Geum.ru

Инновационный евразийский университет

Вид материалаДокументы
Подобный материал:
1   2   3

Межвидовые пересадки эмбрионов и получение химерных животных. Принято считать, что успешная пересадка эмбрионов может быть осуществлена только между самками одного вида. Это не совсем верно. Известно, что эмбрионы на первых стадиях развития способны выживать и нормально развиваться в течение нескольких дней в организме другого вида.


Ввиду отсутствия эффективных методов культивирования in vitro эмбрионов сельскохозяйственных животных лигатированный яйцевод кролика широко использовался для оценки жизнеспособности эмбрионов после экспериментальной их обра­ботки in vitro, для хранения или транспортировки эмбрионов с последующей обратной трансплантацией в половой тракт своего вида (Boland, 1984).

Для кратковременного культивирования эмбрионов, подвер­гнутых микроманипуляциям, в последние годы широко используют лигатированный яйцевод овцы. Эмбрионы другого вида в этих условиях развиваются с 1—2-клеточной стадии до бластоцисты, затем их пересаживают в матку животного своего вида с последую­щим получением потомства. Allen, Stewart (1978) продемонстрировали возможность развития эмбрионов до рождения по­томства после реципрокных пересадок между лошадью и ослом.

Эти исследования имеют огромный научный интерес. Показано, что такие беременности отличаются как в эндокринологическом, так и в иммунологическом плане от нормальных беременностей ослицы и кобылы, а также от беременностей их помесей (мула и лошака). Кроме того, эти эксперименты открывают возмож­ности для изучения и анализа механизмов, участвующих в ста­новлении беременности. Однако это лишь единичный случай получения потомства после межвидовой пересадки эмбрионов.

В последние годы с развитием техники микроманипуляции на эмбрионах открываются новые перспективы решения этой проблемы на основе получения химерных эмбрионов. Это дости­гается путем объединения бластомеров от двух или более эмбри­онов или введения клеток одного эмбриона в полость бласто­цисты другого эмбриона.

Первые химерные животные были получены путем объедине­ния бластомеров, полученных из эмбрионов одного вида. В экспе­риментах Fehilly et a I. (1984) получили сложные химерные эмбрионы овец путем объединения 2-, 4- и 8-клеточных эмбрионов. Каждый сложный эмбрион состоит из равного числа бластомеров эмбрионов от 2—8 родителей. При этом общее число клеток колебалось от четырех- до восьмикратного увеличения нормаль­ного числа клеток. Эмбрионы вводили в агар и переносили в лигатированные яйцеводы овец для развития до стадии ранней бластоцисты. Из 101 эмбриона, извлеченного из лигатированного яйцевода овцы, нормально развивались 76,2 %, из них были пересажены реципиенту 51. 38 реципиентов принесли 53 яг­ненка. Из 48 ягнят, которые дожили до определения групп крови в 2-месячном возрасте, 36 оказались химерами по данным анализа крови, по внешним признакам или по тем и другим показа­телям. Доля химер была большей среди ягнят, полученных из сложных эмбрионов с нормальным и превышающим нормальное число клеток (25 из 26), чем среди ягнят из сложных эмбрионов с числом клеток меньшим, чем нормальное (II из 22).

Butter et al. (1985) получили химерных овец путем инъекции внутренней клеточной массы, выделенной из эмбрионов доноров, в бластоцисты эмбрионов реципиентов. Зону пеллюцида у бластоцист доноров удаляли путем инкубации в 0,5 %-ной проназе и осторожного пипетирования. Для восстановления их функции после обработки проназой эмбрионы культивировали в течение 3 ч. Затем эмбрионы без зоны пеллюцида культивировали в тече­ние 1 ч в антиовечьей сыворотке к клеткам печени, 3 раза отмывали и помещали в раствор 1:4 (v/v) сыворотки крови морской свинки на 1 ч. Лизированные клетки трофобласта удаляли осторожным пипетированием, а изолированную внутреннюю кле­точную массу вводили, прокалывая инъекционную пипетку через зону пеллюцида и трофобласт бластоцисты реципиента. 17 эмбри­онов были пересажены 9 овцам. Получено 15 ягнят, в том числе 5 ягнят были определены химерами по группам крови и 1 ягненок по внешним признакам. Таким образом, химеризм составил 40% (6/15).

Получены химеры и у крупного рогатого скота (Brem et a!., 1985) путем соединения половинок 5 — 6.5-дневных эмбрионов. 5 из 7 телят, полученных после нехирургической пересадки агрегированных эмбрионов, не имели признаков химеризма. Судя по масти, один теленок был химерой двух пород: бурой швицкой и голштино-фризской. Однако масть бурой швицкой породы доминировала. Анализ крови этого теленка показал присутствие групп крови только от родителей голштино-фризской породы. Другой теленок был неопределенной химерой.

