Изменение ферментативной активности нативного и иммобилизованного солода под влиянием некоторых биотехнологических воздействий 03. 01. 06 биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Вид материала

Автореферат

Содержание Научный руководитель Ведущая организация 29» марта 2012 г. в 12 Общая характеристика работы Цель работы Научная новизна. Практическая значимость работы Основные положения, выносимые на защиту Апробация работы. Структура и объем диссертации. Собственные исследования Результаты исследований и их обсуждение Зависимость амилолитической активности нативного солода от температуры Разработка технологии физической иммобилизации ферментного Приготовление солода Подготовка носителя Оценка амилолитической активности иммобилизованного солода в Роль биотехнологических препаратов и растворов редкоземельных металлов в изменении амилолитической активности иммобилизованного Влияние иммобилизованного солодового препарата на Практические предложения Список работ, опубликованных по теме диссертации ... Полное содержание

Подобный материал:

• Программа кандидатского экзамена послевузовского профессионального образования (аспирантура), 424.16kb.
• Разработка идентификации bordetella bronchiseptica на основе иммунохимических и молекулярно-генетических, 373.19kb.
• Наночастицы металлов в растворах: биохимический синтез, свойства и применение 03. 01., 843.88kb.
• Характеристика новых свойств пробиотических препаратов серии «экофрэнд» 03. 01., 302.88kb.
• Малышева Галина Викторовна Структурно-функциональное состояние гематосаливарного барьера, 307kb.
• Развития сленга в современном русском языке, 58.9kb.
• 1. предмет эк истории, 808.25kb.
• Биосенсорные материалы на основе полимерных пленок с иммобилизованными производными, 232.46kb.
• Рабочая программа дисциплины моделирование и оптимизация биотехнологических процессов, 449.23kb.
• Типовые формы патологии нервной системы, 335.46kb.

На правах рукописи


Шатько Анна Александровна


ИЗМЕНЕНИЕ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ НАТИВНОГО И ИММОБИЛИЗОВАННОГО СОЛОДА ПОД ВЛИЯНИЕМ НЕКОТОРЫХ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ВОЗДЕЙСТВИЙ


03.01.06 – биотехнология

(в том числе бионанотехнологии)


Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


Саратов – 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном
образовательном учреждении высшего профессионального образования
«Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Блинов Валерий Анатольевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова», профессор кафедры технологии и организации общественного питания доктор биологических наук, профессор Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук, заведующий лабораторией физиологии микроорганизмов

Птичкина Наталия Михайловна Игнатов Олег Владимирович

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина»


Защита диссертации состоится « 29» марта 2012 г. в 12⁰⁰ часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» (410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал).


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова».


Автореферат диссертации разослан « » февраля 2012 г.


Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов,
Театральная пл., 1 ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный
университет им. Н.И. Вавилова», ученому секретарю диссертационного совета.


Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Л.В. Карпунина


ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ


Актуальность темы. Солод является весьма востребованным продуктом в пищевой промышленности, сельском хозяйстве, медицине и др. (Ауэрман, 2003; Кунце, 2003; Kichara et al., 2002). Это связано с тем, что солод содержит активный комплекс ферментов, а также соединения, необходимые для нормальной жизнедеятельности: белки, углеводы, макро- и микроэлементы, витамины. При использовании солода улучшается качество пищевых продуктов, в том числе для детского питания, увеличиваются сроки их хранения, продукты приобретают необходимый аромат, цвет и вкус (Драчева, 2001; Доронин и др., 2002; Рогов и др., 2004; Нилов и др., 2005; Greg, 1994; Dewar et al., 1997), решаются многие технологические проблемы изготовления качественных продуктов питания и обогащения их микронутриентами (Покровский, 2002; Лифляндский, 2004; Гичев, 2006; Hilliam, 2001; Milner et al., 2002).

