Инновационный евразийский университет

Вид материала

Документы

Подобный материал:

• Инновационный евразийский университет, 488.5kb.
• Инновационный евразийский университет, 532.1kb.
• Инновационный евразийский университет, 610.7kb.
• Инновационный евразийский университет, 239.44kb.
• Инновационный евразийский университет, 1053.63kb.
• Инновационный евразийский университет, 549.05kb.
• Инновационный евразийский университет, 512.08kb.
• Инновационный евразийский университет, 401.19kb.
• Инновационный евразийский университет, 472.82kb.
• Инновационный евразийский университет, 401.87kb.

Оогенез (овогенез)—процесс образования в корковом веществе яичника из оогоний клеток зачаточного (генеративного) эпителия женских половых клеток. Оогонии постоянно размножаются, увеличиваются в размерах, превращаясь в ооциты, а затем в яйцеклетки.

На ранних стадиях в ооцитах отчетливо выражен клеточный центр, расположенный у ядерной мембраны. Он представлен одной или двумя гранулами, центриолями и саркоплазмой. Последняя окружена пластинчатым комплексом (комплекс Гольджи), вокруг которого имеется плотное скопление митохондрий. Образовавшийся из оогоний ооцит 1 порядка интенсивно растет; происходит резкое его увеличение в объеме за счет «малого» синтеза белка в клетке (первая фаза) и в дальнейшем за счет так называемого «большого» синтеза из окружающего фолликулярного эпителия (вторая фаза). На поздних стадиях оогенеза митохондрии и комплекс Гольджи рассеиваются по цитоплазме и клеточный центр становится неразличимым. Идет интенсивное накопление питательных веществ в плазме и увеличение клетки в размерах. Принято различать две фазы ядерной активности в процессе оогенеза— генеративную и вегетативную. Первая обусловлена тем, что ядро как носитель генетической информации (ДНК) должно передать эту активность последующим поколениям клеток и индивидов. Вторая связана с участием ядра в процессах обмена веществ яйцеклетки. Большая роль в процессах синтеза, происходящих в ядре, принадлежит ядрышку и цитоплазме. Особенно высока активность ядрышка во время оогенеза. Набор хромосом в ядре диплоидный, так как одна половина их получена от отца, другая —от матери. При митозе они, как правило, не сходятся, но в ооците 1 порядка они сближаются вплотную и как бы сшиваются— первая фаза — лептотенный период. В очередной диплоидный период идет взаимный обмен молекулами ДНК. Далее в пахитенную стадию парные хромосомы начинают заметно утолщаться и укорачиваться — образуются спаренные тетрады, которые затем в стадию диакинеза начинают постепенно отходить друг от друга. От клетки отделяется первое полярное тельце. Все изменения протекают на уровне ооцита 1 порядка; на этом заканчивается стадия роста яйцеклетки и начинаются процессы ее созре­вания.

Стадия созревания яйцеклетки характеризуется двумя последовательными процессами, в результате которых вместо имевшихся ранее тетрад в ядрах образуются диады. В результате первого деления из ооцита 1 порядка образуются две клетки. В одну из них отходит незначительная часть цитоплазмы, а в другую — вся остальная. Образовавшаяся маленькая клетка называется первичным направительным или полярным тельцем. В дальнейшем оно делится на две клетки, которые не развиваются. Вторая относительно большая клетка называется ооцитом 2 порядка. При ее делении появляется одна маленькая клетка — второе направительное тельце — и большая клетка, которая содержит гаплоидное число хромосом и представляет собой сформированную гамету. На этом процесс оогенеза заканчивается и образуется яйцооида, период созревания которого продолжается после выхода яйцеклетки из яичника и завершается во время оплодотворения.

Яйцеклетка, как почти все клетки животного, имеет цитоплазматическую мембрану и окружена межклеточной жидкостью, которая для нее является внешней средой. Жизнь клетки — ее ядра, цитоплазмы и включений — поддерживается постоянным обменом с межклеточной жидкостью. В этом процессе большая роль отводится клеточной мембране, состоящей главным образом из белков и фосфолипидов. Обмен веществ происходит через мембрану под действием разных факторов — диффузии, осмоса, активного транспорта с образованием в мембране комплексных соединений. Процесс поступления вещества в клетку является чрезвычайно сложным и обусловлен такими силами, как градиент концентрации (диффузия и осмос), градиент потенциала (диссоциация ионов) и активная функция мембран, с химическими компонентами которой транспортируемое вещество образует различные соединения. Все это обеспечивается прежде всего энергией аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ), синтезирующейся главным образом в митохондриях.

Все процессы, связанные с оогенезом, протекают в фолликуле, формирующемся одновременно с развитием яйцеклетки.

Формирование фолликулов, рост ооцитов. Процесс формирования фолликулов взаимосвязан с ростом и развитием ооцитов. В примордиальном, или первичном, фолликуле до 10 разрозненных фолликулярных клеток прилегает к ооциту. Такой фолликул имеет диаметр 25—35 мкм, а ооцит — 24—30 мкм. С ростом ооцита фолликулярные клетки приобретают кубическую, а затем ци­линдрическую форму и в то же время из однослойного эпителия превращаются в многослойный. Эти клетки, прилегающие к прозрачной оболочке, располагаются радиально и формируют лучистый венец, играющий трофическую функцию в процессах созревания яйцеклетки. Когда в фолликуле образуется до 800 клеток, окружающих ооцит, диаметр его достигает 600 мкм, а ооцита — 70—140 мкм.

У лошадей зрелый граафов пузырек достигает 3—4 см в диа­метре, у коров—1,5, у свиньи — 0,8—1,1 см.

Половой цикл у самок — это безусловнорефлекторный, цепной, периодически повторяющийся процесс. Характеризуется он комплексом физиологических и морфологических изменений в различных функциональных системах в период от одной овуляции до другой. Весь цикл — единый биологический процесс, в разные периоды которого отмечаются характерные изменения внешних поведенческих реакций и морфофункциональные сдвиги в поло­вой и других системах организма. Стадийный характер этих про­цессов обосновал П. А. Студенцов (1953). Он подчеркнул, что внешние поведенческие реакции самок при возбуждении направлены на поиск самца и проявляются комплексом манипуляций, связанных с осеменением. В этот период животное отказывается от корма, у него снижается молочная продуктивность, изменяются и даже исчезают условнорефлекторные реакции, происходят специфические, свойственные этому периоду, изменения в яичниках и других органах размножения. Наиболее отчетливо морфологические изменения отмечают в половых органах самок грызунов. По картине влагалищного мазка этих животных можно легко определить четыре фазы эстрального цикла.

Фаза межтечковая (диэструм). В яичниках мелкие фолликулы и крупные желтые тела. Рога матки уменьшены, маточные железы атрофичны. Во влагалищном мазке небольшое количество эпителиальных клеток с четко выраженными ядрами, значительным числом лейкоцитов и слизи.

Фаза предтечковая (проэструм) характеризуется ростом и увеличением яичников, гиперемией полового аппарата, разрастанием желез слизистой оболочки матки, утолщением эпителия. Во влагалищном мазке эпителиальные клетки овальной формы с большим ядром. Лейкоциты отсутствуют.

Фаза течки (эструс). В яичнике крупные фолликулы, быстрый рост которых чаще завершается овуляцией. Маточные железы усиленно функционируют, выделяя слизь. Во влагалищном мазке много ороговевших безъядерных клеток, так называемых чешуек. Ядерные эпителиальные клетки и лейкоциты отсутствуют.

