Автореферат разослан 2008 г
| Вид материала | Автореферат |
- Автореферат разослан 2008, 441.97kb.
- Автореферат разослан 2008, 287.64kb.
- Автореферат разослан февраля 2008, 524.47kb.
- Автореферат разослан 15 июля 2008, 318.27kb.
- Автореферат разослан 21 мая 2008 года, 603.72kb.
- Автореферат разослан 2008, 369.45kb.
- Автореферат разослан 25 сентября 2008, 237.94kb.
- Автореферат разослан 18 декабря 2008, 250.07kb.
- Автореферат разослан марта 2008, 380.31kb.
- Автореферат разослан " " 1996, 264.76kb.
На правах рукописи
ДОНЧЕНКО НИКОЛАЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ
УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СРЕДСТВ И МЕТОДОВ
ДИАГНОСТИКИ И ПРОФИЛАКТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА
КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
16.00.03 – ветеринарная микробиология, вирусология,
эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология
16.00.04 – ветеринарная фармакология с токсикологией
А В Т О Р Е Ф Е Р А Т
диссертации на соискание ученой степени
доктора ветеринарных наук
Новосибирск 2008
Работа выполнена в ГНУ Институт экспериментальной ветеринарии
Сибири и Дальнего Востока СО Россельхозакадемии (ИЭВСиДВ)
Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор
Смолянинов Юрий Иванович
Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор
Ноздрин Григорий Антонович,
доктор ветеринарных наук, профессор
Колычев Николай Матвеевич,
доктор медицинских наук, профессор
Краснов Владимир Александрович
Ведущая организация: ФГОУ ВПО Казанская государственная академия
ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана
Защита состоится «___» ________ 2008 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д.006.045.01 при Государственном научном учреждении Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО Россельхозакадемии по адресу: 630501, Новосибирская область, Новосибирский район, п. Краснообск, ГНУ ИЭВСиДВ.
С диссертацией можно ознакомиться в ЦНСХБ СО Россельхозакадемии.
Автореферат разослан «___» _________ 2008 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета Г.М. Стеблева
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Наукой и практикой достигнуты определенные успехи в борьбе с туберкулезом сельскохозяйственных животных, однако, эта инфекция остается одной из ведущих, наиболее сложных и экономически значимых в инфекционной патологии.
Научно обоснованное планирование противоэпизоотических мероприятий невозможно без их экономического анализа. В публикациях по экономическим аспектам туберкулеза животных в основном приведены данные, полученные в условиях ведения животноводства до 1990 г., и касаются они частных вопросов экономических потерь, затрат на оздоровительные мероприятия и их экономической эффективности. Комплексные исследования, раскрывающие экономическое значение туберкулеза в современных условиях сельскохозяйственного производства, отсутствуют. Между тем, во многих развитых странах в рамках целевых программ искоренения туберкулеза животных давались комплексные экономические оценки, во многом способствующие эффективному проведению противоэпизоотических мероприятий. Так, например, экономическое обоснование ликвидации туберкулеза крупного рогатого скота было дано в США (I. Steele, A. Ranney, 1958), Швейцарии (G. Fluckiger, 1965), Франции (M. Brochart, 1979), Венгрии (L. Denes, 1981), Италии (G. Ghilardi, 1982).
Основополагающими в системе противотуберкулезных мероприятий являются аллергическая диагностика с точным учетом показаний размера кожной складки, а также бактериологическая, включающая культивирование микобактерий на питательных средах. В связи с этим создание новых ветеринарных приборов для прижизненной диагностики туберкулеза, а также питательных сред, отличающихся высокими ростовыми свойствами, представляется весьма актуальным.
Современное направление диагностики туберкулеза – молекулярно-генетическое (ПЦР), бурно развивающееся как в медицине, так и ветеринарии. Актуальным при этом является разработка экспресс-методов индикации и идентификации возбудителя туберкулеза из биоматериала животных и дифференциации патогенных микобактерий от атипичных (А.Н. Шаров, В.А. Седов, 1998; А.Н. Шаров с соавт., 2000, 2003; М.С. Калмыкова и др., 2006; K. Moller et al., 1998; M. Hassan-King et al., 1999; T.-M. Zhang, G.-H. Mei, 1999; Zhao Jin-Rong et al., 1999).