Однако применение нативного солода имеет ряд недостатков: низкая стабильность и однократность действия, неустойчивость к экстремальным воздействиям, постоянная возможность загрязнения продуктов питания чужеродными белковыми (resp. аллергенными) примесями, сложность регулирования глубины ферментативной реакции и т. д. (Фараджева, 2001; Егорова, 2005; Poig et al., 1995). Многие из этих проблем успешно решаются с помощью иммобилизованных ферментов, которые в пищевой промышленности с высокой эффективностью применяются на таких крупномасштабных производствах как получение глюкозо-фруктозных сиропов, L-аминокислот и т. д. (Kitara et al., 1989; Kokin et al., 1992). В то же время возможность применения иммобилизованного солода в каких-либо отраслях хозяйственной деятельности до сих пор еще не исследовалась, что обуславливает необходимость и актуальность их проведения.

Другой, теоретически и практически значимой задачей является повышение продукции солода высокого качества. С этой целью применяются различные усилители солодоращения: сульфацетамин, гиббереллин, цитокинин, фузикокцин и др. (Блинов, 2001; Безуглова, 2003; ссылка скрыта2007; Магулаев, 2007). Однако большинство из них не является стимуляторами получения нативного и, особенно, иммобилизованного солода биотехнологического генеза. С современных позиций это является актуальной задачей.

Цель работы - изучение ферментативной активности нативного и иммобилизованного солода и оценки влияния на эти процессы некоторых биотехнологических воздействий.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние эффективных микроорганизмов, коллоидного золота и растворов редкоземельных металлов на посевные качества семян.

2. Оценить амилолитическую активность нативного солода в зависимости от температуры, рН, концентрации ферментного препарата и концентрации субстрата.

3. Разработать технологию физической иммобилизации солодового препарата, полученного из зерновых и бобовых культур.

4. Оценить амилолитическую активность иммобилизованного солода в зависимости от температуры, рН и концентрации субстрата.

5. Установить роль биотехнологических воздействий в изменении качественных показателей иммобилизованного солода.

6. Исследовать влияние нативного и иммобилизованного солода на органолептические и физико-химические показатели качества теста, хлеба, пива и кваса.

Научная новизна. Впервые установлено, что обработка семян пшеницы, ржи, тритикале и двух видов чечевицы препаратом эффективных микроорганизмов и коллоидным золотом существенно улучшает их посевные качества. Так, энергия прорастания при обработке семян ЭМ-препаратом у зерновых, в среднем, увеличилась на 9 %, у бобовых - на 15 %. Под воздействием коллоидного золота энергия прорастания семян тритикале увеличилась в 1,5 раза. Обнаружена тенденция к сокращению сроков прорастания семян под влиянием ЭМ-препарата, коллоидного золота и неодима. Под влиянием указанных воздействий скорость прорастания культур по сравнению с контрольными образцами уменьшилась, в среднем, в 1,5 раза. Растворы празеодима и лантана снижали скорость прорастания данных культур, в среднем, на 30 - 40 %.

Детально изучена зависимость скорости амилолитической реакции нативного солода, полученного из указанных зерновых и бобовых культур от температуры, рН, концентрации ферментного препарата и концентрации субстрата. Установлено, что ферментативная активность солода из зерновых в 3 - 4 раза выше, чем у бобовых.

Предложен способ производства солода из чечевицы, позволяющий повысить ферментативную активность и энергию прорастания зерна чечевицы, а также сократить сроки получения готового солода и, как следствие, расширить область применения такого солода (патент на изобретение № 2428464 «Способ производства солода из чечевицы»).

Впервые разработана технология физической иммобилизации солода, полученного из семян пшеницы, ржи и тритикале, изучена его амилолитическая активность в зависимости от температуры, рН и концентрации субстрата. Установлено, что потеря ферментативной активности солода после иммобилизации составляла, в среднем, 13 % от активности нативного. Солод, полученный из бобовых культур, по сравнению с солодом из зерновых, имел меньшее сродство к субстрату и низкую начальную скорость реакции гидролиза крахмала. Иммобилизованный солодовый препарат может быть использован в течение 15 дней.

Практическая значимость работы. Показана целесообразность использования препарата эффективных микроорганизмов, коллоидного золота и растворов редкоземельных металлов (неодима, празеодима, лантана) в концентрации 5·10^{– 9} г/л для улучшения посевных качеств семян зерновых и бобовых культур.

