«Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
| Вид материала | Автореферат |
СодержаниеРезультаты исследования и их обсуждение |
- «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению, 568.86kb.
- «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению, 975.58kb.
- «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению, 545.1kb.
- Заболеваниях легких, 783.83kb.
- Кубанский государственный медицинский университет федерального агентства по здравоохранению, 821.27kb.
- «Казанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению, 863.64kb.
- Г. Томск, Московский тракт, 2 e-mail: fpk@ssmu net, 912.48kb.
- «Саратовский государственный медицинский университет имени В. И. Разумовского Федерального, 378.09kb.
- Гепатопротекторные свойства флавоноидов (фармакодинамика и перспективы клинического, 671.3kb.
- «Рязанский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова Федерального, 241.22kb.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы SPSS 12. Для определения характера распределения полученных данных использовали критерий нормальности Шапиро-Вилка. Так как сформированные выборки не подчинялись нормальному закону распределения, то использовали непараметрические статистические критерии. Для определения достоверности различий при сравнении трех выборок и более применяли непараметрический аналог дисперсионного анализа – критерий Крускала-Уоллиса. Для множественных сравнений двух независимых выборок использовали критерий Данна. Для повторных измерений применяли критерий Фридмана. Для множественных сравнений двух зависимых выборок применяли критерий Даннета. Зависимости между переменными вычисляли с помощью коэффициента корреляции Спирмена R. Результаты представляли в виде выборочных средних (М), а также в виде медианы, верхнего (75%-го) и нижнего (25%-го) квартилей (Ме (Q1-Q2)). Для выявления значимых показателей (р<0,005) в запуске программы программируемой клеточной гибели у больных туберкулезом легких был применен ковариационный анализ, где зависимой переменной являлся спонтанный апоптоз лимфоцитов и моноцитов крови.
^
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Туберкулез развивается и протекает наиболее тяжело при нарушении адекватного клеточного иммунного ответа, в первую очередь со стороны макрофагов и лимфоцитов [Сахарова И.Я. и соавт., 2003]. Исследования показателей клеточного иммунитета выявили, что течение туберкулезной инфекции ассоциировано с развитием синдрома вторичного иммунодефицита [Салина Т.Ю., Морозова Т.И., 2003; Сахно Л.В. и соавт., 2004; Яушев М.Ф. и соавт., 2004; Комогорова Е.Э. и соавт., 2005]. Наличие иммунодепрессии обусловливает нарастание частоты быстропрогрессирующих форм туберкулеза.
Проведенные нами исследования показали, что у больных туберкулезом легких (ТЛ) до начала химиотерапии имеются достоверные нарушения количественных показателей белой крови по сравнению с соответствующими значениями у здоровых доноров, проявляющиеся увеличением ОКЛ (исключение составили пациенты с казеозной пневмонией и инфильтративной формой лекарственно-чувствительного ТЛ), лимфоцитопенией и моноцитозом.
Основными механизмами, способствующими формированию лейкоцитоза, являются ускоренный выход лейкоцитов из костного мозга в кровь, стимуляция костномозгового кроветворения, выход клеток в циркуляцию из маргинального пула [Дыгай А.М., Клименко Н.А., 1992; Ляшенко В.А., 1995; Фрейдлин И.С., 1995; Гольдберг Е.Д. и соавт., 1997; Кашкин К.П., 1998]. Выявленная нами при ТЛ лимфоцитопения могла быть связана с истощением пула ранних и гибелью циркулирующих лимфоцитарных клеток [Черных Е.Р. и соавт., 2002; Сахно Л.В. и соавт., 2004; Яушев М.Ф. и соавт., 2004; Пичугин А.В., 2005], в том числе в связи с прямым действием туберкулезных токсинов [Чернов А.П., и соавт., 1998; Мишин В.Ю. и соавт., 2004]. Свой вклад в развитие лимфоцитопении, вероятно, может вносить дисбаланс со стороны эндокринной системы [Баласанянц Г.С. и соавт., 2000; Мишин В.Ю., 2004].
Большинство заболеваний органов дыхания сопровождаются общими клиническими симптомами, среди которых преобладают синдром интоксикации и бронхолегочные нарушения. При этом оценка специфичности изменений, характерных для туберкулезного процесса, является необходимым условием дифференцированного подхода к углубленному изучению данной патологии, разработке прогностических ее критериев и лечебно-реабилитационных программ. В результате при сравнении гематологических параметров у больных ТЛ и хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ) было установлено, что моноцитоз и лимфоцитопения характеризуют развитие туберкулезной инфекции, но отсутствуют при неспецифическом воспалении легких.
Лимфоциты и циркулирующие моноциты являются одними из главных эффекторов противотуберкулезного иммунитета [Маянский А.Н., 2001; Каминская Г.О. и соавт., 2006]. Их численность в крови зависит от многих факторов, в том числе от активности апоптоза. Повышенная готовность лейкоцитов к апоптозу в настоящее время рассматривается в качестве одного из ключевых факторов подавления иммунного ответа не только при туберкулезе, но и при других инфекциях бактериальной и иной природы [Уманский Ю.А., 1996]. В связи с этим, важным представлялось провести комплексную оценку апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови при ТЛ.
Проведенные исследования показали, что при разных формах ТЛ и у больных ХОБЛ отмечается сходная динамика изменений активности апоптоза мононуклеарных лейкоцитов. Так, у пациентов с ТЛ до начала лечения было выявлено увеличение количества аnnexin V-положительных лимфоцитов и моноцитов относительно соответствующих параметров у здоровых доноров и больных с обострением ХОБЛ (табл. 1). Кроме этого, было обнаружено, что содержание предуготовленных к апоптозу CD95+-лимфоцитов при ТЛ превышает аналогичные значения у здоровых доноров и при ХОБЛ.
При оценке действия перекиси водорода, как неспецифического индуктора апоптотической гибели клеток, было установлено, что у больных ТЛ и ХОБЛ она опосредовала более выраженное, нежели у здоровых доноров, увеличение числа аnnexin V+ лимфоцитов и моноцитов in vitro по сравнению с уровнем спонтанной гибели клеток, не обработанных H2O2, что служит дополнительным свидетельством повышенной предрасположенности мононуклеарных лейкоцитов к апоптозу. Показано, что основной тип повреждений, который индуцирует перекись водорода – однонитевые разрывы. В свою очередь, возникающие повреждения увеличивают экспрессию белка р53, что приводит к активации проапоптотических белков (Bax, Bcl-xS, Bfl1), репрессии антиапоптотических факторов (Bcl-2, Bcl-xL) и апоптозу [Жукова О.Б. и соавт., 2006].
Вместе с этим, среди ученых до сих пор нет единого мнения о механизмах индукции апоптоза при ТЛ. Неизвестно насколько они специфичны для данной патологии. Учитывая вышеизложенное, нами было проведено сравнительное исследование, позволяющее выявить наиболее значимые показатели в запуске программы клеточной гибели у больных ТЛ и ХОБЛ. Для решения поставленной задачи был применен ковариационный анализ, где зависимой переменной являлся уровень спонтанного апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови.
Предполагается, что чрезмерная экспрессия Fas-антигена является следствием дисбаланса активационных сигналов, обусловливающего включение программы гибели клеток при их стимуляции [Салина Т.Б., Худзик Л.Б., 2001]. В частности, Т. Hertoghe et al. [2000], А. Soruri et al. [2002] показали увеличение числа CD95+-Т-лимфоцитов у больных ТЛ. Этот феномен был зафиксирован также и в других научных публикациях [Бойчук С.В. и соавт., 2003; Салина Т.Ю., Морозова Т.И., 2003; Яушев М.Ф. и соавт., 2004; Пичугин А.В., 2005]. Вместе с тем, некоторыми исследователями было продемонстрировано, что механизм ассоциированного с ТЛ апоптоза опосредован подавлением bcl-2 [Klinger K. et al., 1997]. В последние годы появились данные о совместной роли CD95 и bcl-2-репрессии в индукции апоптоза [Hirsch C.S. et al., 2005; Mustafa T., 2007, 2008]. Роль CD95+ в запуске апоптоза подтверждается также результатами нашего исследования. Так, согласно данным ковариационного анализа, у больных с инфильтративным и диссеминированным лекарственно-чувствительным ТЛ гиперэкспрессия СD95+ на лимфоцитах явилась значимым фактором, инициирующим их апоптотическую гибель (табл. 2).
Таблица 1
Уровень апоптотических мононуклеаров в периферической крови у здоровых доноров, больных хронической обструктивной болезнью (ХОБЛ) и туберкулезом легких до начала лечения (М)
| Группы обследованных лиц | Уровень annexin V+ клеток (%) | ||||
| Лимфоциты | Р | Моноциты | Р | ||
| Здоровые доноры | 17,33 | - | 13,78 | - | |
| Больные ХОБЛ | 23,20 | p1=0,0070 | 19,80 | p1=0,0014 | |
| Больные ЛЧ ТЛ | Инфильтративная форма | 34,78 | p1=0,0003 p2=0,0003 | 29,67 | p1=0,0003 p2=0,0003 |
| Диссеминированная форма | 27,33 | p1=0,0004 p3=0,0054 | 29,89 | p1=0,0003 p2=0,0006 | |
| Фиброзно-кавернозная форма | 38,00 | p1=0,0003 p2=0,0002 p4=0,0010 | 32,44 | p1=0,0003 p2=0,0002 | |
| Казеозная пневмония | 25,50 | p1=0,0054 p3=0,0087 p5=0,0055 | 27,00 | p1=0,0054 p2=0,0133 | |
| Больные ЛУ ТЛ | Инфильтративная форма | 38,44 | p1=0,0003 p2=0,0002 | 35,89 | p1=0,0003 p2=0,0006 p6=0,0118 |
| Диссеминированная форма | 29,44 | p1=0,0003 p2=0,0127 p3=0,0023 | 32,44 | p1=0,0003 p2=0,0002 | |
| Фиброзно-кавернозная форма | 33,11 | p1=0,0003 p2=0,0005 p3=0,0104 p6=0,0118 | 32,44 | p1=0,0003 p2=0,0002 |
Примечание: ЛЧ ТЛ – лекарственно-чувствительный туберкулез легких; ЛУ ТЛ – лекарственно-устойчивый туберкулез легких; p1 - уровень статистической значимости различий по сравнению с показателями у здоровых доноров; p2 – по сравнению с аналогичными показателями у больных ХОБЛ; p3 – по сравнению с показателями при инфильтративной форме; p4 – по сравнению с показателями при диссеминированной форме; p5 – по сравнению с показателями при фиброзно-кавернозной форме; p6 – по сравнению с показателями у больных лекарственно-чувствительным ТЛ (для каждой формы и этапа исследования).