В процессе разработки оздоровительных мероприятий при туберкулезе животных был проведен ряд исследований по применению туберкулостатика изониазида как в чистом виде, так и в различных формах, однако, результаты их не нашли широкого применения ввиду низкой эффективности и нетехнологичности введения в организм, в связи с чем актуально конструирование новых препаратов, исключающих указанные недостатки (Н.Н. Зинина, 1989; Д.Д. Новак, Н.Н. Зинина, 1995; Д.Н. Мингалеев, М.А. Сафин, 2004, 2005).
Другим направлением специфической профилактики туберкулеза животных является иммунизация вакциной БЦЖ, но ее эффективность, как показала практика, невысока. Усиление иммуногенности вакцины БЦЖ связано с сочетанным использованием различных иммуномодулирующих препаратов (А.С. Донченко, 1989; Г.П. Протодьяконова, 1990; И.Д. Александров, 1995–2000; И.П. Хабузов, 1999). Изыскание новых иммуномодуляторов предопределяет актуальность продолжения исследований по повышению протективных свойств вакцины БЦЖ, а также использование ее для выявления анергичных к туберкулину животных.
Цель и задачи исследований. Цель исследований – усовершенствовать методы и средства диагностики и специфической профилактики туберкулеза крупного рогатого скота.
Задачи исследований:
– дать ретроспективный анализ эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота в Российской Федерации;
– разработать плотную и жидкую питательные среды для культивирования микобактерий на основе минерального комплекса растительного происхождения;
– усовершенствовать методику постановки ПЦР для дифференциации микобактерий на основе геномного полиморфизма;
– разработать электронный кутиметр для оценки аллергических реакций на внутрикожное введение животным туберкулинов;
– изучить особенности фармакокинетики, свойства и эффективность препарата ниазон для профилактики туберкулеза животных;
– изучить влияние иммуномодулирующих препаратов РНК ридостина и полирибоната на протективные свойства вакцины БЦЖ при сочетанном применении для профилактики туберкулеза телят;
– дать экономическую оценку системы противотуберкулезных мероприятий.
Научная новизна и теоретическая значимость. Дан ретроспективный анализ эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота в РФ, масштабно показано экономическое значение туберкулеза в современных условиях ведения животноводства (экономический ущерб, затраты на оздоровительные мероприятия и их экономическая эффективность). Получены новые данные об эпизоотологическом значении телят, анергичных к туберкулину, – опасных источников распространения возбудителя туберкулеза. Предложены: метод выявления анергичных к туберкулину телят с использованием вакцины БЦЖ и система диагностических мероприятий, позволяющая снять ограничения по туберкулезу на фоне проявления неспецифических реакций на туберкулин.
Разработаны: автоматизированная система эпизоотологического мониторинга туберкулеза животных для оперативного контроля противотуберкулезных мероприятий и библиотека программ для автоматизации учета пересеваемых культур микроорганизмов, их биологических характеристик и контроля сроков пересевов с использованием «Электронного журнала учета культур».
Усовершенствована тест-система ПЦР для выявления возбудителя туберкулеза из биоматериала реагирующих на туберкулин животных. На основе анализа геномного полиморфизма длин фрагментов рестрикции (ПДФР) ампликонов синтезированы генетические праймеры для дифференциации микобактерий туберкулезного комплекса от атипичных.
Разработаны новые плотная и жидкая питательные среды для культивирования микобактерий с использованием минерального комплекса растительного происхождения (вытяжка из золы древесины березы, оксидат торфа, криалл). Сконструирован обладающий неоспоримыми преимуществами перед имеющимися типами электронный кутиметр для оценки аллергических реакций на внутрикожное введение животным туберкулинов.
Испытан новый туберкулостатический пролонгированного действия препарат ниазон для профилактики туберкулеза крупного рогатого скота в системе оздоровительных мероприятий. В эксперименте изучены его токсичность, пирогенность, бактериостатическая концентрация в крови, дозы и схема применения. В производственных условиях доказана противоэпизоотическая эффективность ниазона.
Теоретически обосновано и в серии экспериментальных исследований показано усиление иммунного ответа у телят, вакцинированных БЦЖ совместно с иммуномодулирующими препаратами ридостин и полирибонат. Предложен способ профилактики туберкулеза у телят при сочетанном использовании вакцины БЦЖ и иммуномодуляторов.