Фаза послетечковая (метоэструм) характеризуется восстановительными процессами, то есть инволюцией половых органов, уменьшением их в размере, ослаблением гиперемии, отторжением разросшегося эпителия. Во влагалищном мазке много лейкоцитов, некоторое количество ороговевших чешуек, а также ядерные клетки.

Половой цикл у сельскохозяйственных животных существенно отличается от цикла у грызунов. В период интенсивного развития фолликулов в яичниках у сельскохозяйственных животных и прежде всего у коров проявляются такие взаимосвязанные процессы, как течка, проявление внешних признаков общего полового возбуждения, половая охота и овуляция.

Все эти реакции сочетаются в определенной последовательности, когда начало или развитие одного из них становится концом другого, а в целом весь комплекс признаков проявляется одновременно. Продолжительность и включение всех звеньев этого сложного, единого цепного рефлекса имеют видовые и индивидуальные особенности.

Течка — истечение слизи из половых органов в результате усиленного функционирования слизистых трубчато-альвеолярных маточных желез и эпителиальных клеток слизистой оболочки половых путей. Образовавшаяся слизь вытекает через открытый канал шейки матки во влагалище, а оттуда через половую щель наружу. В начале течки она прозрачная, затем становится более вязкой и выделяется из половой щели в виде шнура. К концу охоты слизь становится густой и липкой. При течке наблюдают набухание и покраснение слизистой оболочки преддверия влагалища и влагалищной части шейки матки.

Половые губы (вульва) в это время отечные, на непигментированной коже отчетливо заметно их покраснение.

Общие внешние признаки полового возбуждения характеризуются беспокойством животного, снижением аппетита, у коров уменьшаются удои, молоко становится солоноватым, приобретает свойства, присущие молозиву, при кипячении свертывается. Во время прогулки они прыгают на других животных. В этот период у коров хорошо выражен «обнимательный» рефлекс. Телки в период полового возбуждения прыгают на других телок или коров и не допускают на себя прыжков других животных.

Половая охота характеризуется положительной половой реакцией на самца. Самка стремится приблизиться к самцу и принимает позу для полового акта, допускает обнюхивание и сад­ку самца. У телок наиболее активные внешние поведенческие реакции, обеспечивающие сближение их с производителем, выражены во второй половине охоты. К концу охоты положительная реакция на самца у большинства самок ослабевает.

Овуляция — процесс разрыва зрелого фолликула и выхода из него яйцеклетки. Вместе с яйцеклеткой во время овуляции выделяется фолликулярная жидкость щелочной реакции (рН до 8), обладающая бактериостатическими и бактериолитическими свойствами.

Во время овуляции усиливается приток крови к яичнику и яйцепроводу, повышается напряжение стенки яйцепроводов и воронки, сокращаются их мышечные волокна. Воронка яйцепровода расширяется, приближается к яичнику и охватывает его. Все это обеспечивает необходимые условия для поступления яйцеклетки и фолликулярной жидкости в яйцепровод.

При недостаточном или неполноценном кормлении (например, при недостатке йода), при плохих условиях содержания животных, отсутствии моциона и других погрешностях фолликул нередко не разрывается, а из поврежденных сосудов в его полость изливается кровь (лютеинизация без овуляции), что препятствует оплодотворению животного.

Образование желтого тела. После разрыва фолликула и выведения из него яйцеклетки создается полость, которая заполняется сгустком крови, вытекающей из сосудов, главным образом внутреннего слоя соединительнотканной оболочки. (Образовавшийся сгусток способствует остановке кровотечения.) Затем кровяной сгусток прорастает фолликулярным эпителием и соединительной тканью и образуется своеобразная сеть, в клетках которой откладывается желтый пигмент — лютеин. Это и будет желтое тело. Функционирует оно как железа внутренней секреции, выделяя прогестерон, стимулирующий пролиферативные процессы в матке и вызывающий ее гипертрофию и гиперплазию во время беременности. Если беременность наступила, то желтое тело увеличивается в размере и функционирует на протяжении всего плодоношения у всеядных, жвачных и плотоядных, а у кобыл оно на 5—6-м месяце начинает постепенно рассасываться и к концу беременности становится совсем маленьким. У коров же обратное развитие желтого тела происходит в конце беременности и завершается к концу послеродового периода. Оно называется желтым телом беременности. Во второй половине беременности функция желтого тела ослабевает и при отдавливании его аборта не наступает, беременность продолжается.

В том случае, если оплодотворение не наступило, желтое тело существует недолго, рассасывается на протяжении одного полового цикла и называется циклическим желтым телом. У коров оно образуется в первые 3—4 дня после овуляции и достигает наибольшего развития к 14-му дню, после чего рассасывается. У кобыл подобное наблюдают через 7—15 дней. При нарушении условий кормления и содержания животных желтое тело не рассасывается, его называют задержавшимся или персистентным. Все это приводит к нарушению воспроизводительной функции животных, торможению полового цикла и бесплодию.

Видовые особенности полового цикла. Чередование и продолжительность половых циклов у разных видов животных различны. У одних животных (корова, свинья, кобыла и др.) они повторяются часто, регулярно на протяжении всего года. Таких животных называют полициклическими. У моноциклических животных (собака и дикие животные) половые циклы проявляются 1—2 раза в год. Они отмечаются во время полового сезона, то есть в период времени, в который наиболее выражена половая активность животного. Он зависит от климатических условий, уровня кормления и содержания животных. При плохом содержании и отсутствии моциона сезонность осеменений и отелов наблюдается и у полициклических животных (корова и свинья).

У коровы половой цикл в среднем длится 21 день с колебаниями 18—22 дня. Течка у этих животных продолжается 3— 5 дней, иногда больше. При наступлении полового возбуждения у коровы отмечается беспокойство, снижается аппетит и удой, несколько повышается температура тела (на 0,8—1,2°), увеличивается число ударов пульса и дыхательных движений, а также несколько возрастает в крови количество лейкоцитов.

У буйволиц половой цикл сходен с половым циклом коровы как по длительности, так и по характеру отдельных признаков. Хотя буйволица и полициклическое животное, но у нее отчетливо проявляется половой сезон с марта по сентябрь.

У овцы половой сезон продолжается в зависимости от климатической зоны — с августа по март. Половой цикл у них длится в среднем 16—17 дней. Половое возбуждение характеризуется беспокойством, блеянием, снижением аппетита. Течка кратковременная (24 ч) и клинически слабо выражена. Пришедшие в охоту овцы группами бегают за бараном, стучат ногами, допускают садку барана-пробника.

Половой цикл у коз 20—21 день. По другим признакам напоминает цикл овцы. Половой сезонности у коз нет.

У свиньи половой цикл продолжается 20—21 день, проявляется после отъема поросят на 5—9-е сутки. Однако у отдельных животных это отмечают и в период подсоса. При половом воз­буждении свиноматка мечется по станку, пытается из него выскочить, визжит, обнюхивает других свиней, прыгает на них и допускает прыжки на себя, отказывается от корма. Течка у этих животных сопровождается отечностью половых губ, покраснением слизистой оболочки преддверия и влагалища, раскрытием шейки матки, усиленной секрецией желез преддверия, влагалища и матки, истечением тягучей слизи, к которой иногда примешивается кровь. Половая охота длится 43—44 ч и проявляется в том, что свиноматка приближается к хряку и допускает садку. Овуляция у взрослых свиней происходит в среднем через 24 ч, а у молодых свинок — через 30 ч после начала охоты. Известно, что у свиньи лопается 15—18 фолликулов, поэтому овуляция может продолжаться по мере их разрыва в течение 3—6 ч.