Таблица 2
Факторы, оказывающее влияние на апоптоз лимфоцитов
у больных туберкулезом легких до начала терапии
| Форма туберкулеза | Показатель | Достоверность | |
| Больные ЛЧ ТЛ | Инфильтративная форма | Число CD95+-лимфоцитов | р<0,00001 |
| Число лимфоцитов с изменением количества хромосом | р<0,00001 | ||
| Число хроматидных разрывов в лимфоцитах | р<0,00001 | ||
| Число хромосомных обменов в лимфоцитах | р<0,00001 | ||
| ИС ДНК-репарации лимфоцитов | р<0,00001 | ||
| Содержание ТБК-а в лимфоцитах | р<0,00001 | ||
| Уровень меди в лимфоцитах | р<0,00001 | ||
| Диссеминированная форма | Число CD95+-лимфоцитов | р<0,00001 | |
| Уровень марганца в лимфоцитах | р<0,00001 | ||
| Уровень натрия в лимфоцитах | р<0,00001 | ||
| Фиброзно-кавернозная форма | Уровень натрия в лимфоцитах | р<0,00001 | |
| Уровень цинка в лимфоцитах | р<0,00001 | ||
| Содержание СФМ в мембране мононуклеаров | р<0,00001 | ||
| Содержание ФС в мембране мононуклеаров | р<0,00001 | ||
| Казеозная пневмония | - | - | |
| Больные ЛУ ТЛ | Инфильтративная форма | ХС/ФЛ в мембране мононуклеаров крови | р<0,00001 |
| Уровень железа в лимфоцитах | р=0,00001 | ||
| Уровень натрия в лимфоцитах | р=0,00002 | ||
| Уровень меди в лимфоцитах | р=0,00004 | ||
| Диссеминированная форма | Содержания СФМ в мембране мононуклеаров | р<0,00001 | |
| Содержание ФИ в мембране мононуклеаров | р<0,00001 | ||
| Уровень меди в плазме | р<0,00001 | ||
| Уровень магния в плазме | р<0,00001 | ||
| Фиброзно-кавернозная форма | Микровязкость мембраны лимфоцитов | р=0,00003 | |
| Уровень марганца в плазме | р<0,00001 |
Здесь и далее: ЛЧ ТЛ – лекарственно-чувствительный туберкулез легких, ЛУ ТЛ – лекарственно-устойчивый туберкулез легких; ИС – индекс стимуляции, ТБК-а – ТБК-активные продукты, ДК – диеновые конъюгаты, СОД – супероксиддисмутаза, СФМ – сфингомиелин, ФИ – фосфатидилинозитол, ФС – фосфатидилсерин, ЛФЛ – лизофосфолипиды.
Таким образом, течение ТЛ характеризуется увеличением содержания аnnexin V- и CD95-положительных лимфоцитов в крови, что имеет место при всех вариантах заболевания и, вероятно, служит одним из факторов лимфоцитопении. Однако, несмотря на высокий уровень апоптоза моноцитов крови, при ТЛ, как показали полученные результаты, имеет место моноцитоз, что, вероятно, объясняется включением перераспределительного и продуктивного механизмов компенсации с замещением погибших моноцитов не только зрелыми (резервными), но и молодыми, функционально неполноценными формами клеток. При этом повышение содержания аnnexin V-положительных мононуклеаров и CD95+-лимфоцитов у пациентов с обострением ХОБЛ, аналогичное таковому при ТЛ, указывает на типовой характер нарушений апоптоза.
Одной из причин нерепарируемых повреждений ДНК является патология ДНК-восстановительных систем, что в итоге приводит клетку к апоптозу. В связи с этим было проведено исследование активности ДНК-репарации в мононуклеарных лейкоцитах и хромосомный анализ лимфоцитов периферической крови у больных ТЛ.
У больных с инфильтративным и фиброзно-кавернозным лекарственно-чувствительным (ЛЧ) и лекарственно-устойчивым (ЛУ) ТЛ до начала терапии выявлялось достоверное снижение индекса стимуляции (ИС) ДНК-репарации в лимфоцитах относительно аналогичных показателей у здоровых доноров и больных ХОБЛ. В то же время у пациентов с диссеминированной формой ТЛ, казеозной пневмонией (КП) и ХОБЛ данный показатель не отклонялся от нормы.
Эксцизионная репарация ДНК, как известно, обеспечивает защиту геномной ДНК от повреждений генотоксическими факторами [Василенко Н.Л., Невинский Г.А., 2003]. Инфильтративный туберкулез не возникает в интактных зонах легочной ткани, а развивается, как правило, в тех участках легких, которые способны ответить бурной гиперергической воспалительной реакцией на возбудитель. Центральным звеном иммунопатогенеза инфильтративного туберкулеза легких является длительная циркуляция в организме сенсибилизированных к микобактериальным антигенам Т-лимфоцитов [Хоменко А.Г., 1998]. Фиброзно-кавернозный ТЛ – наиболее неблагоприятная, прогрессирующая форма туберкулезной инфекции. Столь продолжительный контакт лимфоцитов с инфектогеном при инфильтративной форме и усугубляющаяся тяжесть процесса при фиброзно-кавернозном варианте ТЛ может служить, на наш взгляд, фактором «истощения» резервных ресурсов системы восстановления ДНК. При диссеминированном туберкулезе легких и КП патогенетическая роль лимфоцитов реализуется на более поздней стадии развития заболевания, в связи с чем клетки в меньшей степени подвергаются инфекционному повреждению [Норейко Б.В., 2003; Мишин В.Ю., 2004].
При анализе полученных данных обращало на себя внимание то, что снижение активности ДНК-репарации в лимфоцитах выявлялось при тех формах ТЛ, при которых регистрировалась значительная активация апоптоза и, напротив, нормальная величина ИС ДНК-репаративных процессов обнаруживалась при тех вариантах ТЛ, при которых увеличение числа апоптотических лимфоцитов было минимальным. Наиболее ярким примером служит КП: при этой форме ТЛ индекс стимуляции репарации ДНК не отличался от нормальных значений, в то время как уровень annexin V-положительных лимфоцитов был наиболее низким. Данный факт подтверждает связь программированной клеточной гибели клеток с состоянием ДНК-репаративных процессов при ТЛ.
При анализе состояния ДНК-восстановительных процессов в моноцитах периферической крови только у больных с фиброзно-кавернозным ЛЧ ТЛ регистрировалось снижение ИС относительно его значений у здоровых пациентов и больных ХОБЛ, в то время как в других группах исследования (за исключением больных с инфильтративным ЛЧ ТЛ) он был выше нормы. У больных ХОБЛ изменений ИС ДНК-репарации моноцитов не регистрировалось.
Общеизвестно, что продукт тканевой трансформации моноцитов – макрофаги формируют «первую линию защиты» в отношении микобактерий туберкулеза (МБТ), проникших в организм, участвуют в синтезе медиаторов и обладают цитотоксической активностью по отношению к МБТ [Маянский А.Н., 2001; Еремеев В.В., Майоров К.Б., 2002; Чучалин А.Г., 2004]. Таким образом, повышение активности системы ДНК-репарации в моноцитах, являющихся не только мишенью отрицательного воздействия МБТ, но и важным звеном в противотуберкулезном иммунитете, можно рассматривать как защитно-приспособительную реакцию, направленную на восстановление поврежденных участков цепи ДНК и, тем самым, повышение выживаемости клеток.
При этом результаты ковариационного анализа показали, что снижение активности ДНК-репаративных процессов имеет статистически достоверное значение в запуске программы апоптоза лимфоцитов крови у больных инфильтративным ЛЧ ТЛ до начала терапевтических мероприятий, в то время как активация ДНК-репарации, по всей видимости, оказывает протективный эффект в отношении апоптоза моноцитов у пациентов с диссеминированным ЛЧ ТЛ и инфильтративным ЛУ ТЛ (табл. 2, 3).
В отличие от ТЛ, в патогенезе ХОБЛ важная роль отводится нейтрофильным гранулоцитам. Полагают, что макрофаги регулируют воспаление при ХОБЛ за счет высвобождения хемокинов, которые привлекают в очаг воспаления, прежде всего, нейтрофилы и во вторую очередь – моноциты и Т-лимфоциты, высвобождающие факторы (протеазы), приводящие к разрушению эластина и последующему формированию эмфиземы [Шмелев Е.И., 2007]. Таким образом, лимфоциты и моноциты играют второстепенную роль в патогенезе ХОБЛ. Вероятно, именно поэтому в них не происходит значимой активации ДНК-репарации.
При изучении метафазных пластинок лимфоцитов периферической крови у больных ТЛ было обнаружено достоверное увеличение общего количества клеток с хромосомными нарушениями в сравнении с аналогичными показателями в группах сравнения. При этом увеличение общего количества клеток с хромосомными аберрациями происходило в основном за счет возрастания доли лимфоцитов с нарушениями структуры хромосом. У больных ХОБЛ также обнаруживалось увеличение числа клеток с аберрациями, но за счет изменения числа хромосом.
При анализе структурных аберраций хромосом в лимфоцитарных клетках у больных легочным туберкулезом учитывались хромосомные разрывы и обмены (парные фрагменты, разрывы хромосом по центромере, кольцевые и дицентрические хромосомы), а также хроматидные разрывы и обмены (одиночные фрагменты и «кресты»).
Было зарегистрировано повышение содержания хромосомных разрывов в лимфоцитах у больных с инфильтративным ЛЧ и ЛУ ТЛ, а также с фиброзно-кавернозным ЛЧ ТЛ относительно группы здоровых доноров. Одновременно у всех обследуемых пациентов (за исключением больных с инфильтративным ЛЧ ТЛ) отмечалось достоверное повышение числа хромосомных обменов в клетках относительно такового в группах сравнения. У всех пациентов с ЛУ ТЛ, инфильтративным и фиброзно-кавернозным вариантами ЛЧ ТЛ отмечалось также увеличение частоты регистрации хроматидных разрывов в лимфоцитах в сравнении с аналогичными показателями у здоровых доноров и больных ХОБЛ. В то же время у больных с инфильтративным ЛЧ ТЛ число хроматидных разрывов в клетках оказалось больше, чем при чувствительной к терапии его форме. В остальных группах обследованных данный показатель не отличался от нормальных значений.