Научная новизна исследований защищена патентами на изобретения:
1. RU 2190417 C2 от 10.10.2002 г. «Средство снижения токсичности химически синтезированных противотуберкулезных препаратов».
2. RU 2192472 С2 от 10.11.2002 г. «Среда для культивирования микобактерий туберкулеза».
3. RU 32984 U1 от 10.10.2003 г. на полезную модель «Кутиметр».
4. RU 2231972 С1 от 10.07.2004 г. «Кутиметр».
5. RU 2300559 С2 от 10.06.2007 г. «Жидкая питательная среда для культивирования патогенных штаммов микобактерий туберкулеза».
Результаты исследований вносят существенный теоретический и практический вклад в решение проблемы туберкулеза животных и могут быть использованы при совершенствовании системы противотуберкулезных мероприятий, а также в учебном процессе вузов.
Практическая значимость и внедрение результатов исследований.
В практику планирования и организации противотуберкулезных мероприятий внедрены автоматизированная система эпизоотологического мониторинга и экономического анализа эффективности профилактики и ликвидации туберкулеза. Внедрение разработанной схемы снятия ограничений по туберкулезу на фоне проявления неспецифических туберкулиновых реакций позволило оздоровить 72 неблагополучные по туберкулезу фермы.
Новые плотная и жидкая питательные среды на основе минерального комплекса растительного происхождения позволяют на 5–6 суток сократить срок бактериологической диагностики туберкулеза. Разработанный электронный кутиметр дает возможность качественно и технологично оценивать показания внутрикожной туберкулиновой пробы у животных.
Разработана схема оздоровления неблагополучных по туберкулезу хозяйств с использованием на взрослых животных химиопрофилактического препарата ниазон и специфической профилактики туберкулеза телят вакциной БЦЖ с иммуномодуляторами. Пролонгированный противотуберкулезный препарат ниазон с положительным эффектом апробирован в системе противотуберкулезных мероприятий на поголовье 7,9 тыс. гол. крупного рогатого скота 35 ферм региона Сибири.
Результаты исследований отражены в шести нормативно-технических документах федерального уровня, регламентирующих оздоровительные и профилактические мероприятия при туберкулезе животных, и в пяти региональных методических рекомендациях. Шесть завершенных научных разработок включены в каталоги информационных материалов по научному обеспечению реализации приоритетного национального проекта «Развитие АПК в Сибири» (Новосибирск, 2006, 2007).
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ ИЭВСиДВ СО РАСХН (1992–2007), международных, федеральных и региональных научно-практических конференциях: «Основные научные направления по проблеме туберкулеза и бруцеллеза с.-х. животных» (Новосибирск, 1995), «Современное состояние и перспективы интеграции ветеринарной науки и практики» (Махачкала, 1997), «Проблемы адаптации животных» (Новосибирск, 1997), «Зооантропонозные болезни, меры профилактики и борьбы» (Гродно, 1997), «Развитие агропромышленного комплекса в зонах рискованного земледелия» (Новокузнецк, 1998), «Проблемы стабилизации и развития с.-х. производства Сибири, Монголии и Казахстана в ХХI веке (Новосибирск, 1999), «Проблемы стабилизации и развития сельского хозяйства Казахстана, Сибири и Монголии» (Новосибирск, 2000), «Проблемы биологической и экологической безопасности» (Оболенск, 2000), «Новые фармакологические средства для животноводства и ветеринарии» (Краснодар, 2001), «АПК Сибири, Монголии и Казахстана в XXI веке» (Улан-Батор, 2001), «Научное обеспечение АПК Сибири, Монголии, Казахстана, Беларуси и Башкортостана» (Абакан, 2002), «Биолого-экологические проблемы заразных болезней диких животных и их роль в патологии с.-х. животных и людей» (Покров, 2002), «Современные проблемы эпизоотологии» (Новосибирск, 2004), «Современное состояние и актуальные проблемы развития ветеринарной науки и практики» (Алматы, 2005), на Международном симпозиуме «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклидов и возбудителей опасных инфекционных болезней» (Казань, 2005), на 1-ом Международном ветеринарном конгрессе (Алматы, 2002), на Сибирском международном ветеринарном конгрессе «Актуальные вопросы ветеринарной медицины» (Новосибирск, 2005), на научной сессии ДО Россельхозакадемии (Благовещенск, 1995).