Половой цикл у кобылы в среднем 20—21 день с колебаниями от 10 до 37 дней. В период течки слизистая оболочка преддверия и влагалища гиперемирована, шейка матки открыта и из нее вытекает слизь, вначале тягучая, малопрозрачная, затем она становится жидкой (но сохраняет вязкость) и мутноватой. При половом возбуждении кобыла проявляет беспокойство, резко реагирует на различные раздражители, не подчиняется ездовому, плохо поедает корм. У кобыл половая охота продолжается двое суток, а у отдельных животных — до 12 дней и характеризуется положительной реакцией на жеребца.


3. Суперовуляция и синхронизация половой охоты


Из числа доноров сразу исключают коров с узким анусом, наличием эндометрита к 35 дню после отела, фолликулярными кистами, а также животных, имеющих незавершенную инволюцию матки (обратное развитие) к этому же сроку.

Отбирают животных с нормальным течением послеродового периода, у которых на протяжении 60 дней после отела зарегистрированы две овуляции и хотя бы одна выраженная охота.

Коров, стабильно дающих качественные эмбрионы, ставят на особый учет для ежегодного использования в качестве доноров.

Выявление коров-доноров проводится непосредственно в хозяйствах (на фермах) с использованием пробной гормональной обработки и извлечения эмбрионов.

Окончательный отбор проводят после установления реакции коров на введение гонадотропных гормонов для вызывания полиовуляции.

При отсутствии реакции на гормональную обработку корову в доноры не переводят.

Коров, прошедших разовую гормональную обработку и давших биологически полноценные эмбрионы за первую операцию, переводят в группу коров-доноров.

Самки млекопитающих рождаются с несколькими десятками или сотнями тысяч половых клеток. Большинство из них постепенно погибает.

Установлено, что от гормонально обработанных доноров можно получить в среднем в 10 раз больше беременностей, чем от необработанных животных.

Гормональную обработку с целью индуцирования реакции гиперовуляции начинают через 50-60 дней после отела. Перед этим контролируют состояние половой системы коровы с помощью ректогенитального обследования.

Наличие выраженной охоты и хорошо сформированного желтого тела в одном из яичников на 8-14 день цикла являются показанием для начала гормональной обработки.

Полиовуляцию вызывают введением гипофизарного препарата фолликулостимулирующего гормона ФСГ-супер.

Совместное применение гормональных средств с другими биологически активными веществами повышают выход качественных эмбрионов.

Крупный рогатый скот. Индукцию суперовуляции у самок крупного рогатого скота проводят обработкой гонадотропинами, фолликулостимулирующим гормоном (ФСГ) или сывороткой крови жеребой кобылы (СЖК), начиная с 9-14-го дня полового цикла. Через 2-3 дня после начала обработки животным вводят простагландин Ф_2а или его аналоги, чтобы вызвать регрессию желтого тела.

Существуют различные схемы гормональной обработки коров и телок с целью индукции полиовуляции. Наиболее широко в этих целях используют СЖК в дозе 2,5-3,0 тыс. ИЕ.

Известно, что период полужизни эндогенного СЖК у кобыл, установленный гистеректомией, составляет около 6 дней, а при использовании радиоиммунологического метода выявлено наличие двух комплексов в СЖК- один с периодом полужизни 40,0-51,2 ч, второй- 118,4-129,4 ч.

Это свойство СЖК позволяет ограничиться однократным введением его животным при вызывании суперовуляции и вместе с тем может иметь отрицательный эффект вследствие длительного действия на функцию яичников не только в период, предшествующий охоте, но и после нее. Это приводит к нарушению нормального уровня половых гормонов и особенно их соотношения в организме животных.

Для устранения этого нежелательного свойства СЖК применяют антитела к гонадотропину с целью увеличения числа и улучшения качества эмбрионов, полученных при суперовуляции.

Введение во время охоты коровам, обработанным 3000 ИЕ СЖК на 10-й день цикла и 37,5 мг ПГФ₂ на 12-й день, моноклональных антител или овечьей антисыворотки к СЖК уменьшает число неовулировавших фолликулов (1,7 и 2,7 против 6,5 фолликула в контроле) и повышает оплодотворяемость (92 и 80% против 60% в контроле).

Уровень эстрогенов в крови коров резко понижался вскоре после введения антисыворотки и оставался низким до извлечения эмбрионов, тогда как у контрольных животных уровень эстрогенов не снижался до базального уровня во время охоты и снова увеличивался после охоты.

Для стимуляции полиовуляции у коров наряду с СЖК применяют гипофизарные гонадотропины. С этой целью используют очищенный ФСГ отдельно или в сочетании с ЛГ.

В отличие от СЖК препараты ФСГ и ЛГ вводят не однократно, а дважды в день в течение 4-5 сут.

Согласно этой схеме охота наступает через 40-50 ч после первой инъекции ПГФ_2а. Осеменение проводят через 12 и 24 ч после наступления охоты. Эмбрионы извлекают нехирургическим способом через 7-7,5 дня после осеменения

В связи с тем, что сроки овуляции у гормонально обработанных животных увеличиваются, изменяется и технология их осеменения. Первоначально рекомендовалось многократное осеменение коров с использованием нескольких доз спермы.

Обычно вводят 50 млн живых сперматозоидов в начале охоты и через 12-20 ч осеменение повторяют. Более детальное изучение этого вопроса показало, что высокая эффективность оплодотворения может быть достигнута и при использовании одной дозы семени, если ее вводить через 24 ч после начала охоты.

Как видно из таблицы применение одной дозы семени через 24 ч после начала охоты у коров обеспечивает такой же уровень оплодотворяемости (87,2% против 78,0 и 90,0%) и выход эмбрионов, пригодных для пересадки (65,1% против 60,6 и 75,7%), как и осеменение двумя дозами семени через 12 и 24 ч после начала охоты. При использовании дорогостоящей спермы от высококачественных быков-производителей этот фактор имеет большое значение.

Овцы. Принципы вызывания суперовуляции у овец те же, что и у крупного рогатого скота: СЖК или ФСГ вводят в конце лютеиновой фазы полового цикла (на 11-13-й день), в лютеиновую фазу цикла- вместе с обработкой простагландином или во время окончания обработки прогестагенами. СЖК вводят в дозе 20-45 ИЕ/кг массы тела, или до 2000 ИЕ на одну овцу.

Например, аналог простагландина простенол в дозе 100 мкг вводят между 4-м и 13-м днями полового цикла через 24-72 ч после обработки СЖК. Охота наступает через 2-4 дня после обработки простагландином. ФСГ предпочтительнее вводить в уменьшающейся дозе по сравнению с обработкой равными дозами.

В опытах И. Когни и др. (1985) во время случного сезона у овец синхронизировали охоту обработкой ФГА (40 мг в течение 12 дней) и за 24 ч до удаления пессариев вводили ФСГ два раза в день в течение двух дней в постоянной (4,4—4,4 мг) или уменьшающейся дозе (6,5—3,2 мг). Число овуляций было зна­чительно выше (р < 0,05), когда ФСГ вводили в уменьшающей­ся дозе (10,1+6,4 против 6,5+3,6).

Характерной особенностью для овец является резкое сниже­ние оплодотворяемости при осеменении после вызывания суперовуляции. Осеменение суперовулировавших овец непосредственно в рог матки, например с помощью лапароскопа, при­мерно в 5 раз повышает оплодотворяемость по сравнению с осеменением традиционным методом.