В научно-пилотных опытах впервые установлена эффективность использования разработанного иммобилизованного ферментного препарата солода при изготовлении теста, хлеба, пива и кваса. Положительные результаты исследований подтверждены актами комиссионных испытаний в Саратовском ГАУ им. Н. И. Вавилова. Получен акт о внедрении технологии физической иммобилизации солода в производство хлебобулочных изделий на ОАО «Хлебокомбинат им. Стружкина», г. Саратов. Разработана программа «Расчет амилолитической активности солода», предназначенная для нахождения искомых значений амилолитической активности солода при заданных значениях концентрации субстрата (свидетельство о государственной регистрации № 2010617147 - Федеральная служба по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам Москва, 2010).

Результаты научных исследований используются в учебном процессе при чтении студентам-биотехнологам лекций, проведении лабораторных работ, при написании дипломных работ и методических указаний в ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н. И. Вавилова». Этому способствует, в частности, и разработанная база данных «Библиографический обзор литературы по изучению основных характеристик солода и его применения» (свидетельство о государственной регистрации № 2011620324 - Федеральная служба по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам Москва, 2011).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Биотехнологические воздействия (препарат эффективных микроорганизмов, коллоидное золото, растворы редкоземельных металлов в концентрации 5·10 ^{– 9} г/л) улучшают посевные качества семян зерновых и бобовых культур.

2. Амилолитическая активность нативного солода зависит от температуры, рН, концентрации фермента и концентрации субстрата.

3. Разработаны технологические этапы физической иммобилизации ферментного препарата солода из зерновых и бобовых культур.

4. Ферментативная активность иммобилизованного солодового препарата

зависит от температуры, рН и концентрации субстрата.

5. Препараты эффективных микроорганизмов, коллоидное золото, растворы редкоземельных металлов в концентрации 5·10 ^–9 г/л стимулируют амилолитическую активность иммобилизованного солода.

6. Иммобилизованный ферментный препарат солода рекомендуется применять при изготовлении теста, хлеба, пива и кваса.

Апробация работы. Основные результаты научных исследований представлены на Международной научно-практической конференции «Вавиловские чтения» (Саратов, 2010); научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов Саратовского ГАУ по итогам научно-исследовательской и учебно-методической работы (Саратов, 2011); Шестом Саратовском Салоне изобретений, инвестиций, инноваций (Саратов, 2011); первой интернет-конференции Саратовского ГАУ «Приоритетные направления модернизации аграрной экономики: тенденции, проблемы, перспективы» (Саратов, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ и 1 патент.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы и собственных исследований, включающих материалы и методы исследований, результатов исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов, практических предложений и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 148 страницах, иллюстрирована 27 рисунками, 25 таблицами, содержит 4 приложения. Список использованных литературных источников включает 224 наименованиz, в том числе 108 зарубежных авторов.


СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ


Объект, материалы и методы исследований

Объектом исследований являлся солод, изготовленный из зерновых и бобовых культур: озимая твердая пшеница «Новинка», озимая рожь «Саратовская 6», тритикале (линия 2 № 42), чечевица I «Петровская 6» и чечевица II «Веховская 1» (ГНУ НИИСХ Юго-Восток РАСХН, г. Саратов). Учет за состоянием семян включал определение всхожести, дружности, энергии и скорости прорастания (Дворкин и др., 1999; Буршина и др., 2008). В динамике определяли массу семян, длину ростков и корешков, а также массу ростков. Семена проращивали в условиях регламентированных ГОСТ 12044-93. Для проращивания брали 100 семян каждого сорта, в трехкратной повторности. Для изучения влияния на посевные качества семян препарата эффективных микроорганизмов, коллоидного золота и растворов редкоземельных металлов в концентрации 5·10^–9 г/л, семена опытных партий на сутки замачивали в дистиллированной воде, при этом 10 % ее было заменено на указанные растворы.

Солод изготавливали по известной технологии (Личко и др., 2000; ссылка скрыта 2007; Домарецкий, 2007; Нарцисс, 2007; Chandra, 1998). Готовый солод использовали для приготовления ферментного препарата.