Таблица 3
Факторы, оказывающее влияние на апоптоз моноцитов
у больных туберкулезом легких до начала терапии
| Форма туберкулеза | Показатель | Достоверность | |
| Больные ЛЧ ТЛ | Инфильтративная форма | Содержание магния в плазме | р<0,00001 |
| Содержание меди в плазме | р<0,00001 | ||
| Содержание ТБК-а в моноцитах | р<0,00001 | ||
| Микровязкость мембраны моноцитов | р<0,00001 | ||
| Диссеминированная форма | ИС ДНК-репарации моноцитов | р=0,00007 | |
| Содержание ТБК-а в моноцитах | р=0,00065 | ||
| Фиброзно-кавернозная форма | Уровень алюминия в моноцитах | р<0,00001 | |
| Уровень цинка в плазме | р<0,00001 | ||
| Казеозная пневмония | - | - | |
| Больные ЛУ ТЛ | Инфильтративная форма | ИС ДНК-репарации моноцитов | р<0,00001 |
| Содержание марганца в плазме | р=0,00001 | ||
| Содержание цинка в плазме | р=0,00004 | ||
| Содержание ФЭА в мембране мононуклеаров | р<0,00001 | ||
| Содержание ФИ в мембране мононуклеаров | р=0,00025 | ||
| Диссеминированная форма | Содержание меди в плазме | р<0,00001 | |
| Содержание натрия в плазме | р<0,00001 | ||
| Отношение ХС/ФЛ в мембране мононуклеаров | р<0,00001 | ||
| Содержание ХС в мембране мононуклеаров | р<0,00001 | ||
| Фиброзно-кавернозная форма | Содержание марганца в моноцитах | р=0,00074 | |
| Содержание ФИ в мембране мононуклеаров | р=0,00019 |
Здесь и далее: ФЭА – фосфатидилэтаноламин, ХС – холестерин, ХС/ФЛ – холестерин-фосфолипидное отношение.
Возрастание в клетке числа хроматидных разрывов и обменов при действии различного рода мутагенных факторов указывает на синтетический или постсинтетический периоды возникновения хромосомных нарушений, повышение же уровня хромосомных разрывов и обменов – на чувствительность к повреждающему воздействию G1-фазы клеточного цикла [Плотникова Н.Н., 1992]. По всей видимости, M. tuberculosis посредством индукции образования токсических продуктов клеточного и тканевого распада, стимуляции секреции активных форм кислорода полиморфноядерными лейкоцитами, макрофагами и свободнорадикальных реакций [Каминская Г.О., 1996; Mitsuyama M., 1995] может вызывать возникновение нарушений в хромосомном аппарате лимфоцитов. Можно также сделать вывод о том, что при КП и диссеминированном варианте ЛЧ ТЛ хромосомные аберрации лимфоцитов возникают преимущественно в G1-фазе, при остальных формах ТЛ как в G1, так и S- и G2-фазах клеточного цикла.
Интересным представляется также тот факт, что уровень апоптоза лимфоцитов был максимальным при тех формах ТЛ, при которых отклонения параметров цитогенетического статуса являлись наиболее выраженными. Так, при инфильтративном и фиброзно-кавернозном ТЛ было зарегистрировано наибольшее количество лимфоцитов с хромосомными аберрациями, была пониженной активность ДНК-репарации и высоким уровень апоптотических лимфоцитов. При диссеминированном ТЛ и КП, напротив, было выявлено незначительное повышение числа клеток со структурными нарушениями хромосом, annexin-позитивных клеток и нормальный уровень ДНК-репаративного синтеза. Кроме этого, при инфильтративном ЛУ ТЛ была отмечена положительная корреляционная связь между показателем спонтанного апоптоза лимфоцитов и количеством хромосомных (r=0,892; p=0,041) и хроматидных (r=0,892; p=0,041) обменов. Данный факт демонстрирует роль цитогенетических изменений в запуске апоптоза. При проведении ковариационного анализа также была подтверждена роль нарушений числа и структуры хромосом, количества хроматидных разрывов и хромосомных обменов в инициации апоптотической гибели лимфоцитов у больных с инфильтративным ЛЧ ТЛ (табл. 2).
Таким образом, ТЛ сопровождается угнетением эксцизионной ДНК-репарации и накоплением хромосомных аберраций в лимфоцитах. Наряду с этим, в моноцитах регистрируется повышение индекса ДНК-репарации (за исключением больных с фиброзно-кавернозным ЛЧ ТЛ). У пациентов с ХОБЛ, равно как и у больных ТЛ, уровень лимфоцитов с хромосомными нарушениями выше, чем у здоровых добровольцев, однако только за счет числовых аберраций хромосом при отсутствии выраженных отклонений со стороны активности ДНК-репаративных процессов, что указывает на специфический характер цитопатического действия возбудителя туберкулезной инфекции.
Известно, что при апоптозе мембрана иммуноцитов утрачивает ворсинчатость и образует пузыревидные вздутия, что возможно только в условиях повышенной текучести мембраны. В связи с этим нами была проведена оценка микровязкостных свойств цитоплазматической мембраны лимфоцитов и моноцитов у больных ТЛ до начала химиотерапии и у пациентов с ХОБЛ в фазу обострения с использованием метода флуоресцентного зондирования.
В результате проведенных исследований были получены достоверные данные, позволяющие судить о нарушении микровязкости липидного бислоя мембраны мононуклеарных лейкоцитов у больных ТЛ и ХОБЛ. Так, проведенное спектрофлуориметрическое исследование цитоплазматической мембраны лимфоцитов и моноцитов крови позволило установить достоверное увеличение коэффициентов эксимеризации пирена I470/I370 и I470/I390 при длинах волн возбуждающего света (λ) 285 нм и 340 нм во всех группах больных ТЛ до лечения (также как и у пациентов с ХОБЛ) по сравнению с аналогичными показателями у здоровых доноров.
Зарегистрированное увеличение коэффициентов эксимеризации пирена у больных ТЛ показывает снижение микровязкости мембраны и/или увеличение ее гидрофобного объема как в зоне белок-липидных контактов, оцениваемой при длине волны возбуждающего света 285 нм, так и в общем липидном бислое (λ=340 нм) [Добрецов Г.Е., 1989; Дунаева А.Н. и соавт., 1990]. Повышение текучести мембраны мононуклеаров крови у пациентов с ТЛ, видимо, связано с модификацией ее фосфолипидного спектра в сторону увеличения пула легкоокисляемых фракций липидов, характеризующихся высоким содержанием ненасыщенных жирнокислотных остатков [Кузьмичева Л.В. и соавт., 2005].
Известно, что изменение микровязкости мембраны сопровождается перестройкой сети мембранных белков и приводит к повышению подвижности фосфолипидных молекул [Горошинская И.А. и соавт., 1999; Новицкий В.В. и соавт., 2005]. Данный факт играет важную роль в апоптозе. Одним из этапов реализации программы апоптоза является образование апоптотических телец. По всей видимости, без увеличения текучести мембраны изгибание плазматической мембраны и формирование апоптотических телец невозможно. Кроме этого, при снижении вязкости мембраны устраняется асимметрия фосфолипидов, характеризующаяся переходом фосфатидилсерина с внутренней на внешнюю поверхность мембраны [Лушников Е.Ф., Абросимов А.Ю., 2001; Суханова Г.А., Акбашева О.Е., 2006]. Важная роль свойств мембраны в инициации клеточной гибели подтверждается данными ковариационного анализа, который показал статистически достоверную связь между микровязкостью мембраны и активностью апоптоза лимфоцитов (у больных фиброзно-кавернозным ЛУ ТЛ) и моноцитов (при инфильтративном ЛЧ ТЛ) (табл. 2, 3).
Наличие изменений показателей флуоресценции пирена в мембране лимфоцитов и моноцитов, а также достаточно похожая картина нарушений при ТЛ и ХОБЛ указывает на их типовой характер. Таким образом, изменения параметров флуоресценции липотропного зонда пирен в мембране лимфоцитов и моноцитов не являются специфичными для туберкулезного процесса, не зависят от вида клеток, формы заболевания, устойчивости возбудителя инфекции к действию химиопрепаратов и указывают на снижение микровязкости мембраны, необходимое для реализации апоптоза.
Основными и важнейшими компонентами клеточных мембран являются фосфолипиды. Липиды мембран формируют среду для функционирования мембранных белков, принимающих в ней нативную конформацию [Хышиктуев Б.С. и соавт., 1999]. В связи с этим в настоящей работе было проведено исследование фосфолипидного спектра плазматической мембраны моноцитов и лимфоцитов у больных ТЛ.
В ходе исследований были получены фактические данные, подтверждающие наличие выраженной дезорганизации мембраны мононуклеарных клеток крови у больных ЛЧ ТЛ и ЛУ ТЛ. В частности, у больных ТЛ до начала терапевтических мероприятий показаны изменения абсолютного и процентного соотношения отдельных фракций фосфолипидов на фоне нормального их суммарного содержания. Так, у больных ТЛ было обнаружено снижение количества сфингомиелина (СФМ), фосфатидилхолина (ФХ) и повышение содержания фосфатидилинозитола (ФИ), фосфатидилэтаноламина (ФЭА) в плазматической мембране мононуклеаров крови относительно аналогичных показателей у здоровых доноров. Данные изменения были наиболее выраженными при фиброзно-кавернозном ЛУ ТЛ.
Изменения фосфолипидного состава мембраны мононуклеарных лейкоцитов у больных ХОБЛ в целом были аналогичны таковым при ТЛ, что свидетельствует об общности механизмов структурной модификации цитоплазматической мембраны при воспалении легких. Между тем, в период обострения ХОБЛ отмечалось достоверное снижение как абсолютного, так и процентного содержания холестерина (ХС) и тенденция к снижению отношения ХС/ФЛ в мембране мононуклеарных лейкоцитов. В отличие от больных ХОБЛ у всех пациентов с ТЛ в мембране клеток имело место достоверное повышение процентного содержания ХС и снижение концентрации жирных кислот (ЖК) в сравнении со здоровыми добровольцами. Все формы ЛУ ТЛ и фиброзно-кавернозный ЛЧ ТЛ сопровождались дополнительным снижением содержания ЭХС в плазматической мембране мононуклеаров крови. Абсолютное содержание ХС и ХС/ФЛ в мембране мононуклеарных лейкоцитов возрастало при всех вариантах ЛУ ТЛ, однако при ЛЧ ТЛ было в пределах нормы.
ФЭА играет важную роль в регуляции активности Ca2+- и Mg2+-АТФазы [Рязанцева Н.В. и соавт., 2004]. Увеличение его содержания в мембране, возможно, является компенсаторной реакций, направленной на удаление кальция и магния из цитозоля. Между тем, увеличение концентрации ФЭА, содержащего легкоокисляемые полиненасыщенные ЖК, может обусловливать активацию перекисного окисления мембранных липидов и повреждение клеток [Рязанцева Н.В. и соавт., 2004]. Таким образом, увеличение концентрации ФЭА в цитоплазматической мембране может стимулировать апоптоз, что подтверждается выявленной положительной корреляцией между содержанием ФЭА в мембране монононуклеаров и количеством annexin V-положительных лимфоцитов (r=0,914; р=0,001) у больных с фиброзно-кавернозным ЛЧ ТЛ. Кроме этого, значение ФЭА в индукции апоптоза моноцитов у больных инфильтративным ЛУ ТЛ подтверждают результаты ковариационного анализа (табл. 3).