Свиньи. У свиней, являющихся многоплодными живот­ными, большое число эмбрионов может быть получено без гор­мональной обработки. Однако число овуляций у свиней может быть увеличено после гормональной обработки.

Лошади. Еще не разработаны надежные методы индук­ции суперовуляции у кобыл, однако получение достаточного числа эмбрионов у них не составляет большого труда ввиду простоты нехирургического извлечения и повторного получения эмбрионов в каждый половой цикл.

Синхронизация половых циклов доноров и реципиентов

Для успешного проведения трансплантации эмбрионов рекомендуется готовить на одного донора 2-3 реципиента.

Работу по предварительной синхронизации половых циклов начинают за один цикл до извлечения эмбриона и проводят по следующим схемам.

Схема 1. Если овуляция у донора за цикл до пересадки наступила одновременно или чуть раньше (до трех суток), чем у потенциального реципиента, то в момент установления овуляции у донора в подготавливаемом цикле реципиенту следует ввести внутривенно 2000 МЕ хорионического гонадотропина. Овуляция у реципиента должна наступить через 36-48 часов после инъекции. Асинхронность циклов донора и реципиента при этом составит 48 часов.

Схема 2. Если овуляция наступила у донора раньше, чем у реципиента на 3-10 суток, то в первый день проявления охоты у донора, реципиенту следует ввести внутримышечно препарат простагландина Р-2а. Затем в день наступления овуляции у донора реципиенту вводят внутривенно 2000 МЕ хорионйческого гонадотропина.

Схема 3. Если за цикл до пересадки овуляция у реципиента наступила раньше, чем у донора на 2-6 дней, то через 6 дней после овуляции у донора и донору, и реципиенту вводят внутримышечно препарат простагландяна Р-2а и через 5 суток - внутривенно 2000 МЕ хорионического гонадотропина.

Охоту у доноров и реципиентов определяют самцом-пробником ежедневно. При выявлений охоты ежедневно проводят двукратные ректальные исследования состояния яичников.

При наличии в яичнике донора фолликула третьей стадии ее осеменяют или случают с намеченным по подбору производителем. Интервал между повторными случками либо осеменениями свежей спермой составляет 24 часа, при осеменении криоконсервированной спермой - 12 часов. Осеменение донора прекращают после овуляции.

Одновременно с осеменением донора проводят синхронизация полового цикла реципиентов. Степень синхронности половых функций донора и реципиента находится в пределах от 24 до 72 часов.


4. Трансплантация эмбрионов


Трансплантация эмбрионов крупного рогатого скота является новым биотехнологическим приемом в селекции, основной эффект которого в увеличении количества потомков по материнской линии. Метод трансплантации эмбрионов включает следующие приемы: вызывание полиовуляции у доноров, извлечение эмбрионов, их сохранение и пересадка реципиентам.

Основным назначением метода на данном этапе является получение быков-производителей и маток воспроизводящих групп, а также сохранение генофонда.

Непременными условиями для проведения работ по трансплантации являются полноценное кормление и содержание животных, хорошая организация воспроизводства стада, а также наличие квалифицированных специалистов. На современном этапе развития метода трансплантации эмбрионы крупного рогатого скота можно получать как от коров постоянного донорского стада, так и от разовых доноров, извлекая эмбрионы не ранее 60 дней после отела, без вывода животных из основного стада, непосредственно в племзаводах.

Отбор животных в доноры проводит комиссия, в которую должны входить специалисты ветеринарной и племенной службы и специалисты по трансплантации эмбрионов.

Генетическое превосходство животного определяется ценностью его предков, длительностью хозяйственного использования, собственной продуктивностью и продуктивностью его потомства, а также соответствием стандарту (по типу) породы. При подборе коров-доноров для использования в целях сохранения генофонда локальных пород руководствуются задачами сохранения всего генетического разнообразия.

Донорами эмбрионов могут быть коровы со следующими признаками:

- клинически здоровые, без признаков нарушения обмена веществ (ожирение, дистрофия и т.д.) и реагирующие полиовуляцией при гормональной обработке;

- с межотельным периодом в предыдущих лакгациях 360-380 дней;

- с сервис-периодом 70-90 дней;

- проявлением первой охоты до 50 дней после отела;

- легкостью отела и не осложненным течением послеродового периода;

- индексом осеменения 1,2-1,5;

- нормальным состоянием матки и яичников.

Отбор доноров по селекционным признакам.

Для получения ценного племенного материала необходимо матерей-доноров будущих производителей отбирать в стадах ведущих племенных хозяйств.

Отбор коров в доноры по состоянию половой системы и прогнозирование полиовуляции.

Из числа доноров сразу исключают коров с узким анусом, наличием эндометрита к 35 дню после отела, фолликулярными кистами, а также животных, имеющих незавершенную инволюцию матки к этому же сроку.

Отбирают животных с нормальным течением послеродового периода, у которых на протяжении 60 дней после отела зарегистрированы две овуляции и хотя бы одна выраженная охота. Коров, стабильно дающих качественные эмбрионы, ставят на особый учет для ежегодного использования в качестве доноров. При хорошей эмбриопродуктивности и выдающихся селекционных признаках коровы-донора можно планировать двух-трех разовое получение эмбриона.

Требования к коровам-донорам быков воспроизводящей группы:

- высокая молочная продуктивность с учетом средней продуктивности за все лактации с выходом молочного жира и белка;

- наличие данных о происхождении не менее, чем по трем рядам предков, принадлежащих к высокопродуктивному семейству, перспективной линии (желательно, чтобы отец коровы-донора имел племенные категории А, Б);

- крепкая конституция и экстерьер с оценкой не ниже 8 баллов;

- чашеобразная или ваннообразная форма вымени;

- интенсивность молокоотдачи - 1,8-2,0 кг/мин;

- живая масса – не ниже стандарта породы;

- возраст (наиболее желательный) - от 3 до 6 отелов;

- достоверность происхождения по группам крови.

Основным требованием отбора коров в доноры по физиологическому состоянию является отсутствие у них после отельных осложнений. Поэтому наибольшее значение приобретают профилактика и раннее лечение после отельных осложнений, которые необходимо осуществлять в сухостойный и послеродовой периоды.

Организация сухостойного периода коров, отобранных в доноры.

Нарушения процесса родов и послеродового периода часто связаны с причинами, возникающими задолго до отела. Поэтому необходимо начинать профилактику затрудненных отелов и после отельных осложнений у доноров с сухостойного периода важнейшего в воспроизводительном процессе.

При составлении рационов для доноров руководствуются нормами и рационами кормления ("Нормы и рационы кормления сельскохозяйственных животных", М., 1995).

Для профилактики после отельных осложнений коров обрабатывают эмульсией витамина А и антисептика стимулятора Дорогова фракция 2 (АСД-Ф2). Непосредственно перед применением препараты АСД-Ф2 и витамина А смешивают, тщательно взбалтывают до получения однородной эмульсии и вводят коровам за 30 дней до предполагаемого отела трехкратно внутримышечно с интервалом 5 дней. Однократная доза витамина А - 7-10 см" (500-800 тыс. ИЕ), АСД-Ф2 - 1,7-2.0 см' (0,003-0,004 см³ на 1 кг массы животного) ("Наставление по применению витамина А и АСД-Ф2 для профилактики задержания последа у коров", 1988г.).

Коров в сухостойный период необходимо зимой выпускать на прогулку в загоны или устраивать активный моцион до 2 км, а летом содержать на пастбище.