Общую амилолитическую активность солода определяли по ГОСТ 20264.4-89, однако в ряде экспериментов определяли активность α- и β- амилаз отдельно, по соответствующим методикам (Посыпанова, 2007; Вировец и др., 2009; Okolo et al., 1996).

Физическую иммобилизацию солода проводили на полимерном носителе в шуттель-аппарате ПЭ-6300 (Россия, Санкт-Петербург) путем адсорбции ферментного препарата солода. В качестве носителя использовали полипропиленовые трубки, изготовленные методом экструзии (ООО "Союз-Беркли", г. Москва). Для проведения иммобилизации в пробирки наливали по 1 мл рабочего раствора ферментного препарата солода, в них помещали полипропиленовые трубки, на рабочие зоны которых планировалось осаждение ферментов. В течение 2 часов при температуре 25-27°С проводили иммобилизацию солода. Полученный препарат хранился в физиологическом растворе при температуре 4-5°С. Для оценки длительности действия иммобилизованного ферментного препарата солода, его вносили в пробирки, содержащие 2 % раствор крахмала в ацетатном буфере при температуре 40°С. Жидкость периодически перемешивали, затем определяли степень расщепления раствора крахмала (Вировец, 2006). После этого носитель извлекали из раствора, отмывали дистиллированной водой, помещали в физиологический раствор и оставляли в холодильнике на сутки. Затем указанная процедура повторялась до тех пор, пока ферментный препарат не переставал расщеплять крахмал.

Амилолитическую активность нативного и иммобилизованного солода определяли в зависимости от температуры, pH, концентрации фермента и концентрации субстрата. Проведен расчет константы Михаэлиса и скорости реакции (Можаев, 1983; Косминский и др., 2002; Kabaivanova et al., 2005). Для выявления возможных стимуляторов активности иммобилизованного солода апробировались: пробиотический препарат «Байкал-ЭМ1», коллоидное золото и растворы редкоземельных металлов (неодим, празеодим, лантан).

Для оценки практического применения иммобилизованного ферментного препарата солода в лабораторных условиях с его использованием изготавливали тесто, хлеб, пиво и квас. Качество полученных продуктов оценивали, используя соответствующие производственные методы и ГОСТы (ГОСТ 6687.4-86; ГОСТ Р 51154-98; Куликова, 2000; Ермолаева и др., 2001; Матвеева и др., 2001; Васильев, 2003; Пучкова, 2004; ГОСТ 52409-2005; Данилов, 2007; Пащенко и др., 2007).

Статистическую обработку результатов проводили как по стандартным методикам, так и с использованием программы StatPlus 2007 Professional 4.9.4.1. Расчет результатов осуществляли с применением пакета прикладных программ Statistica 6.0 (for Windows; «Stat Soft Inc.», США), Microsoft Excel 2002 (for Windows). Достоверность различий определяли методом вариационной статистики с использованием параметрического критерия Стьюдента. Достоверными считали различия при вероятности ошибки Р < 0,05 (Ашмарин и др., 1974).


РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ


Влияние биотехнологических препаратов и растворов редкоземельных металлов на посевные качества семян

Установлено, что всхожесть большинства культур была довольно высокой и колебалась в пределах 95-98 %, лишь у чечевицы II она составляла всего 54 %. Дружность прорастания у ржи, тритикале и чечевицы I оказалась практически одинаковой, у пшеницы и чечевицы II она была ниже. В довольно широких пределах колебался процент энергии прорастания, от 2 % у чечевицы II до 79 % у тритикале. Что касается скорости прорастания, как неблагоприятного признака посевных качеств, то самой высокой она была у чечевицы II – 5 сут.

После замачивания семян опытных партий в дистиллированной воде, 10 % которой было заменено на препарат эффективных микроорганизмов, коллоидное золото или растворы редкоземельных металлов в концентрации 5·10^-9 г/л, обнаружено, что указанные растворы положительно влияют на некоторые посевные свойства семян. Так, при обработке семян ЭМ-препаратом мы наблюдали увеличение энергии прорастания у пшеницы на 17 %, ржи – на 5 %, тритикале – на 6 %, чечевицы I – на 12 %, а у чечевицы II – в 3 раза (рис. 1). Под воздействием коллоидного золота энергия прорастания, например, семян тритикале увеличилась в 1,5 раза.