Исследования Church et a!. (1985) показали высокую эффек­тивность получения химер крупного рогатого скота путем объеди­нения морул без зоны пеллюцида. Авторы получили химеры крупного рогатого скота с «двойной мускулатурой» из меченных хромосомной транслокацией эмбрионов и нормальных эмбрионов в целях модификации и использования особенностей роста живот­ных с «двойной мускулатурой». В этих исследованиях показано, что передача химере каждого родительского типа носит случай­ный характер, т.е. потомство может развиваться из клеток, происходящих или от любого эмбриона, или от сочетания эмбрионов. Половина всех химер представляет собой интерсексы.

Наиболее показательно получение химер от объединения частей эмбрионов разных видов животных, например овцы и козы (Fehilly et al., 1984).

Известно, что ни овца, ни коза не способны вынашивать гибридное потомство до родов. Плоды от экспериментальной гибридной беременности у овец и коз к концу 2-го месяца обычно погибают. Пересаженные эмбрионы овец козам и наоборот при­живляются, но беременность не завершается рождением потом­ства.

Во всех случаях межвидовых беременностей непосредствен­ной причиной абортов является нарушение функции плаценты, по-видимому, за счет иммунологической реакции материнского организма на инородные антигены плода.

Эта несовместимость может быть преодолена путем получе­ния химерных эмбрионов. Исследования Fehilly et al. (1984) показали, что бластомеры овцы и козы, заключенные в агар и помещенные на 4—5 сут в лигатированный яйцевод овцы, могут формировать комбинированные бластоцисты, которые являются жизнеспособными и могут развиваться до рождения нормального потомства. В результате объединения по 1-му бластомеру из 4-клеточных эмбрионов овцы и козы получено 17 бластоцист, пересадка которых завершилась получением 7 потомков. Все потомки были похожи в основном на ягнят, но у 3 из них руно имело поперечные валики и лоскуты волос, резко контрастирую­щие с плотно вьющейся шерстью. В другом опыте в результате объединения 8-клеточных эмбрионов с удаленной зоной пеллюцида овцы или козы с разделенными бластомерами 8-клеточного эмбриона другого вида получено 5 потомков, похожих на ягнят, но 2 из них были с отклонениями по шерстному покрову, как и в 1-м опыте; 2 потомка были похожи на козлят с некоторыми отклонениями в шерстном покрове у одного из них. В 3-м опыте после введения внутренней клеточной массы и полярного трофэктодерма от 8-дневных эмбрионов в 8-дневные бластоцисты другого вида получено 6 из 9 потомков, похожих на ягнят, и 3 потомка с внешними признаками химеризма. Только у 1 жи­вотного с внешними признаками химеризма во 2-м опыте были обнаружены группы крови родителей обоих видов. Все остальные животные с внешними признаками химеры имели группы крови овцы, за исключением одного козленка и ягненка в 3-м опыте, которые имели группы крови, соответствующие их виду по внешним признакам.

Таким образом, в этих экспериментах продемонстрирована возможность получения межвидовых бластоцист и их способность развиваться до нормального потомства, которое рождается с признаками овцы и козы. Показано также, что межвидовые эмбрионы могут развиваться до рождения потомства как в орга­низме овцы, так и козы.

Эти эксперименты дают основание предположить, что транс­плантация таких химерных эмбрионов может быть осуществлена и между другими близкими, а может быть и более отдаленными видами животных. Это открывает некоторую надежду на то, что межвидовые трансплантации могут оказать помощь в сохранении исчезающих видов от вымирания, так как обычные пересадки эмбрионов, даже если применяются суперовуляция и глубокое замораживание спермы и эмбрионов, могут дать малую пользу, ибо самки-реципиенты не всегда могут быть в достаточном коли­честве.

Не менее заманчивы перспективы использования техники получения химер для конструирования животных, устойчивых к определенным заболеваниям и с желательными хозяйственными признаками.

Получение клонированных животных путем пересадки ядер эмбриональных клеток в энуклеированные яйцеклетки. Пересадка ядер эмбриональных клеток в энуклеированные поло­вые клетки открывает широкие возможности многократного увеличения числа идентичных потомков или клонов. Реализация этого приема особенно возросла в связи с разработкой нехирурги­ческого метода извлечения эмбрионов у коров. Получение от высокоценной коровы-донора пяти 32-клеточных эмбрионов и пере­садка каждого ядра (бластомера) в энуклеированную яйцеклетку позволяет получать от донора одновременно 160 эмбрионов. При повторной пересадке ядер из полученных «вторичных» эмбрионов открываются возможности получения неограниченного числа потомков от выдающихся самок.