Организация содержания и кормления коров-доноров а послеродовой период и при получении эмбрионов.

Для предупреждения после отельных осложнений, своевременного возобновления циклической активности яичников и восстановления матки на 2-3 день после отела проводят фармако-профилактику с внутриматочным введением антимикробных препаратов. Наиболее эффективным в этот период является применение антибиотиков широкого спектра действия в сочетании с йодистыми препаратами.

Профилактика предполагает систематическое наблюдение за животными. С 10 дня после отела состояние яичников и матки коровы определяют методом ректального исследования с интервалом 5-7 дней. Каждую неделю (до появления охоты) проводят витаминизацию - 1 млн. ИЕ витамина А. При первых признаках эндометрита необходимо сразу же начинать интенсивное лечение.

К 50 дню после отела половая система донора должна придти в норму. Животное должно проявить охоту с полноценной овуляцией и четкими внешними признаками.

Для получения наибольшей эмбриопродуктивности необходимо организовать индивидуальное нормированное кормление доноров с учетом изменения живой массы и молочной продуктивности, потребности в питательных веществах по месяцам лактации.

Нехирургическое извлечение эмбрионов не требует специального операционного помещения. Его можно с успехом проводить непосредственно на ферме, с соблюдением правил асептики.

Обычно извлечение эмбрионов проводят на 7-8 день после осеменения донора (день охоты принимают за 0 день).

Перед извлечением эмбрионов проводят ректальное исследование донора для определения состояния половой системы и уровня реакции полиовуляции. При этом обращают внимание на величину, консистенцию яичников, подсчитывают количество желтых тел, неовулировавших фолликулов. Точно определить количество желтых тел при средней и хорошей реакции донора методом ректальной пальпации невозможно, поэтому уровень реакции устанавливают приблизительно.

Все инструменты и среды, используемые для извлечения эмбрионов, должны быть стерильными.

Извлечение эмбрионов

Корову-донора фиксируют в станке. Для снятия моторики кишечника и расслабления матки вводят эпидурально 5 см³ 2% раствора новокаина. Хвост животного отводят в сторону и фиксируют в этом положении, чтобы он не мешал при работе. Прямую кишку очищают от фекальных масс, обмывают водой наружные половые органы, высушивают и тщательно протирают бумажной салфеткой.

Технолог аккуратно вводит катетер во влагалище до упора в шейку матки и под ректальным контролем проводит катетер через шейку матки в тело, продвигает его в правый (или левый) рог до тех пор, пока не почувствует, что конец катетера упирается в изгиб рога. Ассистент освобождает резьбовой зажим стилета, и технолог, вытаскивая стилет, продвигает катетер дальше в рог матки. После того, как катетер введен глубоко в рог матки, ассистент окончательно вынимает стилет и накачивает в манжетку катетера 10-15 см³ воздуха.

Среду для извлечения эмбрионов вводят в рог матки отдельными порциями с помощью пластикового шприца емкостью 50-60 см³. Когда жидкость введена, технолог, легко массируя рог пальцами, всасывает жидкость обратно в шприц. Жидкость из шприца аккуратно сливают по стенке в стерильную емкость или эмбриональный фильтр. На промывание одного рога расходуется 200-500 см³ среды.

После промывания полости одного рога матки технолог вводит стилет в катетер, отодвигает катетер назад в тело матки, переводит его в другой рог и повторяет все манипуляции.

После извлечения последней порции жидкости из второго рога проводят санацию матки. Для этого, не выпуская из манжетки воздух, к катетеру присоединяют шприц с 40 см³ среды, содержащей антибиотики широкого спектра действия или сани­рующие препараты, используемые в среде для извлечения эмбрионов (ГАМП или полиген из расчета 300- 600 мкг на 1 см³ среды).

При правильно проведенном извлечении потери жидкости, как правило, не превышают 50 см³.

Катетер и стилет после работы тщательно промывают про­точной водой с нейтральным моющим средством, ополаскивают дистиллированной водой, обрабатывают 70° спиртом и высушивают.

Отбор реципиентов и подготовка к эмбриопересадкам.

Пересадки эмбрионов проводят в хозяйствах, благополучных по инфекционным заболеваниям, с хорошей организацией производства, обеспечивающей сбалансированное кормление и оптимальный уровень воспроизводства стада.

Для пересадок используют как коров, так и телок. Коров в качестве реципиентов используют не ранее, чем через 50-60 дней после не осложненного отела, не старше 7 лет, клинически здоровых, с регулярными половыми циклами нормальной продолжительности. Телки должны быть случного возраста, не старше 22 месяцев, средней упитанности, с живой массой, соответствующей стандарту породы, ни разу не осеменявшиеся. При отборе реципиентов проводят тщательное ректогенитальное обследование с целью исключения особей с неразвитыми половыми органами или наличием патологии.

Реципиентов отбирают после спонтанной охоты или син­хронизации охоты простагландинами. Ярко выраженная охота при наличии всех признаков и стадий является непременным условием пригодности животного к пересадке эмбрионов. Разница в синхронности полового цикла коровы-донора и реципиента не должна превышать 24 часов.

В день пересадки эмбрионов проводят ректальное исследование состояния половых путей и яичников реципиентов. Матка и шейка матки должны быть в норме по размерам, консистенции, подвижности. Любые отклонения (огрубление стенок матки, отечность, увеличение размеров и др.) являются противопоказанием для эмбриопересадки. При исследовании яичников оценивают состояние желтого тела по размеру, форме и консистенции, а также соответствию его развития стадии полового цикла. Хорошего качества желтое тело должно иметь основание не менее 1,5 см в диаметре и ясно выраженную головку. При задержке развития желтого тела, отсутствии его, а также при наличии фолликула, кисты или другой патологии яичника пересадку эмбриона реципиенту не проводят.

После пересадки эмбриона реципиента оставляют на привязи в течение суток. Кормление и содержание реципиентов осуществляют в обычных условиях, как для стельных животных, не допуская травмирования и стрессовых ситуаций.

В группах реципиентов ведут постоянное наблюдение за возможным проявлением повторной охоты. На 60-90 дни после пересадки животных-реципиентов ректально исследуют на наличие стельности.

Оттаивание эмбрионов и подготовка к пересадке.

Пайету с эмбрионом быстро извлекают из сосуда Дьгоара, выдерживают на воздухе 15 секунд, затем горизонтально погружают в водяную баню (24...28°С) на 10-15 секунд (до полного оттаивания содержимого пайеты). 11осле оттаивания насухо протирают поверхность пайеты фильтровальной бумагой и, обрезав кончик ее со стороны, противоположнойпробке, вставляют этот конец в микроаспиратор или пластиковый пшриц (1 см³). Затем обрезают другой, свободный конец пайеты. Под микроскопом контролируют выход эмбриона из пайеты в стерильную чашку Петри. Обнаруженный эмбрион переносят в маленькую чашку Петри с раствором для удаления криопротектора.

Применяют два метода удаления криопротектора.

1 метод (трехступенчатый)

1 ступень: 6,6% глицерин + 10,3% (0,ЗМ) сахароза- 5 минут;

2 ступень: 3,3% глицерин + 10,3% (0,ЗМ) сахароза - 5 минут;

3 ступень: 10,3% (0,ЗМ) сахароза - 10 минут. Затем эмбрионы промывают в трех порциях среды культивирования.

2 метод (одноступенчатый)

34,2% (1,ОМ) сахароза - 8 минут.

Затем эмбрионы промывают в среде культивирования.