Интересным, на наш взгляд, является то, что обработка семян ЭМ-препаратом, коллоидным золотом и неодимом привела к значительному уменьшению сроков прорастания семян (рис. 2). Это расценивается как весьма позитивный признак. Действительно, при обработке указанными растворами скорость прорастания пшеницы, ржи, тритикале и обоих сортов чечевицы по сравнению с контрольными образцами уменьшилась, в среднем, в 1,5 раза. Растворы празеодима и лантана снижали скорость прорастания семян, в среднем, на 30-40 %.

Как установлено далее, несмотря на одинаковую влажность (8 %), под влиянием коллоидного золота и ЭМ-препарата особенно значительно возросла масса зерен обоих сортов чечевицы. Что касается массы и длины ростков, то наиболее значительные изменения (10-й день исследования) наблюдали лишь у семян ржи. В самом деле, при их обработке ЭМ-препаратом масса ростков увеличилась - на 14 %, коллоидным золотом - на 20 %, неодимом - на 16 %, празеодимом - на 11 %, лантаном - на 4 %. Кроме того, исследованные нами биостимуляторы, в ряде случаев, оказали весьма существенное влияние на длину корешков. Так, длина корешков под влиянием, например, ЭМ-препарата увеличилась у пшеницы - на 26 мм, ржи - на 19 мм, тритикале - на 28 мм, чечевицы I - на 8 мм, чечевицы II - на 11 мм, по сравнению с контролем.



Рис. 1. Изменение энергии прорастания посевных семян

Примечание: 1 – контроль, 2 – ЭМ-препарат, 3 – коллоидное золото, 4 – неодим, 5 – празеодим, 6 – лантан

- пшеница, - рожь, - тритикале, - чечевица I, - чечевица II.




Рис. 2. Изменение скорости прорастания посевных семян

Примечание: 1 – контроль, 2 – ЭМ-препарат, 3 – коллоидное золото, 4 – неодим, 5 – празеодим, 6 – лантан

- пшеница, - рожь, - тритикале, - чечевица I, - чечевица II.


Итак, нами установлено, что применение ЭМ-препарата, коллоидного золота и растворов редкоземельных металлов способствует не только увеличению энергии прорастания семян, но и существенно сокращает сроки прорастания некоторых зерновых и бобовых культур. Кроме того, предварительная обработка семян указанными препаратами оказала положительное влияние на развитие проростков, корнеобразование, в результате чего у семян сформировалась мощная корневая система. Весьма существенно, что нами обнаружена тенденция к улучшению качества тех семян (чечевицы), исходные посевные характеристики которых были недостаточными. Это открывает новые перспективы в предпосевной обработке семян с исходно низкими посевными свойствами.


Зависимость амилолитической активности нативного солода от температуры,

рН, концентрации фермента и концентрации субстрата

Наиболее адекватным показателем качества солода является его амилолитическая активность. Ее определяли в зависимости от температуры, pH, концентрации фермента и субстрата. Установлено, что активность нативного солода всех образцов была максимальной при температуре 40ºС. Причем, при повышении температуры на каждые 10ºС скорость ферментативной реакции у солода зерновых возрастала, в среднем, вдвое, что соответствует правилу Вант – Гоффа. Это оказалось не характерным для солода из бобовых. Максимальная активность солода исследованных образцов зарегистрирована при pH 5,5. Однако, активность солода из зерновых при этом была, в среднем, в 4 раза выше, чем у солода, полученного из бобовых.