В 1952 г. Бриггс и Кинг впервые осуществили пересадку ядер клеток на амфибиях и показали, что ядра из ранних эмбрио­нальных клеток сохраняют способность к дальнейшему развитию после пересадки их в энуклеированные яйцеклетки. Они также установили, что ядра из эмбрионов на более поздней стадии развития не дробились, если пересаживались в энуклеированную яйцеклетку, так же как и ядра из менее развитых эмбрионов. Это обусловлено дифференциацией эмбриональных клеток, кото­рая проявляется на стадии перестройки мидбластулы. Это та стадия, при которой эмбрионы начинают продуцировать свою собственную РНК, до этого времени они реализовали материн­скую транскрипцию (Newport и Korschner, 1982 а, б).

Illmense и Норре (1981) сообщили о первой успешной пере­садке ядер млекопитающих и получении потомства на мышах.

Эффективная пересадка ядер на сельскохозяйственных животных впервые была проведена Willadspn (1986). Ом применял сле­дующую технологию пересадки. Неоплодотворенные яйцеклетки извлекал у овец через 30—33 ч после обработки их ХГ в начале охоты. Тонкой стеклянной иглой он делал разрез зоны пеллюцида над полярным тельцем неоплодотворенной яйцеклетки и помещал ее в фосфатную среду с цитохалазином Б (5 мкг/мл). Через 1 ч после начала культивирования отсасывал пипеткой полярное тельце и окружающую его цитоплазму. Таким образом удавалось разделить примерно 90 % яйцеклеток на 2 части с интактными клеточными мембранами, каждая из которых содер­жала примерно половину цитоплазмы. Цитологический анализ этих половинок ооцитов показал, что 75 % тех половинок, которые были удалены с полярным тельцем, содержали хромо­сомы на стадии метафазы II («ядерные» половинки яйцеклеток), тогда как другие половинки из тех же ооцитов не содержали ядерных структур («энуклеированные» половинки яйцеклеток). Одиночные бластомеры из 8- или 16-клеточных эмбрионов вводили под зону пеллюцида, содержащую энуклеированную или ядерную половинку яйцеклетки. Слияние ядра с цитоплазмой клетки проводили с помощью вируса Синдая или электрослиянием. В первом случае слияние наступало в 50 % случаев в течение 4 ч, а во втором — в 90 % случаев в пределах I ч.

Те эмбрионы, в которых произошло электрослияние, были помещены в фосфатный буфер при комнатной температуре. Затем их заключали в агар и пересаживали в лигатированные яйцеводы овец (Willadsen, I979). Через 4,5 5,5 дней эмбрионы извлекали и оценивали их развитие. Из числа эмбрионов, полученных после пересадки пронуклеусов в энуклеированные яйцеклетки, стадии бластоцисты достигали 33,3 % при слиянии вирусом Синдая и 42,1 —48,3 % при электрослиянии, а после пересадки в «ядерные» яйцеклетки и применении электрослияния только 5,3- 11,4%. В этом эксперименте пересадка 3 из 4 бластоцист сопровождалась рождением потомства. Все 3 ягненка были получены из эмбрионов, в которых бластомер из 8-клеточного эмбриона был пересажен в энуклеированную половинку неоплодотворенной яйцеклетки. В другом эксперименте было получено несколько беременностей от пересадки эмбрионов- из энуклеированных яйцеклеток с введен­ными в них бластомерами из 16-клеточных эмбрионов. Таким образом, можно заключить, что бластомеры в 16-клеточном эмбрионе овцы остаются тотипотентными.

В опытах Prather el al. (1987) бластомеры из двух 32-кле­точных эмбрионов коров пересаживали в энуклеированные ооцисты после созревания in vivo или in vitro путем электрослияния. Когда пересаживали бластомеры из эмбрионов на более поздних стадиях (16—32-кдеточные против 2 8-клеточных), то эффективность электрослияния была ниже (р< 0,01). Эмбрионы, культи­вируемые после слияния in vitro, развивались до 4—б-клеточной стадии, тогда как культивируемые in vivo (в лигатированном яйцеводе овцы) развивались до стадии морулы или бластоцисты после 4 или 5 дней. Ооциты, извлеченные через 36 ч после начала охоты и используемые в качестве реципиентов ядер эмбриональных клеток, чаще достигали стадии морулы или бластоцисты, чем ооциты, созревшие in vitro или извлеченные через 48 ч после начала охоты (20 % против 7,8 % и 6,7 % соответственно; р <0,02). Получено 7 беременностей после нехирургической пересадки 19 таких эмбрионов 13 телкам на 6—8-й день после охоты. У 2 телок родились живые телята.

Таким образом, в опытах на овцах и крупном рогатом скоте показано, что ядра из дробящихся эмбрионов на ранних ста­диях развития могут быть репрограммированы к развитию подобно пронуклеусу эмбриона на стадии зиготы. Результаты этих экспериментов дают основание предполагать, что с повышением эффективности техники пересадки ядер эмбриональных клеток в энуклеированные яйцеклетки можно получать множественные копии из единичного эмбриона.