Процесс удаления криопротектора проводят под микроскопом во избежание потери эмбриона.

После удаления криопротектора оценивают эмбрион по качеству и помещаютего в пайету для пересадки. Время от оттаивания эмбрионадо его пересадки не должно превышать 50 минут.

Заправка эмбрионов в пакеты для пересадок.

Эмбрионы заправляют в 0,25 см³ пайеты. Заправку осуществляют с помощью пластикового шприца (1 см ) или микроаспиратора по следующей схеме (рис. 2): столбик среды культивирования (1 см), столбик воздуха (1 см), столбик среды культивирования (1 см), столбик воздуха (1 см), среда с эмбрионом, столбик воздуха (1 см), столбик среды культивирования (1 см), столбик воздуха (1 см), столбик среды культивирования (1 см). Перенос эмбриона из среды культивирования в пайету производят под небольшим увеличением микроскопа.

Французские пайеты перед заправкой укорачивают, для чего пыж продвигают на 7-8 мм вглубь пайеты и аккуратно острыми ножницами отрезают 4-5мм кончика пайеты со стороны пыжа. Отечественные пайеты закупоривают стеклянным шариком.

После заправки пайеты маркируют. Для этого с помощью фломастера на кончик пайеты со стороны пыжа вдоль ее оси наносят точки и длинные черточки.Одна точка - единица, две - двойка, три - тройка, четыре - четверка, длинная черточка (6-8 мм) - пятерка, длинная черточка и точка - шестерка и т.д. Если пайет больше десяти, то лучше каждый десяток маркировать фломастерами разного цвета.

Подготовка инструмента к пересадкам.

Пересадка эмбрионов осуществляется с помощью катетера для пересадок, снабженного стерильным одноразовым чехлом. Катетер хранится в цилиндрическом пластиковом футляре, предохраняющем его от загрязнения и механических повреждений.

Непосредственно перед пересадкой пайету с эмбрионом заправляют в катетер, надевают на катетер стерильный одноразовый чехол и фиксируют его стопорной шайбой или замком. Заправленный катетер помещают в санитарный чехол.

Пересадка эмбрионов.

Животных-реципиентов фиксируют в станке, делают сакральную анестезию 2% раствором новокаина или вводят препарат, расслабляющий маточную мускулатуру (например, "Хане-гиф"). Технолог по пересадкам очищает прямую кишку от фекальных масс, тщательно вытирает сухой бумажной салфеткой наружные половые органы животного, при необходимости их обмывают теплой водой и насухо вытирают. Технолог вводит катетер во влагалище и под ректальным контролем проводит его через шейку в тело матки, направляя в рог, ипсилатеральный яичнику с желтым телом. Убедившись, что катетер введена достаточную глубину (в верхнюю треть рога), технолог, плавно надавливая на поршень катетера, выталкивает жидкость с эмбрионом в полость рога матки и осторожно извлекает катетер из матки.


5. Криобанк гамет и эмбрионов


В период охлаждения эмбрионов до минусовых температур в определенный момент начинается льдообразование. Происхо­дит это в первую очередь в среде, окружающей клетку. По мере понижения температуры нарастает количество экзоцеллюлярного льда, что сопровождается повышением концентрации солей в оставшемся растворе. В результате возникает разница осмо­тического давления в экзоцеллюлярной и эндоцеллюлярной фазах. Процесс уравнивания обеспечивается осмотической реакцией клетки, отдающей воду во внеклеточную среду.

При определенном режиме охлаждения, с известной величи­ной начального объема воды в клетке, а также ее площадью поверхности, степенью проницаемости мембран и температурным коэффициентом проницаемости можно вычислить объем клеточ­ной воды на данном этапе замораживания как функцию мину­совых температур.

Если клетку охлаждают достаточно медленно, то она по ме­ре понижения температуры будет постоянно терять воду до количества, равного по осмотическому давлению экзоцеллюлярному раствору. Затвердевание раствора наступает в эвтектиче­ской точке температурной кривой. Эвтектическая кристаллиза­ция растворов электролитов заметно тормозится добавлением глицерина, диметилсульфоксида (ДМСО), способных связывать воду и понижать тем самым точку эвтектики. Соли при этом остаются в водном растворе в виде сложного комплекса и при дальнейшем понижении температуры затвердевают в стекловид­ную массу.

При охлаждении клетки в быстром режиме ее система не успевает регулировать осмотическое равновесие, и по мере по­нижения температуры содержимое клетки оказывается в усло­виях растущего переохлаждения. В определенный момент по­чинается кристаллизация воды внутри самой клетки. Такое эндоцеллюлярное образование льда рассматривается во многих работах как первичный фактор, обусловливающий гибель клет­ки во время замораживания.

Метод сохранения эмбрионов включает в себя очень медлен­ное охлаждение, замораживание и оттаивание. Однако техно­логия предусматривает и быстрое оттаивание и две ступени замораживания, которые находятся на стадии разработки и могут значительно упростить процедуру замораживания.

Цель глубокого замораживания клеток и тканей — остано­вить их метаболизм в обратимой степени, с сохранением струк­туры, временным прекращением жизнедеятельности. Основа криобиологической техники замораживания эмбрионов млеко­питающих— сохранение изолированных клеток в суспензиях (спермиев, эритроцитов, лимфоцитов и различных линий куль­тивируемых клеток).

Принципы сохранения биообъектов основаны на криобиоло­гической характеристике этих объектов, и поэтому нет необхо­димости полностью касаться других типов клеток. Тем не менее, для разных типов и колоний клеток требуются различные ре­жимы глубокого замораживания.

В некотором смысле поздние морулы и бластоцисты — ми­ниатюрные организмы, клеткам которых, несмотря на их подо­бие, присуща в определенной степени дифференциация относителъно их расположения и функции.

Жизнеспособность эмбрионов зависит не только от выживае­мости отдельных клёток, но и от сохранности их отдельных структур. Существование зоны пеллюцида, перивителлинового пространства, бластополости и различия в распределении экстрацеллюлярной жидкости могут в дальнейшем осложнить крио­биологию этих развивающихся систем. Эмбрионы мышей могут служить в качестве основной модели по изучению выживаемо­сти зародышей после охлаждения, замораживания, хранения и оттаивания.

У эмбрионов крупного рогатого скота на разных стадиях развития в большинстве случаев ухудшается выживаемость по­сле охлаждения до температуры ниже 15°С. Возрастание толе­рантности при низких температурах совпадает, тем не менее, с компактностью и бластуляцией эмбрионов.

Эти наблюдения способствовали разработке классического низкотемпературного метода замораживания эмбрионов круп­ного рогатого скота и овец, сущность которого состоит в насы­щении при комнатной температуре в три этапа температуры в среде диметилсульфоксида (ДМСО) 0,5 M и 1,0 М по 10 мин в каждом и 1,5 М растворе в течение 20 мин, затем быстрое охлаждение до —6°С со скоростью 1 ⁰С в мин, принудительная кристаллизация и дальнейшее замораживание до 36⁰С со скоростью 0,3 °С в мин, затем 0,1 ⁰С и мни до -60°С, после чего биообъект переносят в жидкий азот на хранение.

Медленная скорость замораживания (0,1 ⁰С в мин) в проме­жутке от —36° до —60 °С теоретически позволяет максималь­но ограничить дегидратацию отдельных бластомеров, и это дает возможность избежать или видоизменять образование внутри­клеточного льда. Такая скорость замораживания вызывает не­обходимость и медленного оттаивания в том же интервале. Слишком быстрое оттаивание приводит к повреждению клеток из-за неадекватности времени, свойственной для регидратации, к возрастанию осмотического стресса (внутриклеточная гипер­тония) и повреждению клеточных мембран и органоидов.