Одним из продуктов ферментативного синтеза СФМ является церамид, который рассматривается как критический компонент апоптоза [Рыжов С.В., Новиков В.В., 2002; Bieberich E., 2008; Billich A., Baumruker T., 2008]. Показано, что ФНО-α, Fas-лиганд вызывают накопление церамида в клетках [Hannun Y.A., 2000; Jaffrhzou J.P. et al., 2002, 2004]. Под действием церамида происходит дефосфорилирование молекулы антиапоптотического белка bcl-2, а также активация протеинкиназы, которая фосфорилирует проапоптотические белки [Мобейко А.А. и соавт., 2005]. Снижение содержания СФМ в мембране мононуклеарных лейкоцитов при ТЛ, вероятно, сопряжено с накоплением проапоптотического церамида, что косвенно подтверждается отрицательной корреляцией между содержанием annexin V-положительных моноцитов и уровнем СФМ в мононуклеарах крови у больных с диссеминированным ЛУ ТЛ (r=-0,900; p=0,037), а также (по результатам ковариационного анализа) зависимостью апоптоза лимфоцитов от содержания СФМ в мембране мононуклеаров у больных с фиброзно-кавернозным ЛЧ ТЛ и диссеминированным ЛУ ТЛ (табл. 2).
ФИ используется для синтеза соответствующих производных, выступающих в роли звена пролиферации, вторичного мессенджера в кальций-зависимой внутриклеточной сигнализации [Кузьмичева Л.В. и соавт., 2005]. Влияние веществ, воздействующих на обмен фосфоинозитидов, с весьма большой долей вероятности приводит к накоплению Са2+ в цитозоле [Александров А.А., 2005] и программируемой клеточной гибели. По данным ковариационного анализа, накопление ФИ в мембране мононуклеаров оказывало существенное индуцирующее влияние на апоптоз лимфоцитов (при диссеминированном ЛУ ТЛ) и моноцитов (при инфильтративном и фиброзно-кавернозном ЛУ ТЛ) (табл. 2, 3).
Таким образом, у больных ТЛ до терапевтических мероприятий (как и у пациентов с обострением ХОБЛ) отмечается перераспределение фосфолипидного состава мембраны лимфоцитов и моноцитов крови в сторону увеличения содержания фракций, богатых ненасыщенными ЖК. При этом известно, что увеличение содержания ХС в мембранах стабилизирует липидный бислой [Владимиров Ю.А., 1989; Ройт А.,2000; Catfield J., 2000; Graziani A. еt al., 2006]. Следовательно, выявленное увеличение содержания ХС в мембране больных ТЛ должно обусловливать увеличение ее «жесткости», что не согласуется с полученными результатами, показывающими снижение микровязкости липидного бислоя при ТЛ. Известно, что ХС образует кластеры в комплексе с гликопротеинами, специфически активируя поглощение МБТ макрофагами, и в мембране, лишенной большей части холестериновой фракции, фагоцитоз является несостоятельным. При этом свободный ХС оказывает опосредованное влияние на фагосомальную сборку покрывающего триптофан-аспарагин-содержащего белка (ТАСО), который предотвращает деградацию МБТ в фаголизосомах [Catfield Jh., 2000]. Очевидно, что входящие в макрофаги через обогащённые ХС мембранные домены клеток-хозяина МБТ способны обеспечить себе последующую выживаемость в насыщенных ХС и покрытых ТАСО фагосомах. Высокий процент ХС в мембране фагосомы при этом является не только дополнительным защитным «панцирем» для находящихся внутри МБТ, но и, возможно, причиной, препятствующей слиянию фагосомы с лизосомой. Следовательно, достаточно высокий уровень свободного ХС в мембране моноцитов/макрофагов – основное условие для «благополучного» их инфицирования МБТ. Снижение содержания свободных ЖК и ЭХС в мембране мононуклеарных клеток при ТЛ, вероятнее всего, является результатом увеличения процента холестериновой фракции. Это может быть связано с повышенной потребностью в синтезе эйкозаноидов, увеличение образования которых показано при туберкулезном процессе [Каминская Г.О., 1996].
Таким образом, все формы ТЛ до начала лечения характеризуются выраженными изменениями структуры и снижением микровязкости липидного компонента мембраны иммунокомпетентных клеток. Специфическим признаком туберкулезного процесса является повышенное содержание ХС в мембране клеток, наиболее выраженное при ЛУ ТЛ.
Одним из мощных факторов, повреждающих клеточные мембраны, является образование свободных радикалов в процессе перекисного окисления липидов (ПОЛ). Усиление ПОЛ приводит к деструкции липидного бислоя, нарушению функциональной активности мембраносвязанных ферментов, изменению проницаемости мембраны и функционального состояния рецепторного аппарата клетки [Завалишин И.А., 1999; Волчегорский И.А., 2004; Вострикова Е.А. и соавт., 2006; Голод Е.А, Кирпатовский В.И., 2006] и запуску апоптоза [Суханова Г.А., Акбашева О.Е., 2006]. Особенно чувствительны к радикалам мембраны митохондрий и ядер. Через поврежденные мембраны митохондрий выходят AIF (апоптоз-индуцирующий фактор) и цитохром с, которые активируют каспазный каскад. Через поврежденную ядерную оболочку каспазы легче проникают в ядро и активируют в нем эндонуклеазы [Жукова О.Б. и соавт., 2006; Суханова Г.А., Акбашева О.Е., 2006]. Учитывая апоптозиндуцирующую роль реакций свободнорадикального окисления, нами была проведена оценка активности ПОЛ и ферментов антиоксидантной защиты (АОЗ) в мононуклеарах крови у больных ТЛ и у пациентов с обострением ХОБЛ.
До начала терапии у больных ЛЧ ТЛ были выявлены признаки активации ПОЛ, проявляющиеся увеличением концентрации ТБК-активных продуктов (ТБК-а) в лимфоцитах и моноцитах, а также диеновых конъюгатов (ДК) в моноцитарных клетках на фоне повышенной активности супероксиддисмутазы (СОД) и нормальной каталазной активности мононуклеарных лейкоцитов. Вместе с тем, при ЛУ формах ТЛ изменений в изучаемых показателях, за исключением повышенной активности ферментов АОЗ в лимфоцитах при диссеминированном ЛУ ТЛ, не выявлялось.
ДК и ТБК-а являются продуктами ПОЛ и их накопление доказывает увеличение активности ПОЛ. Активация ПОЛ при ЛЧ ТЛ сопровождает развитие реакций доиммунного воспаления в ответ на вторжение инфектогена и уничтожение возбудителя в пределах системы «макрофаг – цитотоксический Т-лимфоцит». Следовательно, инфицирование лекарственно-чувствительными штаммами МБТ «не уходит» от надзора иммунной системы, чего нельзя отнести к устойчивым к химиопрепаратам штаммам микобактерий. Отсутствие каких-либо изменений в уровне исследуемых продуктов ПОЛ при ЛУ ТЛ, по-видимому, еще одно доказательство способности лекарственно-устойчивых МБТ, обладающих эффективными механизмами ингибирования активных форм кислорода (АФК), «ускользать» от иммунного надзора [Маянский А.Н., 2001; Краснов В.А. и соавт., 2005].
СОД – фермент, превращающий в реакции дисмутации супероксидный анион-радикал в перекись водорода, далее разрушающуюся каталазой. Увеличение активности СОД у больных ЛЧ вариантами ТЛ и ХОБЛ, предположительно, является адаптивно-компенсаторной реакцией, направленной на удаление избытка супероксид-аниона, обладающего способностью вызывать радикальное окисление липидов не только возбудителя, но и собственных липидных комплексов и липидов клеточных мембран в частности [Краснов В.А. и соавт., 2005; Каминская и соавт., 2006].
Общеизвестно, что активация ПОЛ приводит к накоплению АФК, которые повреждают клетки и обусловливают их гибель. Высокореакционные АФК образуются во всех аэробных клетках и нарушение баланса «АФК/антиоксиданты» служит причиной запуска в клетках летальной программы [Зенков Н.К., Ланкин Е.Б., 2001]. Это подтверждается положительной корреляцией между количеством annexin V-положительных лимфоцитов и содержанием в лимфоцитах ТБК-а (r=0,948; p=0,049) у больных с фиброзно-кавернозным ЛЧ ТЛ. Кроме этого, по данным ковариационного анализа повышенное содержание ТБК-а оказывало стимулирующее влияние на апоптотическую гибель лимфоцитов и моноцитов при инфильтративной форме ЛЧ ТЛ, а также моноцитарных клеток при диссеминированном ЛЧ ТЛ (табл. 2, 3).
Таким образом, в лимфоцитах и (особенно) моноцитах крови при ЛЧ ТЛ до начала противотуберкулезной химиотерапии активируется ПОЛ и усиливается активность СОД. При ЛУ ТЛ в лимфоцитах и моноцитах активность ПОЛ (как в связи с биологическими свойствами ЛУ МБТ, так и за счет компенсаторной активации ферментов АОЗ) сохраняется на уровне нормальных значений..
Исходя из полученных данных, при ЛЧ ТЛ высокий уровень ПОЛ в лимфоцитах может расцениваться как один из факторов индукции апоптоза данного типа клеток. Кроме этого, при диссеминированном варианте туберкулезной инфекции имел место минимальный уровень annexin-положительных лимфоцитов в сочетании с более низким (ниже, чем при других формах ТЛ) содержанием в них ДК и значительно более высокой концентрацией СОД, что также подчеркивает важную роль продуктов ПОЛ и АОЗ в модуляции апоптоза.
Поддержание стабильного уровня внутриклеточных микроэлементов является важнейшим фактором клеточного гомеостаза. Учитывая специфическое влияние различных микроэлементов на регуляцию апоптоза, дисбаланс последних может служить пусковым механизмом дизрегуляции апоптоза. Исходя из этого, нами было проведено изучение макро- и микроэлементного состава мононуклеарных лейкоцитов и плазмы крови у больных ТЛ.