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликованы 54 научные работы, в том числе 1 монография и 11 статей в ведущих научных изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования РФ («Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук», «Биотехнология», «Сибирский вестник сельскохозяйственной науки», «Ветеринарная патология»)
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 305 страницах, иллюстрирована 76 таблицами, 18 рисунками и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка использованной литературы (569 источников, в том числе 119 зарубежных) и приложений.
Основные положения, выносимые на защиту.
- Усовершенствованные методы и средства диагностики туберкулеза крупного рогатого скота и их эффективность.
- Методы профилактики туберкулеза крупного рогатого скота с использованием препарата ниазон и вакцины БЦЖ с РНК-имму-номодуляторами.
- Экономическая оценка системы противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы и методы исследований
Работа выполнена в 1992–2007 гг. в Институте экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН в соответствии с тематическими планами НИР: Д.01.02. «Разработать и внедрить способы повышения иммуногенности вакцины БЦЖ с применением стимуляторов иммунитета» (1991–1995), 02.05. «Разработать новые способы лабораторной диагностики туберкулеза на основе ДНК-зондов и твердых питательных сред» (1996–2000), 03.03. «Разработать и внедрить новую высокоэффективную комплексную систему контроля эпизоотического процесса туберкулеза в стадах крупного рогатого скота с использованием специфической - и химиопрофилактики» (1997–2000), 01.01. «Теоретически обосновать, разработать и предложить для реализации в ветеринарной практике систему эпизоотологического мониторинга по туберкулезу с целью совершенствования противоэпизоотических мероприятий» (2001–2005).
В опытах использовали крупный рогатый скот, кроликов, морских свинок, белых мышей и крыс. Группы опытных и контрольных лабораторных животных формировали по принципу аналогов, содержали с соблюдением правил, норм кормления, ухода (И.П. Западнюк и др., 1974) и гуманного обращения. Лабораторных животных декапитировали спирт-эфиром.
В опытах с заражением животных использовали музейные, официально зарегистрированные штаммы культур патогенных и атипичных микобактерий, хранящиеся и регулярно поддерживаемые (пересевы на питательные среды, пассажи на лабораторных животных): M.bovis (шт. 8, 14, BCG); M.tuberculosis (шт. H37Rv «Академия»); M.avium (шт. 780); M.kansasii, M. fortuitum, M.smegmatis. Кроме того, использовали штаммы микобактерий, изолированные нами в различные периоды от реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота неблагополучных по туберкулезу хозяйств Сибири.
В процессе исследований из диагностических препаратов использовали различные серии ППД-туберкулинов для млекопитающих производства Курской биофабрики, тест-систему ПЦР для идентификации и дифференциации M.bovis и M.tuberculosis методом полимеразной цепной реакции производства «Нарвак» (М., 2004, 2005).
Учитывая богатый минеральный состав и наличие большого количества биологически активных веществ, в качестве добавок при экспериментальном конструировании новых питательных сред использовали компоненты биологического и неорганического происхождения: суспензию из сухих пекарских дрожжей (ГОСТ 171–81), соевое молоко (ТУ 9222–002–10126 558–94), оксидат торфа (ТУ 88 БССР 135–88), криалл (производное торфогуминовых удобрений) и специально приготовленный минеральный комплекс – вытяжку из золы древесины березы, сыворотку крови лошади. За основу и в качестве контроля взяты технологии приготовления стандартных питательных сред Финн-2, Гельберга и Левенштейна-Йенсена, Сотона.
В опытах на лабораторных животных и в производственном испытании использовали вакцину БЦЖ различных серий производства НИИ вакцин и сывороток (г. Ставрополь), иммуномодуляторы полирибонат (поливедрин) – односпиральная РНК, ридостин (индуктор интерферона) – двухспиральная РНК. Иммуномодуляторы получены в НИКТИ БАВ ГНЦ ВБ «Вектор» (г.Бердск, Новосибирской обл.).
Экспериментально-производственные исследования проведены в 65 благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах Сибири.
Выполнены следующие объемы диагностических исследований: аллергические (на крупном рогатом скоте и лабораторных животных) – 118 тыс.; патолого-анатомические – 3,7 тыс., бактериологические (включая биопробу на лабораторных животных) – 690.