Вода в клетках остается в виде стекловидной формы обра­зований, снижая сохранность эмбрионов при —196 °С. Эти на­блюдения согласуются с известной теорией о льдообразовании в клетках при замораживании. После температуры —35 °С и дальнейшем быстром охлаждении эмбрионов до —196 ⁰С они способны, сохранять жизнеспособность при условии быстрого оттаивания. Однако если начать медленное оттаивание при температуре —100 ⁰С, то жизнеспособность эмбрионов, помещен­ных в нормальные условия, теряется при —60 и —50° С. Это и есть критическое состояние биообъектов, при котором происходят процессы девитрификации воды, ведущие к обра­зованию внутриклеточных кристаллов льда, убивающих эм­брионы.

При этом наблюдается рекристаллизация и в окружающей эмбрион среде, состоящей из криопротектора ДМСО и среды Дюльбекко. Вышедшая из клетки вода не успевает выравняться по концентрации солей с окружающим раствором. В определен­ный момент вся поверхность эмбриона покрывается чистой во­дой, что может быть причиной рекристаллизационных процес­сов, наблюдаемых на внешней стороне оттаиваемого зародыша. Среда с эмбрионами находится в ампуле, помещаемой в охладитель, температура которого понижается с заданной ско­ростью. При достижении точки замерзания среды она, как пра­вило, замерзает не сразу. Происходит некоторое переохлажде­ние, обусловленное отсутствием в среде кристаллизационных центров, на которых могли бы образовываться кристаллы. Лишь при охлаждении на несколько градусов ниже точки замерзания начинается внезапное образование кристаллов. Высвобождаю­щееся при этом кристаллизационное тепло быстро поднимает температуру от точки кристаллизации до точки замерзания, что создает большой перепад температуры между средой и охлади­телем и приводит снова к быстрому охлаждению среды на не­сколько градусов от уровня температуры охладителя.

Можно избежать переохлаждения среды, если при достиже­нии точки замерзания или сразу же по прохождении ее появ­ляются кристаллизационные центры, для чего в раствор вводят небольшой кристаллик льда. Этого можно достигнуть и путем сильного внешнего охлаждения стенки ампулы, например, об­жатием пинцетом, предварительно охлажденным в жидком азоте. При этом вначале образуется кристаллизационное обла­ко, а затем—кристаллизация по всей ампуле.

Точка замерзания разбавленного раствора ниже 0°С, и тем ниже, чем выше концентрация разведенных веществ. При за­мерзании раствора выделяется чистая вода в виде кристаллов льда, растворившиеся же вещества по-прежнему остаются в растворе. С вымерзанием части воды концентрация растворив­шихся веществ в оставшейся жидкой фазе возрастает, в связи с чем точка замерзания жидкой фазы понижается. При даль­нейшем охлаждении оставшаяся чистая вода вымерзает и все больше возрастает концентрация солей в оставшейся жидкой фазе, пока, наконец, раствор полностью не замерзнет на эвтек­тической точке.

Эмбрионы, пригодные для замораживания (отличного, хорошего и удовлетворительного качества), эквилибрируют в криозащитной среде с глицерином.

Применяют одноступенчатое и многоступенчатое насыщение эмбрионов криопротектором. При отличном качестве эмбрионов используют одноступенчатый метод. При наличии повреждений у эмбрионов предпочтительнее использовать многоступенчатый метод, как более щадящий.

Для приготовления криозащитных сред используют среду культивирования (фосфатно-солевой буфер Дюльбекко с 15% фетальной сыворотки крови крупного рогатого скота или 0,4% бычьего сывороточного альбумина) с добавлением необходимого количества глицерина. Готовят ряд растворов с постепенно увеличивающейся концентрацией глицерина и выдерживают эмбрион в каждом растворе определенное время. Последний раствор содержит 1,5М глицерина. Он является криозащитной средой, в которой замораживают эмбрионы.

Двухступенчатое насыщение. Отобранные для замораживания эмбрионы переносят из среды культивирования в 0,75М раствор глицерина, а затем помещают в 1,5М раствор, выдерживая в каждом по

Одноступенчатое насыщение. Эмбрионы отличного качества из среды культивирования помещают сразу в 1,5М раствор глицерина и выдерживают в нем 10 минут.

Для замораживания эмбрионов используют французские или отечественные пайеты емкостью 0,25см.

Заполняют пайеты так же, как, и для пересадки эмбрионов. После заправки пайеты запаивают. Маркировка пайет может осуществляться различными способами:

- в пайету со стороны пыжа вставляют цветную пластмассовую пробку, на которой тонким маркером записывают дату извлечения, номер пайеты, номер и кличку донора, код пункта трансплантации, номер и кличку быка;

- на пайете тонким маркером записывают дату извлечения, номер пайеты, номер и кличку донора, код пункта трансплантации, номер и кличку быка;

- пайету вставляют в специальный прозрачный пластиковый контейнер и закупоривают металлической пластинкой с выбитым на ней кодовым пятизначным номером, который заносят в специальный регистрационный журнал, где дана его расшифровка, а именно: дата извлечения, кличка донора, стадия развития и опенка качества, а также способ замораживания. В дальнейшем в журнал вносят информацию об использовании эмбриона.

Заполнение, закупоривание и маркировку пайет необходимо закончить за 10 минут, в течение которых эмбрион эквилибрируется в среде с 1,5М глицерином. Временной интервал от помещения эмбриона в среду с криопротектором до начала охлаждения не должен превышать 30-40 минут.

Замораживание эмбрионов в замораживателе ЗЭМ Харьковского СКТБ с ОП ИПКнК.

Замораживатель ЗЭМ (замораживатель эмбрионов мобильный) состоит из регулирующего блока и камеры. С помощью регулирующего блока можно задать одну из двух программ автома­тического охлаждения камеры.

Программа 1

- стабилизация температуры 20°С±2°С;

- охлаждение со скоростью 1 град/мин от 20°С до -7°С;

- стабилизация температуры -7°С (1-2 минуты);

- охлаждение со скоростью 0,3 град/мин от -7°С до -32°С;

- стабилизация температуры -32°С (30 минут).

Программа 2

- стабилизация температуры 20°С+2°С;

- охлаждение со скоростью 1 град/мин от 20°С до 0°С;

- стабилизация температуры 0°С (1-2 минуты);

- охлаждение со скоростью 0,3 град/мин от 0°С до -32°С;

- стабилизация температуры -32°С (30 минут).

Перед работой цилиндрическую камеру погружают в сосуд Дьюара Х-34Б или СДС-5. Охлаждение осуществляется автоматически по одной из выбранных программ.

Подготовку замораживателя к работе проводят по прилагаемой к нему инструкции. После заполнения и закупорки пайет их помещают в рабочую камеру замораживателя маркировкой вверх и включают программу охлаждения. По окончании программы замораживания пайеты извлекают из рабочей камеры и быстро переносят в сосуд Дьюара с жидким азотом на хранение. Полный цикл замораживания эмбрионовв ЗЭМе занимает около двух часов.

Замораживание эмбрионов в программируемом замораживателе ЭМБИ-К.