В результате исследования у больных ТЛ (инфильтративным, диссеминированным, фиброзно-кавернозным и КП) до лечения было зарегистрировано достоверное повышение содержания Na+, K+ и Ca2+ в лимфоцитах периферической крови в сравнении с аналогичными показателями у здоровых доноров и больных ХОБЛ. Кроме этого, у пациентов с инфильтративным ЛЧ ТЛ регистрировалось увеличение концентрации магния и микроэлементов в лимфоцитах, а при аналогичной форме ЛУ ТЛ – увеличение уровня Fe2+, Cu2+, Zn2+ и Mg2+ в сравнении с аналогичными показателями в контроле. У больных с диссеминированным ЛЧ ТЛ увеличивалась концентрация Zn2+, а с ЛУ ТЛ – уровень Fe2+, Cu2+ и Zn2+относительно таковой в обеих группах сравнения. В лимфоцитах у больных с фиброзно-кавернозной формой ТЛ концентрация Fe2+, Cu2+ и Zn2+ (независимо от лекарственной чувствительности M. tuberculosis) и Mg2+ (только при ЛЧ ТЛ) оказалась выше, чем у здоровых людей и больных ХОБЛ. У пациентов с КП снижался уровень Cu2+ в лимфоцитах в сравнении со здоровыми донорами. Содержание остальных микроэлементов не отличалось от нормальных значений.
У всех обследованных больных ТЛ было также обнаружено увеличение концентрации Na+ и K+ в моноцитах относительно аналогичных параметров у больных ХОБЛ (исключение составила группа больных инфильтративным ЛУ ТЛ). Повышение уровня Ca2+ в моноцитах было зарегистрировано практически при всех формах ТЛ (кроме больных с инфильтративной формой ЛЧ и ЛУ ТЛ) в сравнении с аналогичными показателями в группах сравнения. Помимо этого, изучение содержания элементного спектра моноцитов периферической крови позволило установить, что у больных с диссеминированным ЛЧ и ЛУ ТЛ регистрировалось повышение уровня всех изучаемых микроэлементов относительно такового у здоровых доноров и больных ХОБЛ. При инфильтративном варианте ТЛ также отмечалось увеличение концентрации Fe2+, Mg2+, Al3+ (независимо от чувствительности возбудителя инфекции к химиопрепаратам) и Zn2+ (только при ЛУ ТЛ), Cu2+, Mn2+ (только при ЛЧ ТЛ) в сравнении с аналогичными показателями у больных ХОБЛ. В то же время у пациентов с фиброзно-кавернозным ТЛ уровень Mg2+, Al3+ (и при ЛЧ, и при ЛУ вариантах) и Cu2+, Mn2+, Zn2+ (только при ЛУ ТЛ) оказался выше, чем у здоровых доноров и больных ХОБЛ. Кроме этого, у больных КП увеличивался уровень Mg2+ относительно такового у здоровых людей и больных ХОБЛ.
Установленные изменения макро- и микроэлементного состава мононуклеарных лейкоцитов крови при ТЛ, по всей видимости, могут служить, с одной стороны, проявлением активации апоптоза, с другой – включением защитных механизмов, препятствующих чрезмерной активации клеточной гибели.
Известно, что течение ТЛ сопровождается активацией процессов фагоцитоза, свободнорадикального окисления (СРО), что в условиях недостаточности антиоксидантных механизмов ведет к повреждению внутриклеточных структур токсичными радикалами и запуску программированной гибели клеток [Vanham G. et al., 1997; Сахно Л.В. и соавт., 2004]. Вероятно, увеличение концентрации Ca2+ и Mg2+ в клетках крови при ТЛ можно рассматривать в качестве одного из факторов патогенеза этого заболевания. Показано в частности, что причиной запуска апоптоза, наряду с возрастанием в клетке экспрессии генов – индукторов апоптоза (или угнетением генов, ингибирующих апоптоз), является повышенное поступление внутрь клетки ионов кальция и магния. Кроме этого, большинство биологически активных веществ, активизирующих в клетке вторичные мессенджеры, приводит к увеличению в цитозоле клетки концентрации Са2+. Увеличение концентрации Са2+ и Mg2+ в цитоплазме ведет к активации Са2+/Mg2+-зависимой эндонуклеазы, Са2+-зависимой трансглутаминазы, а также опосредует повышение активности клеточных протеиназ [McConkey D.J.еt al., 1989; Evan G. еt al., 1994]. Таким образом, Са2+ и Mg2+ играют важную роль в активации апоптоза.
При анализе концентрации Са2+ и Mg2+ в лимфоцитах в связи с активностью апоптоза клеток данного типа обращал на себя внимание следующий факт: при диссеминированном ЛЧ ТЛ и КП внутриклеточный уровень кальция сохранялся нормальным; при этом уровень annexin-положительных клеток был минимальным.
Натрий играет весьма важную роль в регуляции водного обмена. Выведение натрия из клеток осуществляется Na+/K+-АТФазой, которая являтется мишенью АФК [Huang W.H. et al., 1992; Boldyrev A., Kurella E., 1996; Petrushanko I. et al., 2003]. Повышение уровня АФК приводит к обратимому ингибированию фермента [Булыгина и соавт., 2002]. Вызывая полимеризацию белков, окисление сульфгидрильных групп ферментов, эти продукты приводят в первую очередь к поражению мембран клеток и нарушению их проницаемости, что приводит к накоплению Са2+ и Nа+ в клетке [Суханова Г.А., Серебров В.Ю., 2000]. Данным фактом можно объяснить повышение концентрации Nа+ в лимфоцитах крови при ТЛ. Так как активация ПОЛ была установлена только при ЛЧ ТЛ, это объясняет большую концентрацию ионов натрия в лимфоцитах при ЛЧ (нежели ЛУ) формах ТЛ. Интересно, что повышение уровня натрия в лимфоцитах при диссеминированном и фиброзно-кавернозном ЛЧ ТЛ, а также инфильтративном ЛУ ТЛ по данным ковариационного анализа оказывало индуцирующее влияние на апоптоз лимфоцитов (табл. 2).
Калий – основной внутриклеточный катион, важнейшая биологическая роль которого заключается в создании трансмембранного потенциала. Известно, что церамид, являющийся медиатором реализации липидного пути апоптоза, приводит к накоплению ионов калия в клетке путем инактивации К+-каналов [Gulbins Е. et al., 2000]. Оказывается, что «отключение» К+-каналов, приводящее к деполяризации мембраны, служит обязательным условием реализации апоптоза [Рыжов С.В., Новиков В.В., 2002], в то время как нормальный потенциал мембраны или ее гиперполяризация обеспечивают пролиферативную активность клетки.
Железо – важный эссенциальный микроэлемент, который катализирует реакции, в которых генерируются свободные радикалы кислорода, нарушающие синтез ДНК, влияющие на активность ряда ферментов, вызывающих пероксидацию полиненасыщенных липидов клеточных мембран [Кудрин А.В., Скальный А.В., 2001; Поляк-Блажи М., 2002; Ермоленко В.М., Филатова Н.Н., 2004]. Потенциальная роль железа в повреждении клеток подтверждается наличием положительной корреляционной связи между концентрацией ионов железа в лимфоцитах и числом хроматидных обменов в лимфоцитарных клетках при инфильтративном ЛУ ТЛ (r=0,787; p=0,006), а также количеством хроматидных разрывов при инфильтративном ЛЧ ТЛ (r=0,974; p=0,004). Железо, потенцируя повреждение хромосом, опосредует апоптоз. На это указывает положительная корреляционная связь между внутриклеточной концентрацией железа и содержанием аnnexin V-положительных лимфоцитов в крови (r=0,808; p=0,042) у пациентов с фиброзно-кавернозным ЛУ ТЛ. Кроме этого, еще одним доказательством потенцирующей роли железа в отношении апоптоза могут являться результаты ковариационного анализа, которые указывают на существенный вклад повышенной внутриклеточной концентрации железа в индукцию апоптоза лимфоцитов при инфильтративном ЛУ ТЛ (табл. 2).
Цинк и марганец – антиоксиданты, контролирующие активность окислительных процессов. Известно, что ионы цинка, являясь конкурентным антагонистом Са2+ и Mg2+, компонентом медь-цинковой СОД, способствуют торможению свободнорадикального оксиления и эндонуклеазной активности, стабилизируют спиральную структуру ДНК, блокируют транскрипционные факторы Fas, с-myc и стимулируют ген bcl-2, что способствует торможению эндонуклеаз и предупреждает апоптоз [Кудрин А.В., Скальный А.В., 2001]. По всей видимости, факт повышения концентрации Zn2+ и Mn2+ в мононуклеарах крови при ТЛ можно объяснить включением защитных механизмов, предотвращающих свободнорадикальное повреждение клеток и апоптоз иммуноцитов. В литературе приводятся также данные о способности Mn2+ стимулировать процессы клеточной репродукции, синтеза белков и ДНК, влиять на обмен фосфолипидов клеточных мембран [Кудрин А.В., Скальный А.В., 2001]. Ковариационный анализ продемонстрировал, что на апоптоз лимфоцитов модулирующее (ингибирующее) влияние оказывает концентрация марганца у больных с диссеминированным ЛЧ ТЛ и уровень цинка у пациентов с фиброзно-кавернозным ЛЧ ТЛ, а на апоптоз моноцитов – содержание марганца при фиброзно-кавернозном ЛУ ТЛ (табл. 2, 3).
Медь (равно как и Zn2+) входит в состав субъединиц цитозольной СОД, прерывающей свободнорадикальные процессы. Кроме этого, было установлено, что ионы меди, связываясь с ДНК, сами по себе приводят к ее одно- и двунитевым разрывам, что проявляется хромосомными аберрациями [Благой Ю.П., 1998]. Это подтверждается наличием положительной корреляционной связи между внутриклеточной концентрацией меди и числом хроматидных разрывов в лимфоцитарных клетках при инфильтративном (r=0,974; p=0,004), фиброзно-кавернозном (r=0,723; p=0,048) ЛЧ ТЛ и инфильтративном ЛУ ТЛ (r=0,827; p=0,042). В свою очередь, увеличение числа хромосомных аберраций под действием меди в лимфоцитарных клетках может служить пусковым фактором апоптотической гибели, на что указывает положительная корреляция между содержанием annexin V-положительных лимфоцитов и концентрацией меди в лимфоцитарных клетках (r=0,846; p=0,041) у больных с диссеминированным ЛУ ТЛ. Аналогичные результаты были получены и при проведении ковариационного анализа, который показал индуцирующее влияние высокой внутриклеточной концентрации меди на апоптоз лимфоцитов при инфильтративном ЛЧ и ЛУ ТЛ (табл. 2).
Накопление ионов алюминия в клетках, по данным литературы, служит причиной выраженной интоксикации и нарушения процессов внутриклеточного обмена. Высокая способность алюминия образовывать токсические комплексные соединения обусловливает его роль в снижении активности внутриклеточных ферментов и их систем [Идз М., 1995]. Токсическая роль алюминия косвенно подтверждается положительной корреляцией между его концентрацией и количеством хроматидных разрывов в лимфоцитах (r=0,836; p=0,037) у больных КП, а также результатами ковариационного анализа, показавшего достоверную связь между апоптозом моноцитов и концентрацией алюминия в моноцитарных клетках у больных с фиброзно-кавернозным ЛЧ ТЛ (табл. 3).