В процессе исследований использовали следующие методы:
– монографический и аналитический – при анализе научной литературы отечественных и зарубежных исследователей по проблеме туберкулеза животных, включающей вопросы, освещаемые в диссертационной работе;
– эпизоотологический – при анализе эпизоотической ситуации и изучении особенностей эпизоотического процесса туберкулеза крупного рогатого скота (А.А. Конопаткин, И.А. Бакулов, Я.В. Нуйкин, 1984; С.И. Джупина, А.А. Колосов, 1991);
– статистико-экономический – при анализе экономической эффективности противотуберкулезных мероприятий (по авторской методике);
– аллергический (согласно «Наставлению по применению ППД-туберкулинов для млекопитающих и птиц», 1999) – на крупном рогатом скоте хозяйств и лабораторных животных, инфицированных культурами микобактерий;
– патолого-анатомический (согласно «Наставлению по диагностике туберкулеза животных», 1986, 2002) – на крупном рогатом скоте для сканирования результатов аллергических исследований и отбора проб биоматериала; на лабораторных животных – в опытах с заражением культурами микобактерий. Экспертизе подвергали лимфатические узлы и паренхиматозные органы. Индекс пораженности туберкулезом органов определяли по методикам Ю.К. Вейсфеллера (1975), А.А. Триус (1976);
– бактериологический (согласно «Наставлению по диагностике туберкулеза животных», 1986, 2002 и «Методам лабораторной диагностики туберкулеза», ГОСТ 26072–89) (СТ СЭВ 3457–81). В культуральном методе использовали плотные (Левенштейна-Йенсена, Финн-2, Гельберга, ФАСТ-3Л, Петраньяни, среда ИЭВСиДВ) и жидкие (Сотона, Школьниковой, Павловского) питательные среды. Культурально-биохимические свойства изолированных кислотоустойчивых микобактерий изучали во второй генерации роста после накопления бактериальной массы с предварительной проверкой на чистоту визуально и в мазках. Учет и оценку выросших колоний культур микобактерий проводили по схеме Г.Н. Першина (1971).
Методику постановки ПЦР, в том числе ПЦР-ПДФР, усовершенствовали с целью индикации патогенных микобактерий из биоматериала от животных и их дифференциации от атипичных.
Пролонгированную форму химиопрофилактического препарата ниазон готовили на основе производного гидразид изоникотиновой кислоты – изониазида производства фирмы AMSAL CHEM PVT LIMITED (Индия). Свойства противотуберкулезного препарата ниазон, полученного путем иммобилизации изониазида и гидрозон изониазида на водорастворимых полимерах, изучали по показателям острой и хронической токсичности, анафилактогенности, тератогенности, эмбриотоксичности, мутагенности. Фармакокинетику в сыворотке крови и бактериостатическую активность препарата определяли в опытах на кроликах и телятах. Кроме того, изучали влияние ниазона на проявление аллергических реакций у животных и его действие на ультраструктуру микобактерий. Для изучения возможности снижения токсичности ниазона использовали натриевую соль ДНК из молок лососевых рыб.
Протективные свойства вакцины БЦЖ при совместном использовании с иммуномодулирующими препаратами изучали по показателям динамики гиперчувствительности замедленного типа (ГЧЗТ), индекса и характера пораженности туберкулезом внутренних органов лабораторных животных, белкового спектра сыворотки крови, реакции специфического лизиса лейкоцитов крови, напряженности клеточного иммунитета в реакции бласттрансформации лимфоцитов (В.В. Хоробрых с соавт., 1983).
Цифровой материал обрабатывали в программе Microsoft Excel по показателям средних значений (M±m), достоверности разницы опытных и контрольных данных (Р) и коэффициента корреляции (r).
Подробные схемы опытов, методов и методик исследований изложены в соответствующих разделах диссертации.
Отдельные исследования выполнены совместно с А.С. Донченко, Ю.И. Смоляниновым, В.Н. Донченко, Ю.С. Аликиным, Т.Н. Давыдовой, А.А. Колосовым, Г.П. Протодьяконовой, С.В. Иониной, М.Ш. Азаевым, Е.В. Козеевым, В.И. Околеловым.