.
Настоящая диссертационная работа посвящена конструированию штаммов-продуцентов интерферона а-2Ь и GM-CSF человека на основе бактерии E. coli, а также рекомбинантных бакуловирусов, содержащих в своем геноме гены ортопоксвирусных TNF-антагонистов, и изучению свойств рекомбинантных белков, выделенных из бактериальных клеток и инфицированных клеток насекомых.
4
Цели и задачи исследования. Целью настоящего исследования
являетсяаа получениеаа бактериальныха штаммов-продуцентов
рекомбинантных цитокинов - интерферона а-2Ь человека (hIFNa-2b), гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека (hGM-CSF) и эукариотических продуцентов TNF-связывающих белков вирусов натуральной оспы, оспы коров и оспы обезьян (VARV-CrmB, CPXV-CrmB, MPXV-CrmB), а также изучение физико-химических и биологических свойств этих рекомбинантных белков.
Дляа выполненияа поставленнойа целиа необходимоаа былоа решить следующие задачи:
-сконструировать рекомбинантные плазмиды, обеспечивающие высокий уровень экспрессии целевых генов в бактериальных клетках
E. coli;
-изолировать из вирусных геномов гены TNF-связывающих белков вирусов натуральной оспы, оспы коров и оспы обезьян и получить рекомбинантные бакуловирусы, экспрессирующие гены вирусных TNF-связывающих белков в клетках насекомых;
-выделить из клеток штаммов-продуцентов и изучить физико-химические и биологические свойства полученных рекомбинантных белков (hIFNa-2b, hGM-CSF, VARV-CrmB, CPXV-CrmB и MPXV-CrmB);
-оценить терапевтический потенциал рекомбинантных белков hGM-CSF и VARV-CrmB.
Научная новизна и практическая значимость результатов исследования. Впервые получены рекомбинантные бакуловирусы BTRI67 и BTRz96, детерминирующие в клетках насекомых линии S/21 синтез TNF-связывающих белков вирусов натуральной оспы и оспы обезьян (белков VARV- иаа MPXV-CrmB), иаа впервыеаа проведено
5
сравнительное изучение свойств белков VARV-CrmB, CPXV-CrmB и MPXV-CrmB in vitro. Впервые оценен TNF-нейтрализующий потенциал белка VARV-CrmB относительно некоторых TNF -антагонистов (клеточных TNF-рецепторов, поликлональных антител, TNF-нейтрализующего моноклонального антитела МАК 195, коммерческого препарата Ремикейд) на клетках мышиных фибробластов линии L929. Впервые показана TNF-нейтрализующая активность белка VARV-CrmB in vivo: увеличение количества выживших животных в экспериментальной модели эндотоксического шока и снижение MuTNF-индуцированной подвижности дендритных клеток кожи мышей линии Balb/c. Впервые показана нейтрализация белком VARV-CrmB эффектов MuTNF на модели костномозгового гемопоэза мышей Balb/c.
Сконструированы оригинальные рекомбинантные ДНК, обеспечивающие эффективный синтез в клетках E.coli продуктов экспрессии синтетических генов z/wa-2b и gm-csf человека. Получен и депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов высокоэффективный штамм E.coli SG20050/pIF16 (В-5809) - продуцент рекомбинантного интерферона а-2Ь человека с выходом целевого продукта 3-4 x 10 МЕ/мл/10 кл. На основе этого штамма в ГН - ВБ Вектор разработана технология получения субстанции интерферона а-2Ь и его лекарственных форм. Получен и депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов штамм E.coli SG20050/p280GM (В-6613) - первый отечественный продуцент рекомбинантного GM-CSF человека, обеспечивающий выход целевого продукта в количестве 20-50 мг/л клеточной суспензии. Показано, что продукт экспрессии синтетического гена gm-csf в клетках E.coli видоспецифически стимулирует гранулоцитарно-макрофагальную дифференцировку гемопоэтических стволовых клеток и дендритных клеток. Получен штамм-продуцент и
6
препарат рекомбинантного MuTNF, что позволило использовать этот рекомбинантный белок в экспериментальных моделях при изучении терапевтического потенциала поксвирусных TNF-антагонистов.
Апробация работы. Материалы исследований по теме диссертации были представлены на российских и международных конференциях: Международный симпозиум Регуляция трансляции, Рига (1989); Ш-я Всесоюзная конференция Макромолекулы и клетки, Москва, Россия (1989), 2nd International conference "AIDS, Cancer and Human Retro viruses, St. Petersburg, Russia (1992); XI Poxvirus and Iridivirus Meeting, Toledo, Spain (1996); 2nd Russian Principal Investigator Conference, Holland (2001); Международная школа - конференция Цитокины. Воспаление. Иммунитет, Санкт-Петербург, Россия (2002); 1st International Congress BIOTECHNOLOGY- state of the art&prospects of development, Moscow, Russia (2002); Workshops "Review of Cooperative Biodefense Research Projects, Serpukhov, Russia (2002), St. Petersburg, Russia (2003); International conference "Chemical and biological problems of proteomics", Novosibirsk, Russia (2004); CBR annual review conference, St. Petersburg, Russia (2004); 12th International Congress of Immunology, Montreal, Canada, (2004); XVth International Poxviral and Iridoviral Symposia, Oxford, UK (2004); Всероссийский научный симпозиум с международным участием Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет, Новосибирск, Россия, (2005); 30th FEBS Congress - 9th IUBMB Conference, Budapest, Hungary (2006); Научно-практическая конференция Сепсис: проблемы диагностики, терапии и профилактики, Харкв, Украни, (2006); 17 International Poxvirus and Iridoviras Conference, Grainau, Germany, (2008); XIV International congress of virology, Istanbul, Turkey (2008); Всеросийская научно-практическая конференция Современные представления об иммунокоррекции, Пенза, Россия, (2008); 18-я Международная конференция СПИД, рак и общественное здоровье,
7
Санкт-Петербург, Россия (2009); Всероссийская научная конференция Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии, Новосибирск, Россия (2010).
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из разделов введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список работ, опубликованных по теме диссертации, и библиографический список. Работа изложена на 312 страницах машинописного текста и включает 126 рисунков и 50 таблиц. Библиографический список содержит 643 источника.
Положения, выносимые на защиту:
1. Экспрессия генов в составе искусственных полицистронных
оперонов с сопряженной трансляцией позволила создать бактериальные
суперпродуценты рекомбинантных белков:
-интерферона а-2Ь человека с продуктивностью около 60% от суммарного клеточного белка;
-гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора человека с продуктивностью 15% от суммарного клеточного белка;
-фактора некроза опухолей мыши с продуктивностью 15-20% от суммарного клеточного белка.
2. Гены сгтВ вирусов натуральной оспы, оспы коров и оспы обезьян в
составе генома рекомбинантных бакуловирусов детерминируют синтез в
клетках насекомых белков, ингибирующих цитотоксическое действие
TNF на клетках мышиных фибробластов дозозависимым образом.
3. Видоспецифическиеаа отличияаа в аминокислотных
последовательностях белков VARV-CrmB, CPXV- CrmB и MPXV-CrmB
обуславливаютаа различияаа их физико-химическихаа и биологических
свойств.
8
4. Белок VARV-CrmB обладает TNF-нейтрализующей активностью in
vivo.
|
Страницы: | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
Авторефераты по всем темам >>
Авторефераты по биологии