Кроме этого, было проведено исследование элементного состава плазмы крови у больных ТЛ. Так, у пациентов с ТЛ до начала терапевтических мероприятий регистрировалось достоверное повышение концентрации натрия в плазме крови (за исключением группы больных с инфильтративным ЛЧ ТЛ) в сравнении с аналогичными показателями у здоровых доноров. Развитие гипокалиемии также устанавливалось у больных с инфильтративным и диссеминированным ЛУ ТЛ. Концентрация Ca2+ в плазме крови у больных ТЛ до начала лечения была в пределах нормы. Кроме этого, во всех исследуемых группах больных ТЛ было выявлено снижение концентрации Fe2+ в плазме крови в сравнении с таковым у здоровых доноров. У больных с инфильтративным и фиброзно-кавернозным ЛУ ТЛ также снижался плазменный уровень меди и марганца, а у пациентов с фиброзно-кавернозным ЛЧ и диссеминированным ЛУ ТЛ – только меди. У больных с диагнозом инфильтративного и диссеминированного ЛЧ ТЛ регистрировалось снижение уровня Cu2+ в плазме только в сравнении с содержанием его у здоровых доноров. Вместе с тем, у всех больных ТЛ фиксировалось снижение плазменной концентрации Zn2+ и Mg2+ относительно таковой у здоровых людей.
Выявленное по итогам настоящего исследования снижение концентрации элементов в плазме, вероятно, связано с их перераспределением между вне- и внутриклеточной средой. В пользу этого указывает отрицательная корреляционная связь между концентрацией марганца (r=-0,840; p=0,036) у больных КП, а также уровнем кальция (r=-0,744; p=0,021) у больных диссеминированным ЛУ ТЛ в моноцитах и плазме. Интересные данные были получены при проведении ковариационного анализа. Так, на апоптоз лимфоцитов оказывали влияние низкая плазменная концентрация меди при диссеминированном ЛУ ТЛ и пониженное содержание марганца в плазме при фиброзно-кавернозном ЛУ ТЛ (табл. 2).
Химиотерапия является основным компонентом лечения больных ТЛ и заключается в применении лекарственных препаратов, подавляющих размножение МБТ (бактериостатический эффект) или уничтожающих их в организме больного (бактерицидный эффект). Вместе с тем, данные препараты обладают токсичностью. На фоне химиотерапии у больных ТЛ с побочными реакциями на противотуберкулезные препараты (ПТП) имеет место дисфункция внутриклеточных ферментных систем, опосредующая дистрофические изменения в клетках. Такие лимфоциты с выраженными нарушениями структуры и метаболизма, попадая с током крови в различные органы, но являясь мало активными и нежизнеспособными, быстро и в большом количестве разрушаются, подвергаясь апоптозу [Мишин В.Ю. и соавт., 2004].
Проведенное нами изучение количественных показателей периферической крови у больных ТЛ после проведения курса интенсивной химиотерапии позволило установить, что у пациентов с инфильтративной ЛУ формой заболевания ОКЛ оказалось ниже, чем до начала лечения. В остальных группах достоверных изменений ОКЛ не регистрировалось. Кроме этого, у всех пациентов (кроме больных КП) отмечался абсолютный и относительный моноцитоз. При диссеминированном ЛЧ ТЛ повышалось абсолютное и относительное количество лимфоцитов в сравнении с таковым до начала лечения. В группах больных фиброзно-кавернозным ЛЧ и ЛУ ТЛ и при инфильтративном ЛУ ТЛ процентное содержание лимфоцитов оставалось на прежнем уровне.
После окончания специфической противотуберкулезной химиотерапии у пациентов всех групп наблюдения регистрировалась нормализация ОКЛ, абсолютного и относительного содержания мононуклеарных лейкоцитов. Исключением являлись больные с КП и фиброзно-кавернозным ЛУ ТЛ, у которых, несмотря на восстановление ОКЛ, сохранялся моноцитоз.
Снижение ОКЛ у больных ТЛ после интенсивного курса лечения, очевидно, является результатом снижения бактериальной нагрузки на организм. Сохранение лимфоцитопении при ТЛ, видимо, связано с угнетением лимфоцитопоэза под действием химиопрепаратов [Диденко Г.В. и соавт., 2003], а также с токсическим действием ПТП на циркулирующие лимфоциты и гибелью клеток [Ерохин В.В., 1998]. Сохраняющийся моноцитоз на фоне интенсивного этапа лечения ТЛ, возможно, являет собой следствие не только туберкулезной инфекции, но и высокого уровня распада бактериальных тел и цитолитического действия накапливающихся в организме токсинов (учитывая токсическое влияние ПТП на печень и другие органы) [Ерохин В.В., Земскова З.С., 2003].
Уровень спонтанного апоптоза лимфоцитов крови (по количеству annexin V-позитивных клеток) после проведения курса интенсивной противотуберкулезной химиотерапии у больных инфильтративным ЛЧ ТЛ (на 17 %), диссеминированным и фиброзно-кавернозным ЛЧ (на 43% и 14% соответственно) и ЛУ (на 33% и 18% соответственно) ТЛ достоверно увеличивался в сравнении с таковым до начала лечения. В остальных группах наблюдения достоверных изменений величины этого показателя по сравнению с периодом до приема химиотерапии выявлено не было.
При оценке апоптоза моноцитов после проведения интенсивного курса специфической противотуберкулезной терапии было показано, что уровень гибели данного типа клеток у пациентов с диагностированным диссеминированным ЛЧ и при инфильтративном ЛУ ТЛ достоверно не изменялся в сравнении с предыдущим этапом исследования, в то время как в других группах обследованных больных показатели апоптоза моноцитов оказались достоверно более высокими, чем до начала терапии.
После окончания полного курса противотуберкулезной химиотерапии у пациентов большинства исследуемых групп уровень апоптоза как лимфоцитов, так и моноцитов оказался достоверно ниже такового до начала лечения, но по-прежнему превышал нормальные значения, и только при фиброзно-кавернозном ЛУ ТЛ отмечалось восстановление количества annexin V-положительных моноцитов до показателей нормы.
При оценке экспрессии CD95-рецептора на поверхности лимфоцитов у больных ТЛ после окончания курса интенсивной терапии существенных изменений в сравнении с предыдущим этапом исследования выявлено не было. Только у больных с фиброзно-кавернозным ЛУ ТЛ было зарегистрировано снижение абсолютного количества CD95+-лимфоцитов относительно их содержания на предыдущем этапе исследования. Как уже отмечалось выше, при туберкулезной инфекции до начала терапии уровень CD95-позитивных лимфоцитов (по данным ковариационного анализа) определялся в качестве фактора, сопряженного с активностью апоптоза лимфоцитарных клеток. После курса интенсивной терапии устанавливалась аналогичная связь между количеством CD95+-лимфоцитов и числом клеток, вступивших в раннюю фазу апоптоза, у больных с инфильтративным и диссеминированным ЛЧ (р<0,00001), а также с фиброзно-кавернозным ЛУ (р=0,00008) ТЛ.
После проведения курса поддерживающей терапии была зарегистрирована нормализация относительного и абсолютного содержания CD95+-лимфоцитов в крови только у больных с инфильтративным ЛЧ ТЛ. У больных же с диссеминированным ЛУ ТЛ в динамике лечения отмечалось еще большее повышение относительного числа CD95-позитивных лимфоцитов.
Известно, что на фоне химиотерапии у больных ТЛ с токсическими побочными реакциями на ПТП имеет место существенный дисбаланс активности ферментных систем клеток, что свидетельствует о глубоких дистрофических изменениях. Такие лимфоциты с выраженными структурно-метаболическими нарушениями, попадая с током крови в различные органы, но, являясь мало активными и нежизнеспособными, быстро и в большом количестве разрушаются, подвергаясь апоптозу [Мишин В.Ю. и соавт., 2004].
Существенных изменений индекса стимуляции ДНК-репарации в лимфоцитах у больных ТЛ после завершения интенсивного курса специфической химиотерапии в сравнении с предыдущим этапом исследования зарегистрировано не было. Исключение составили больные с фиброзно-кавернозным ЛЧ и ЛУ ТЛ, а также с инфильтративным ЛУ ТЛ, у которых было зарегистрировано увеличение индекса стимуляции ДНК-репаративного синтеза в лимфоцитах сравнительно с этапом до начала лечения. Кроме того, у пациентов с фиброзно-кавернозным ЛЧ ТЛ обнаруживалось резкое повышение индекса ДНК-репарации в моноцитах относительно первого этапа исследования, в то время как при всех формах ЛУ ТЛ было обнаружено статистически значимое его снижение. В остальных группах обследованных пациентов на фоне проведения терапии активность ДНК-репарации в моноцитарных клетках не изменялась.
Как уже указывалось ранее, дефицит факторов ДНК-репарации играет важную роль в инициации апоптотической гибели клеток. На этапе лечения данная зависимость сохранялась, на что указывала отрицательная корреляция между числом annexin V-положительных лимфоцитов и ИС ДНК-репарации в лимфоцитарных клетках (r=-0,885; р=0,018) у больных с диссеминированным ЛЧ ТЛ после курса интенсивной терапии. Это совпадало с результатами ковариационного анализа, согласно которым, на этапе интенсивного лечения низкий (ниже нормы) ИС ДНК-репарации (р=0,00025) был одним из факторов, определяющим высокий уровень апоптоза лимфоцитов при фиброзно-кавернозном ЛЧ ТЛ, в то время как повышение активности ДНК-репаративного синтеза в моноцитах (р=0,00001), возможно, как и до лечения, компенсировало чрезмерную активацию апоптоза моноцитарных клеток при диссеминированном ЛЧ ТЛ.
В фазу клинического выздоровления после окончания курса поддерживающей терапии была зарегистрирована нормализация ИС ДНК-репарации в лимфоцитах у всех больных ТЛ. В моноцитах крови у больных КП, диссеминированным и фиброзно-кавернозным ЛУ ТЛ репаративный ИС восстанавливался до нормы. В то же время у пациентов с инфильтративным ЛЧ ТЛ обнаруживалось снижение данного показателя в моноцитарных клетках по сравнению с контролем. В остальных группах ИС ДНК-репарации оставался повышенным.
Стремление индекса ДНК-репарации к нормализации в условиях химиотерапии связано, вероятно, со снижением бактериальной нагрузки и негативного влияния МБТ на иммуноциты. По данным ковариационного анализа, на этапе поддерживающего лечения повышение активности репарации ДНК определяло снижение уровня апоптоза лимфоцитов у больных с диссеминированным ЛЧ ТЛ (р=0,00094).
