Современные методы исследования бас выделение и анализ бас

Вид материала

Лекция

Содержание Цели выделения и очистки БАС. Сырье для выделения БАС. Обобщенная схема выделения БАС. Применение консервантов Гомогенизация (измельчение).

Подобный материал:

• Современные методы исследования бас выделение и анализ бас, 182.61kb.
• Опера Князь Игорь, 48.17kb.
• «Бас-Балқаш 2004» жауапкершілігі шектеулі серіктестігі, 29.88kb.
• " Современные технологии в маркетинге и организация продаж" Продолжительность обучения, 24.72kb.
• Spa, adelboden «Beauty Day» для Дам chf 285, 1744.46kb.
• Рабочая программа по дисциплине дс. 01. 02 «Современные проблемы химических источников, 1006.89kb.
• План Методы психологии Основные методы психологического исследования Вспомогательные, 128.12kb.
• «Мәшһүр-Жүсіп шығармаларындағы заттық мәдениет лексикасы» : Монография. 1 том. Павлодар, 17645.06kb.
• Хуан Бас Трактат о похмелье, 1659.07kb.
• Отчет по нир: 44 с., 34 рис., 2 табл., 16 ист. Объекты исследования рабочий процесс, 404.5kb.

СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БАС

ВЫДЕЛЕНИЕ И АНАЛИЗ БАС


Лекция 1

Определение БАС.

Термином БАС (биологически активные соединения) мы будем называть любые вещества, оказывающие воздействия на живые организмы или являющиеся продуктами их жизнедеятельности (в том числе и метаболитами). Основными классами таких веществ являются аминокислоты, белки, нуклеотиды, нуклеиновые кислоты, липиды, углеводы, низкомолекулярные метаболиты (например биогенные амины), гликозиды, алкалоиды и т.д. Кроме того, мы причисляем к бас и разнообразные лекарственные средства.

Цели выделения и очистки БАС.

1. Выделение неизвестного вещества (веществ) в количествах, необходимых для определения их структуры. Такого рода работы могут иметь чисто научное значение ( изучение всех алкалоидов в данном растении) или более прикладное – например какое именно вещество ответственно за лечебный эффект, проявляемый слизью тропической лягушки (самое ядовитое существо на Земле).
   

2. Выделение необходимого количества конкретного (известного) вещества для дальнейшего изучения (например для исследования биологической активности.
   

3. Получение значительного количества конкретного (известного) вещества для дальнейшего использования (например в качестве лекарственного средства).
   

Сырье для выделения БАС.



Тип сырья, наряду с особенностями выделяемых объектов оказывает большое влияние на методы, применяемые для обработки. Например, растительное сырье гораздо менее требовательно к методам консервации по сравнению с органами животных. Наличие прочных клеточных стенок у растений и некоторых микроорганизмов затрудняет гомогенизацию, что приводит к применению таких жестких методов, как пресс Хьюза. Напротив, суспензии культур тканей разрушаются гораздо более мягкими методами.


Обобщенная схема выделения БАС.




Первичная сепарация – это выделение части объекта, которая содержит интересующее нас соединение. Например, физическое отделение цветков у растений, органов у животных или разделение биомассы и культуральной жидкости у микроорганизмов (с помощью фильтрования или центрифугирования).

Консервация необходима для того, чтобы нужное нам БАС сохранилось в сырье до начала обработки.

Гомогенизация (измельчение) применяется либо для облегчения экстракции, либо для доступа к клеточным органеллам содержащим нужный нам объект.

Сепарация – в случае необходимости выделения конкретных клеточных органелл из гомогенизата как правило используется центрифугирование.

Необходимо отметить, что в зависимости от конкретной задачи те или иные стадии могут быть пропущены дополнены или изменены. Кроме того, в эту схему может вставляться стадия химической модификации,особенно в тех случаях, когда химия нашего БАС затрудняет его выделение в нативном виде.

Сепарация.

От лат. separatio — отделение. Для растительного сырья – это как правило физическое отделение (чаще всего в процессе сбора) тех частей растения, в которых преимущественно накапливается необходимое нам вещество. Например алкалоиды часто концентрируются в цветках или плодах. (скажем опий добывается из недозрелых коробочек опийного мака).


Для животного сырья используется аналогичный подход – для дальнейшей обработки используются органы, содержащие целевое соединение. Так для выделения тетродотоксина, известного яда часто используемого для изучения клеточных каналов, используются печень и икра рыбы фугу.


В случае микробиологического сырья, БАС как правило содержатся либо в биомассе, либо в культуральной жидкости. Для их разделения наиболее часто применяется фильтрование на различном различного оборудовании в зависимости от масштабов и целей.

Нутч-фильтры, друк-фильтры, фильтр-прессы и тд. (см. фильтры).

Часто используется, особенно в лабораторных масштабах, центрифугирование.


Консервация.

От лат. conservatio — сохранение.

В зависимости от структуры и окружения на БАС могут действовать следующие повреждающие факторы:

1. Микроорганизмы
   
2. Ферменты самого биологического объекта в процессе автолиза (аутолиза).
   