Замораживатель ЭМБИ-К состоит из камеры и электронного регулирующего блока. Камеру устанавливают на сосуд Дьюара СДС-5. На один цикл замораживания расходуется 200-250 г жидкого азота. Температура в камере устанавливается и поддерживается с помощью электронного блока, который управляет работой электромагнитного клапана, регулирующего подачу жидкого азота. Охлаждение эмбрионов происходит в камере, заполненной 96° этиловым спиртом.

Электронный регулирующий блок позволяет задавать различные режимы охлаждения в следующих пределах:

- устанавливаемая температура кристаллизации от 0 до -10°С (в зависимости от состава криозащитной среды);

- устанавливаемая предельная температура охлаждения —20...40°С;

- устанавливаемая скорость снижения температуры с колебаниями, не превышающими 0,2 град/мин в интервалах: 0-0,55 град/мин; 0,55-1,2 град/мин; 1,2-3,0 град/мин.

Подготовку замораживателя к работе и замораживание эмбрионов проводят согласно инструкции. Пайеты в обязательном порядке запаивают (во избежание проникновения спирта внутрь пайеты) и для маркировки наносят надписи на пластмассовые пробки, вставленные в пайеты.

В процессе охлаждения температуру спирта в камере контролируют с помощью ртутного (марки ТЛ-4 ГОСТ 215-73) или толуолового (марки ТЛ-15 ТУ 25-11-964-74) термометров.

Полный цикл замораживания в устройстве ЭМБИ-К продолжается, в зависимости от выбранного режима охлаждения, от 35 минут до 1,5 часов.

Низкотемпературное хранение эмбрионов.

Пайеты с эмбрионами до использования хранят в сосудах Дьюара, заполненных жидким азотом.

Пайеты для хранения помещают в специальные контейнеры. Кодовый номер наносят на алюминиевую пластинку.

Контейнер представляет собой прозрачную полипропиленовую трубку с наружным диаметром 4 мм, внутренним - 3,5 мм и длиной 180мм. Один конец контейнера сужен до 1,5 мм. В качестве маркировочного элемента используют алюминиевую пластинку размером 32х4х1мм. На нее нанесен кодовый номер в виде колонки цифр, букв и их комбинаций. Размер пластинки позволяет нанести 5-6 легкочитаемых знаков. Таким образом, можно промаркировать десятки тысяч пайет с эмбрионами.

Контейнер с пайетой размещают в канистре сосуда Дьюара. Канистра разделена на 6 пронумерованных секций, в каждой из которых помещают 5-6 контейнеров. Канистра делится на секции дюралюминиевой шайбой с пружинящими лепестками, надежно удерживающими ее в верхней части канистры.

После окончания процесса замораживания пайеты с эмбрионами из камеры замораживателя переносят в теплоизолированную емкость, заполненную жидким азотом. Туда же помещают для предварительного охлаждения необходимое количество контейнеров.

У пайеты с эмбрионом удаляют промежуточную маркировочную пробку и быстро (2-3 секунды) переносят ее внутрь охлажденного контейнера, стараясь как можно меньше держать пайету вне жидкого азота. Промаркированные контейнеры быстро перекладывают в сосуд Дьюара, размещая их в канистрах.

Информацию о размещении контейнеров в канистрах, а также о самой пайете заносят в регистрационный журнал или при наличии компьютера в базу данных. В дальнейшем по имеющемуся на контейнере кодовому номеру можно получить всю информацию о его размещении и содержимом.

Необходимо систематически проверять уровень азота. Он не должен снижаться более чем на половину объема сосуда.


6. Клонированные и химерные животные


Микроманипулирование с дробящимися эмбрионами домашних животных представляет двусторонний интерес: подтверждение или установление основных механизмов развития и дифференциации зародышей и использование для практических полей потенци­альных возможностей развития и регуляторной способности эмбрионов.

Возможность микроманипулирования с отдельными эмбриона­ми была продемонстрирована около 50 лет назад.

Pincus (1936) вводил одиночные бластомеры из 2-кл-точного эмбриона кролика в яйцевод ложнобеременной крольчихи, в результате эмбрионы нормально развивались с дифференциа­цией их клеток до стадии бластоцисты, но уменьшенного размера. Затем было получено потомство у кроликов и мышей из 2-клеточных эмбрионов с разрушением одного бластомера путем прокола его иглой.

В последние 20 лет проведено много микрохирургических операций на эмбрионах мышей: удаление зоны пеллюцида, разделение бластомеров, агрегация с удаленной зоной пеллюцида эмбрионов и бластомеров, инъекция одиночных или агрегатированных клеток в полость ранней бластоцисты и т.д. Однако отсутствие удовлетворительных методов культивирования микроманипулированных эмбрионов in vitro в сочетании с неспособ­ностью эмбриональных клеток выживать in vivo после разрыва или удаления зоны пеллюцида до недавнего времени тормозили использование микрохирургической техники для детального анали­за эмбрионального развития млекопитающих.

Функция зоны пеллюцида в период раннего развития эмбрио­на, по-видимому, определяется необходимостью предотвратить рассыпание бластомеров, прямой контакт с другими эмбрионами и чужеродными клетками, лейкоцитами, сперматозоидами и облег­чить прохождение эмбриона через яйцевод. За исключением некоторых видов животных, в частности кролика, зона пеллюцида несущественна для продолжения нормального развития in vivo после того, как полностью закончится компактизация морулы. Для нормального развития эмбрионов более раннего возраста in vivo зона пеллюцида должна не только присутствовать, но и быть относительно интактной.

Решение этой задачи было найдено путем использования агара для защиты in vivo эмбрионов с нарушенной зоной пеллю­цида (Willadsen, 1979). Заключение в агар, который практически нерастворим в половом тракте самки и закупоривает любые отверстия в зоне пеллюцида, позволяет эмбриональным клеткам выживать и развиваться in vivo. Техника заключения эмбрионов с нарушенной зоной пеллюцида в агар следующая. Зону пеллю­цида удаляют и бластомеры отделяют в группы клеток или разделяют. Выделенные бластомеры инъецируют в пустую зону пеллюцида. После заполнения периветеллинового пространства сывороткой крови овцы эмбрион вводят в небольшой цилиндр агара, который помешают в более крупный. Последний вводят в лигатированный яйцевод овцы до образовании ранней бластоцисты. Затем цилиндр агара извлекают, эмбрион освобождают от него и пересаживают реципиенту.

При заключении эмбриона в агар он должен быть полностью покрыт им, так чтобы свободно перемещались клетки внутри эмбриона в период развития и взаимодействия их между собой. Цилиндр агара должен быть небольшим по объему, чтобы его можно было легко ввести в яйцевод, и устойчивым к разрушению.

Для культивирования заключенных в агар эмбрионов в каче­стве временных реципиентов использовали кроликов в фоллику­лярной фазе цикла. Однако выживаемость интактных эмбрионов овец, коров и особенно свиней значительно уменьшается, если период культивирования эмбрионов этих животных в яйцеводе кролика более 3 дней. Поэтому в качестве временных реципиен­тов стали испытывать овец. Наблюдения показали, что в лигатированном яйцеводе овцы создаются благоприятные условия и для развития эмбрионов коровы и свиньи вплоть до вылупившейся бластоцисты. Поэтому лигатированный яйцевод овцы был исполь­зован как стандартная схема для культивирования микромани­пулироваиных эмбрионов всех видов домашних животных. В первых опытах использовали овец в качестве временных реципиентов только с синхронизированной охотой с донором. Однако впоследствии было показано, что яйцевод анэстральной овцы вполне удовлетворяет этой цели. Эта техника была широко использована для получения однояйцовых близнецов и химерных животных у всех основных видов домашних животных.