Вместе с этим, несмотря на очевидную тенденцию к стабилизации уровня ДНК-восстановительных процессов, по данным анализа метафазных пластинок лимфоцитов крови, у больных ТЛ после проведения интенсивной терапии уровень хромосомных аберраций в лимфоцитах все еще был высоким. Более того, на фоне терапии ПТП отмечалось достоверное увеличение общего количества клеток с хромосомными нарушениями во всех группах больных (кроме пациентов с инфильтративным ЛЧ ТЛ и КП). Было зарегистрировано увеличение числа лимфоцитов с изменением числа хромосом у пациентов с фиброзно-кавернозным ЛЧ и с инфильтративным ЛУ ТЛ; у больных остальных групп наблюдения увеличивалось количество клеток с изменением структуры хромосом в динамике терапии.
Как уже отмечалось выше, терапия ТЛ опасна в плане повреждающего воздействия химиопрепаратов. Доказано токсическое действие ПТП на хромосомный аппарат клеток и связанное с этим увеличение хромосомных аберраций в лимфоцитах [Ekmekci A., Sayli A., 1995; Masjedi M.R. et al., 2000]. Вероятно, именно этим и обусловливалось обнаруженное по итогам проведенного исследования повышение содержания лимфоидных клеток с хромосомными нарушениями в крови больных ТЛ и значительная активация апоптоза.
По данным литературы, одним из механизмов цитотоксического действия ПТП является резкое усиление ПОЛ в клетках в сочетании с подавлением АОЗ [Гельдберг И.С. и соавт., 2002; Мишин В.Ю. и соавт., 2004; Tudek B. et al., 2006], что опосредует не только активацию ДНК-репаративных реакций, но и их дизрегуляцию (за счет токсического действия АФК на соответствующие ферменты) и накопление хромосомных аберраций. Известно, что при наличии в клетке повреждений хромосом белок р53 запускает программу апоптоза [Sengupta S., Harris C.C., 2005; Суханова Г.А., Акбашева О.Е., 2006], что подтверждается данными статистики. Так, была выявлена положительная корреляция между содержанием annexin V-положительных лимфоцитов и количеством хромосомных обменов у больных с инфильтративным ЛЧ ТЛ (r=0,940; р=0,005) и КП (r=0,893; р=0,016). Кроме этого, была обнаружена положительная корреляция между содержанием лимфоцитов, вступивших в апоптоз, и числом хроматидных разрывов при КП (r=0,867; р=0,025) и хромосомных разрывов при диссеминированном ЛУ ТЛ (r=0,839; р=0,004). Аналогичные результаты были зарегистрированы и при проведении ковариационного анализа: при всех формах ТЛ на этапе завершения интенсивной фазы лечения (исключением являлись только больные с фиброзно-кавернозным ТЛ) независимо от чувствительности микобактерий к ПТП была показана достоверная значимость хромосомных аберраций в индукции апоптоза лимфоцитов (р<0,001).
После полного курса лечения только у больных КП, диссеминированным и фиброзно-кавернозным ЛУ ТЛ уровень лимфоцитов с хромосомными аберрациями оставался на неизменно высоком уровне. При этом у остальных пациентов отмечалось достоверное снижение числа аномальных лимфоцитов, однако оно все еще превышало уровень контрольных значений.
Снижение количества клеток с хромосомными нарушениями при проведении поддерживающего курса химиотерапии, вероятно, определяется не только фактором абациллирования больных и устранением влияния на клетки токсических компонентов МБТ, но и использованием меньшего количества препаратов в схеме лечения. Но, несмотря на это, у больных все же обнаруживались клетки с хромосомными аберрациями, которые, вероятно, элиминировались из организма посредством механизма программируемой гибели, на что указывает положительная корреляционная связь между количеством annexin V-положительных лимфоцитов и числом хроматидных обменов (r=0,752; р=0,019) и хроматидных разрывов (r=0,606; р=0,043) у больных с диссеминированным ЛЧ ТЛ. Важную роль хромосомных аберраций в активации программы апоптоза на этапе поддерживающей терапии демонстрирует также ковариация характеризующих их показателей у пациентов с КП (р=0,02362), фиброзно-кавернозным ЛЧ ТЛ (р=0,00341), инфильтративным ЛУ ТЛ (р<0,00001).
Что касается структурных особенностей, в частности микровязкостных свойств мембраны мононуклеарных лейкоцитов, то на втором этапе обследования регистрировалось снижение коэффициентов эксимеризации пирена при диссеминированном ЛЧ (в моноцитах) и ЛУ (в лимфоцитах) ТЛ относительно изучаемых параметров на долечебном этапе. При остальных формах ТЛ существенных изменений показателей флуоресценции мембраны иммуноцитов относительно показателей до лечения выявлено не было. Снижение флуоресценции мембранного зонда пирен может быть следствием перераспределения мембранных липидов, накоплением продуктов ПОЛ или снижением уровня антиоксидантов [Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е., 1980]. Результаты ковариационного анализа показали, что повышение текучести цитоплазматической мембраны на фоне применения ПТП также оказывает влияние на апоптоз лимфоцитов при инфильтративном и диссеминированном ЛЧ ТЛ (р<0,00001) и программированную гибель моноцитов при инфильтративном ЛУ ТЛ (р<0,00001).
В фазу клинического выздоровления после окончания полного курса химиотерапии у больных ТЛ отмечалась тенденция к нормализации показателей флуоресценции пирена в лимфоцитах и моноцитах у всех больных ТЛ. Нормализации «жесткости» мембраны клеток способствует, видимо, опять-таки фактор снижения токсического действия этиологического фактора и химиопрепаратов на клетки крови. Тем не менее, у больных с инфильтративным ЛУ ТЛ низкая микровязкость мембраны на этапе поддерживающей терапии, также как и после интенсивного курса лечения, все еще оказывала влияние на активность апоптоза моноцитов, на что указывает наличие значимой их ковариации (р=0,00007).
При изучении фосфолипидного спектра мембраны мононукларных лейкоцитов у больных инфильтративным и диссеминированным ЛУ ТЛ после курса интенсивной терапии было зафиксировано повышение содержания лизофосфолипидов (ЛФЛ) в сравнении с предыдущим этапом лечения. На конец второго этапа лечения у всех больных ТЛ уровень СФМ, ФИ, ФХ, ФС и ФЭА в мембране мононуклеаров не отличался от такового у пациентов в острую фазу болезни до начала терапии. Однако у больных с фиброзно-кавернозным ЛУ ТЛ регистрировалось снижение количества СФМ в мембране лимфоцитов и моноцитов в динамике терапии. Кроме этого, у пациентов с диагнозом инфильтративного и фиброзно-кавернозного ЛЧ ТЛ концентрация ФС в мембране клеток оказалась выше, чем на предыдущем этапе лечения. В то же время у пациентов с фиброзно-кавернозным ЛЧ и ЛУ, а также инфильтративным ЛУ ТЛ регистрировалось достоверное снижение процентного содержания ХС при одновременном увеличении концентрации ЭХС в мембране мононуклеаров в сравнении с первым этапом исследования.
Результаты корреляционного анализа показали достоверную положительную связь между уровнем ЛФЛ в мембране мононуклеарных лейкоцитов и количеством annexin V-положительных моноцитов у больных с фиброзно-кавернозным ЛЧ ТЛ (r=0,785; р=0,036). Это можно объяснить тем, что ЛФЛ могут индуцировать повышение проницаемости клеточных мембран для ионов Са2+ [Forehand J.R. et all., 1993], запуская тем самым клеточную гибель.
Известно, что появление ФС в большом количестве в мембране, а особенно на ее внешней стороне является одним из маркеров апоптоза [Жукова О.Б. и соавт., 2006]. Кроме того, ФС индуцирует деконденсацию хроматина и интенсивную межнуклеосомную фрагментацию ДНК. Не исключено, что ФС активирует церамид-опосредованный апоптоз [Tait J.F., 2008; Mirnikjoo B. et al., 2009]. Очевидно, что повышение содержания ФС в мембране клеток у больных ТЛ на фоне интенсивной терапии также приводит к активации апоптотической гибели. При этом содержание ряда структурных компонентов мембраны, по данным ковариационного анализа, оказывало модулирующее влияние на уровень апоптоза мононуклеарных лейкоцитов: 1) в лимфоцитах – снижение уровня ФХ у больных инфильтративным ЛУ ТЛ, повышение содержания ФЭА и уменьшение концентрации СФМ при диссеминированном ЛУ ТЛ (р<0,00001); 2) в моноцитах – снижение содержания СФМ при диссеминированном (р<0,00001) и фиброзно-кавернозном ЛУ (р=0,00002) ТЛ, повышение концентрации ЛФЛ при инфильтративном ЛУ варианте, снижение уровня ФХ при инфильтративной ЛУ форме ТЛ (р<0,00001) и увеличение содержания ФЭА при фиброзно-кавернозном ЛЧ ТЛ (р=0,01635). Роль СФМ в апоптозе лимфоцитов также подтверждалась результатами корреляционного анализа, который показал наличие отрицательной связи между содержанием СФМ в мембране клеток и количеством annexin V-положительных лимфоцитов у пациентов с фиброзно-кавернозным ЛЧ ТЛ (r=-0,810; р=0,026).
После завершения полного курса противотуберкулезной химиотерапии у больных инфильтративным и фиброзно-кавернозным ЛЧ ТЛ отмечалось повышение содержания общих фосфолипидов в мембране иммуноцитов относительно предыдущего этапа лечения. У остальных больных данный показатель оставался в пределах нормальных значений. У пациентов с ТЛ также отмечалась нормализация содержания мембранных ЛФЛ и СФМ в динамике терапии. Концентрация ФИ, ФХ, ФС и ФЭА в мембране клеток больных ТЛ имела тенденцию к нормализации в динамике терапии, но все же отличалась от контрольных значений. На момент окончания поддерживающего курса противотуберкулезной химиотерапии в мембране моноцитов и лимфоцитов у больных ТЛ обнаруживалось снижение содержания ХС и восстановление уровня ЖК, а также повышение концентрации ЭХС в сравнении с этапом до лечения.
Как уже отмечалось выше, в числе факторов, оказывающих влияние на апоптоз лимфоцитов и моноцитов при ТЛ до лечения, определялась концентрация ФС в мембране. Подобный эффект ФС сохранялся и после курса поддерживающей терапии, на что указывала положительная корреляция между содержанием ФС в мембране мононуклеаров и числом annexin V-положительных моноцитов в крови у пациентов с фиброзно-кавернозным ЛЧ (r=0,840; р=0,036) и диссеминированным ЛУ (r=0,882; р=0,008) ТЛ.