3. Кислород
   
4. Свет
   
5. Неблагоприятные изменения pH среды
   

Охлаждение.

Наиболее широко в качестве консервирующего средства используется понижение температуры. При этом тормозятся действия всех повреждающих факторов.

Охлаждение до температуры сухого льда (−79°С) и, тем более, жидкого азота (−196 °C) приводит к практически полной остановке всех химических реакций.


Применение консервантов - препятствует действию факторов 1 и 2.

1. Изменение ионной силы, например добавлением поваренной соли. В пищевом производстве это засолка.
   

2. Изменение pH. В лаборатории используются буферные растворы, кислоты и основания. На кухне это маринование (добавлением пищевых кислот) или квашение (за счет развития молочнокислых бактерий).
   

3. Изменение осмотического давления путем добавления сахарозы. Засахаривание.
   

4. Ингибиторы ферментов.
   

5. Антибиотики.
   

6. Химические консерванты – например формалин.
   

Уменьшение содержания воды – препятствует действию факторов 1, 2 и 5.

1. Сушка.
   
   1. Обычная сушка
      
   2. Лиофилизация (от греч. lýo — растворяю и philéo — люблю). способ мягкой сушки веществ, при котором высушиваемый препарат замораживается, а потом помещается в вакуумную камеру, где и происходит возгонка растворителя.
      

2. Замена на органический растворитель (заспиртовывание)
   

Герметизация – препятствует действию факторов 1 (аэробных микроорганизмов) и 3.

Может быть обычной (аналогично пищевым консервам), вакуумированием или заменой атмосферы на инертный газ.


Гомогенизация (измельчение).

От греческого homogenes — однородный.

Физические методы.

1. Растирание с абразивом в ступке, как правило объект замораживают. Универсальный, но трудоемкий и малопроизводительный метод.
   
2. Мельницы (в том числе и шаровые) – пригодны для высушенного сырья..
   
3. Замораживание-оттаивание.
   
4. Ультразвук – действует за счет эффекта кавитации.
   
5. Пресс Хьюза (продавливание замороженного объекта или смеси его с абразивом через небольшое отверстие под действием высокого давления.
   
6. Декомпрессия (френч-пресс).
   
7. Гомогенизаторы.
   
   1. Типа «блендер» - используется в основном для мягких животных и растительных тканей в лабораторной практике.
      
   2. Гомогенизаторы, основанные на разрушении микрообъектов в зазоре с градиентом скоростей жидкости. Например гомогенизатор Поттера-Эльвейема представляющий собой толстостенную пробирку с притертым к ней стеклянным пестиком, вращаемым электромотором. При сочетании возвратно поступательного и вращательного движении пестика жидкость, содержащая суспензию микрообъектов, проходит через зазор между пестиком и пробиркой. При этом клеточные мембраны разрушаются. Эти приборы способны разрушить только относительно непрочные объекты.
      

Физико-химические методы.

1. Осмотический шок (особенно часто применяется для получения теней эритроцитов)
   
2. Добавление органических растворителей, например толуола вызывает деструкцию клеточных мембран.
   
3. Использование ПАВ (поверхностно-активных веществ).
   

Химические методы.

1. Как правило используются ферменты, разрушающие клеточные оболочки. К таким ферментам относится, например, лизоцим.
   

Экстракция.

Экстра́кция (от лат. extraho — извлекаю) — метод извлечения вещества из раствора или сухой смеси с помощью подходящего растворителя (экстраге́нта). Для извлечения из раствора применяются растворители, не смешивающиеся с этим раствором, но в которых вещество растворяется лучше, чем в первом растворителе.

Экстракция может быть разовой (однократной или многократной) или непрерывной (перколя́ция).

Простейший способ экстракции из раствора — однократная или многократная промывка экстрагентом в делительной воронке. Делительная воронка представляет собой сосуд с пробкой и краном для слива нижнего слоя жидкости. Для непрерывной экстракции используются специальные аппараты — экстракторы, или перколяторы.

Для извлечения индивидуального вещества или определённой смеси (экстракта) из сухих продуктов в лабораториях широко применяется непрерывная экстракция по Сокслету.

Экстрактор Сокслета


1. Якорь магнитной мешалки
2. Колба для кипячения экстрагента
3. Трубка для паров растворителя
4. Патрон из пористого материала
5. Сухая смесь
6. Сифон
7. Слив сифона
8. Шлифовой переходник
9. Обратный холодильник

10, 11. Патрубки для холодной воды


Мацерация – твердое вещество экстрагируют многократно отдельными порциями растворителя при комнатной температуре.


Дигерирование – твердое вещество экстрагируют отдельными порциями растворителя при нагревании. Измельченное твердое вещество размешивают с растворителем и затем фильтруют или декантируют.д.ля более полного извлечения операцию повторяют несколько раз, используя небольшие порции свежего растворителя.


Более подробно об экстракции можно прочитать здесь


Сверхкритическая экстракция (SFE).

SFE используется для сложных смесей и рассматривается как альтернатива Сокслету.

Для экстракции применяется углекислый газ в сверхкритическом состоянии.

Подробнее об этом методе – здесь.