По данным ковариационного анализа, было показано влияние повышенной концентрации мембранных ЛФЛ на активность апоптоза лимфоцитов при фиброзно-кавернозном ЛЧ ТЛ (р=0,00241), а ФЭА – при фиброзно-кавернозном ЛУ ТЛ (р<0,00001). В модуляции апоптоза моноцитов также имело большее значение: повышенное количество ФИ – при инфильтративном (р=0,00057) и фиброзно-кавернозном (р=0,00003) ЛЧ ТЛ; пониженный уровень ФС – при фиброзно-кавернозном ЛУ ТЛ (р=0,00005); повышенное содержание ЛФЛ – при фиброзно-кавернозном ЛЧ ТЛ (р=0,00004); низкая концентрация ФХ (р=0,00110) и СМФ (р=0,00062) – при инфильтративном ЛУ ТЛ; повышенный уровень ФЭА – при фиброзно-кавернозном ЛУ ТЛ (р<0,00001).
Анализ данных по изучению активности ПОЛ после проведения интенсивной фазы противотуберкулезной терапии показал, что у всех пациентов с ЛУ ТЛ отмечалось повышение содержания ТБК-а продуктов в мононуклеарах. Одновременно снижалось содержание ДК в моноцитах у всех больных ЛЧ ТЛ, а при диссеминированном ЛЧ ТЛ еще и ТБК-а в сравнении с нелеченными пациентами. В лимфоцитах у больных с ЛЧ вариантом ТЛ регистрировалось также снижение активности СОД и каталазы и, напротив, в случае ЛУ ТЛ – увеличение активности данных ферментов в сравнении с таковой на предыдущем этапе лечения. В группе пациентов с диссеминированным ЛЧ и ЛУ ТЛ, а также с фиброзно-кавернозным ЛУ ТЛ в условиях терапии было выявлено повышение активности СОД в моноцитах. При этом ковариационный анализ показал значимое влияние ТБК-активных продуктов на апоптоз моноцитов крови при диссеминированном ЛЧ ТЛ (р<0,00001).
На момент окончания полного курса поддерживающей терапии у всех обследованных больных ТЛ выявлялось восстановление содержания ТБК-а, ДК, активности каталазы и СОД в лимфоцитах и моноцитах до величины показателей у здоровых доноров. Снижение активности ПОЛ и нормализация активности ферментов АОЗ согласовывались с результатами оценки апоптоза. В ходе ковариационного анализа достоверных связей между этими показателями выявлено не было, что подтверждает отсутствие значимого вклада дестабилизации в системе ПОЛ/АОЗ (в силу восстановления их равновесия) в индукцию апоптоза мононуклеарных лейкоцитов.
При изучении элементного состава лимфоцитов крови у больных ТЛ после проведения интенсивной химиотерапии было обнаружено, что концентрация Na+, K+ и Ca2+ в них оказалась достоверно выше в сравнении с первым этапом исследования. Только при КП регистрировалось снижение уровня Na+ и K+ в лимфоцитах периферической крови по сравнению с этапом до лечения. У пациентов с диссеминированным и фиброзно-кавернозным ЛУ ТЛ уровень K+ в моноцитах в динамике терапии также снижался. В группах больных ТЛ (кроме пациентов с инфильтративным ЛЧ и ЛУ ТЛ) содержание Ca2+ в моноцитах после окончания интенсивной терапии оказалось ниже, чем до начала лечения.
В лимфоцитах после завершения интенсивного курса лечения обращало на себя внимание увеличение концентрации Fe2+, Cu2+ и Mn2+ при всех формах ЛУ ТЛ по сравнению с аналогичными показателями на предыдущем этапе исследования. Кроме этого, в условиях терапии в лимфоцитах у пациентов с инфильтративной формой ЛУ ТЛ возрастало содержание Zn2+ и Al3+, с диссеминированной – Mg2+ и Al3+, а с фиброзно-кавернозной – Zn2+ и Mg2+. У больных с фиброзно-кавернозным ЛЧ ТЛ внутриклеточный уровень Fe2+, Mn2+, Zn2+, Mg2+ и Al3+ оказался также выше, чем до начала терапевтических мероприятий. Обращал на себя внимание факт снижения концентрации Cu2+ и Al3+ у больных КП после курса интенсивной терапии в лимфоцитах.
В моноцитах у большинства больных ТЛ после интенсивного курса лечения регистрировалось снижение концентрации изучаемых элементов в сравнении с уровнем их на предыдущем этапе исследования.
Как уже отмечалось выше, нарушение электролитного состава играет важную роль в модуляции программы апоптоза мононуклеаров крови при ТЛ, что подтверждалось и на втором этапе исследования. На это указывает положительная корреляция между уровнем спонтанного апоптоза лимфоцитов и содержанием натрия в лимфоцитарных клетках у больных с диссеминированным ЛУ ТЛ (r=0,827; р=0,005). Кроме этого, была выявлена положительная корреляционная связь между количеством annexin V-положительных лимфоцитарных клеток и содержанием меди в лимфоцитах у пациентов с инфильтративным ЛУ ТЛ (r=0,811; р=0,049), по всей видимости (как было показано до лечения), в виду того, что ионы меди обладают способностью образовывать хромосомные аберрации и запускать апоптоз. Данный факт подтверждается результатами ковариационного анализа, который показал статистически достоверную связь (р<0,00001) между активностью апоптоза лимфоцитов и содержанием меди в клетках при инфильтративном ЛУ ТЛ. Дополнительным доказательством этому может служить положительная корреляционная связь между уровнем annexin V-положительных лимфоцитов и внутриклеточным содержанием меди у больных КП (r=0,811; р=0,049) и инфильтративным ЛУ ТЛ (r=0,922; р=0,019).
В результате корреляционного анализа была выявлена также положительная связь между активностью апоптоза лимфоцитов и содержанием ионов магния в них у больных с фиброзно-кавернозным ЛУ ТЛ (r=0,710; р=0,048), а также между уровнем annexin V-положительных моноцитов и концентрацией кальция в моноцитарных клетках у больных КП (r=0,729; р=0,047). Активирующее влияние магния на апоптотическую гибель лимфоцитов и моноцитов было зарегистрировано и при проведении ковариационного анализа при инфильтративном лекарственно-чувствительном ТЛ (р<0,00001).
Ионы железа, как уже указывалось ранее, активируют ПОЛ, усиливая тем самым апоптотическую гибель лимфоцитов, что согласовывалось с результатами ковариационного анализа, показавшего достоверное значение повышенной концентрации железа в индукции апоптоза лимфоцитов при фиброзно-кавернозном лекарственно-резистентном ТЛ (р=0,00620). Кроме этого, в ходе анализа ковариаций было обнаружено, что на уровень апоптоза лимфоцитов статистически достоверно влияет увеличение внутриклеточной концентрации следующих катионов: кальция и марганца – при инфильтративном ЛЧ ТЛ (р<0,00001); алюминия – при инфильтративном ЛУ ТЛ (р<0,00001); натрия и марганца – при диссеминированном ЛУ варианте болезни (р<0,00001).
Наряду с этим, окончание интенсивного курса противотуберкулезной химиотерапии характеризовалось разноплановыми изменениями уровня электролитного состава плазмы крови у больных ТЛ в сравнении с аналогичными значениями до начала лечения. По результатам ковариационного анализа оказалось, что в индукции апоптоза лимфоцитов имеют значение снижение плазменной концентрации цинка при инфильтративном ЛЧ ТЛ (р<0,00001) и магния – при фиброзно-кавернозном ЛУ ТЛ (р=0,00005); повышение уровня кальция – при фиброзно-кавернозном ЛЧ ТЛ (р=0,00003) и натрия – при диссеминированном ЛУ варианте (р<0,00001). На активацию апоптотической гибели моноцитов статистически значимое влияние оказывало понижение в плазме содержания цинка (при КП, р=0,04734) и меди (при инфильтративном ЛУ ТЛ, р<0,00001).
После полного курса лечения у больных КП, инфильтративным ЛЧ и фиброзно-кавернозным ЛУ ТЛ отмечалась нормализация концентрации Na+, K+, Ca2+ и Mg2+ в лимфоцитах. Восстановление до нормальных значений содержания Ca2+ в лимфоцитах было зарегистрировано у пациентов с фиброзно-кавернозным ЛЧ и диссеминированным ЛУ ТЛ. При этом у пациентов остальных групп наблюдения, несмотря на достоверное снижение, уровень исследованных элементов в лимфоцитах все еще превышал нормальные значения, а в моноцитах – стремился к нормализации. При проведении корреляционного анализа у больных КП была выявлена положительная связь между уровнем annexin V-положительных клеток и концентрацией кальция в лимфоцитах (r=0,883; р=0,046), вероятно, за счет тех же его эффектов (но менее выраженных), что и на этапе до лечения.
Несмотря на то, что катионный состав мононуклеаров и плазмы крови полного курса специфической противотуберкулезной химиотерапии в целом проявлял тенденцию к восстановлению, он (в свете сохраняющихся отклонений) все еще оказывал свое влияние на апоптотическую гибель клеток. При диссеминированном ЛЧ ТЛ, по данным ковариационного анализа, на состояние программируемой гибели лимфоцитов статистически достоверно влияла повышенная концентрации меди (р=0,00008), магния (р=0,00002) и натрия (р=0,00016) в лимфоцитах, а на апоптоз моноцитов – низкий плазменный уровень цинка (р=0,00603). В индукции апоптоза лимфоцитов у больных фиброзно-кавернозным ЛЧ ТЛ было задействовано пониженное содержание меди в плазме (р=0,00017). Стимулирующее действие на апоптотическую гибель лимфоцитов при инфильтративном ЛУ ТЛ оказывала низкая концентрация цинка (р<0,00001), а моноцитов – калия (р=0,00098) и цинка (р=0,02008) в плазме. У пациентов с диссеминированным ЛУ ТЛ уровень апоптоза мононуклеарных лейкоцитов проявлял зависимость по отношению к пониженному количеству цинка в плазме (р=0,00675).
Таким образом, полученные нами данные позволяют заключить, что при ТЛ вне зависимости от лекарственной чувствительности возбудителя и клинической формы заболевания отмечается активация апоптоза лимфоцитов и моноцитов как до, так и в условиях проведения противотуберкулезной химиотерапии. При этом по результатам исследования можно сделать вывод о том что, что инициация апоптоза происходит через Fas-рецептор, а также по митохондриальному и церамид-опосредованому механизмам. Об участии митохондирального пути в реализации апоптоза свидетельствует накопление кальция в клетках. Наряду с этим, начальный период инфицирования МБТ сопровождается увеличением количества лимфоцитов с хромосомными аберрациями на фоне подавления ДНК-синтеза в лимфоцитах и его активации в моноцитах, нарушением катионного состава мононуклеаров и плазмы крови, изменениями фосфолипидного состава и повышением текучести мембраны, активацией ПОЛ (при ЛЧ ТЛ) (рис. 1, 2). Интенсивная химиотерапия
Mycobacterium tuberculosis