Амилолитическая активность солода определялась нами при разных концентрациях ферментного препарата: 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 и 1 %. _{В результате показано, что наибольшей активностью при концентрации фермента 1 % обладает солод из тритикале, 6794,65 ± 5,52 ед. Эта активность на 9 и 21 %, соответственно, была выше, чем у солода из пшеницы и ржи (рис. 3).}

Далее нами изучено влияние различных концентраций субстрата (0,5, 1, 2, 3 г/дл) на ферментативную активность солода. Установлено, что наиболее длительное насыщение активного центра фермента субстратом (крахмалом) наблюдается у солода из тритикале. Так, при концентрации крахмала 0,5 г/дл активность солода из тритикале составила 2865,22 ± 8,12 ед., при 1 г/дл его активность возросла на 35 %, при 2 г/дл – на 46 %, при 2,5 г/дл – на 49 % и при 3 г/дл – на 51 % (рис. 4). Вместе с тем, полученные нами результаты в очередной раз свидетельствуют, что амилолитическая активность солода из зерновых существенно выше таковой активности бобовых культур.

Изучение изменения активности солода в зависимости от разных значений концентрации субстрата позволило рассчитать две важнейшие характеристики ферментного препарата: константу Михаэлиса и скорость ферментативной реакции. Оказалось, что K_m была наибольшей у солода из пшеницы. Она составляла 0,60 г/дл, что выше чем у ржи на 12 %, тритикале - на 17 %, чечевицы I - на 20 % и чечевицы II - на 34 %. Что касается скорости реакции, то она оказалась максимальной у солода из тритикале и была равна 2,75 ед/с. Это выше скорости реакции для солода из пшеницы в 1,2, из ржи – в 1,4, из чечевицы I – в 3,7, а чечевицы II – в 5,5 раза.



Рис. 3. Изменение амилолитической активности ферментного препарата солода в зависимости от его концентрации

Примечание: 1, 2, 3, 4, 5 - солод из пшеницы, ржи, тритикале, чечевицы I, чечевицы II, соответственно.



Рис. 4. Влияние различных концентраций субстрата на амилолитическую активность солода

Примечание: 1, 2, 3, 4, 5 - солод из пшеницы, ржи, тритикале, чечевицы I, чечевицы II, соответственно.


Таким образом, нами впервые детально изучена амилолитическая активность нативного солода, полученного из указанных культур в зависимости от разных значений температуры, pH, концентрации фермента и концентрации субстрата. Исследования кинетических параметров нативного солода показали, что солод, полученный из бобовых культур имеет меньшее сродство к субстрату и характеризуется меньшей начальной скоростью реакции гидролиза крахмала. Эти результаты, свидетельствуют о существенно более низкой активности амилолитических ферментов солода, полученного из бобовых культур по сравнению с солодом из зерновых.


Разработка технологии физической иммобилизации ферментного

препарата солода

Разработанная нами технологическая схема физической иммобилизации ферментного препарата солода и ее основные этапы представлены на рисунке 5. Иммобилизацию проводили методом адсорбции на полипропиленовых трубках согласно известным методикам (Вудворд, 1988; Медведева, 2001; Слабова, 2005; Шкутина, 2005; Basha et al., 2000; Kitara et al., 2001; Norowzian et al., 2002). Установлено, что сразу после посадки ферментного препарата солода на носитель его активность уже оказалась ниже, чем у нативного солода. Так, к этому сроку исследования иммобилизованные ферментные препараты солода из тритикале сохраняли 93,5 % от активности нативного фермента, из пшеницы – 87,3 %, а из ржи – 80,6 % (рис. 6).

Приготовление солода Подготовка носителя

(отбор, очистка, сортировка, мойка (мойка, дезинфекция, шлифовка

и дезинфекция зерна, замачивание, рабочей зоны носителя, трехкратная

проращивание зерна, обработка 1 н HCl и NaOH,

сушка солода и его измельчение) отмывка водой)




Иммобилизация солода

Продолжительность 120 мин

Температура 25-27°С


Хранение

Температура 4-5°С


Использование

иммобилизованного ферментного препарата


Рис. 5. Технологические этапы физической иммобилизации ферментного препарата солода




Рис. 6. Сравнительная амилолитическая активность нативного и иммобилизованного солода из тритикале (1), пшеницы (2) и ржи (3)


По мере увеличения сроков хранения препарата иммобилизованного солода его амилолитическая активность неуклонно снижалась. Так, в первые дни активность солодового препарата из пшеницы, ржи и тритикале, в среднем, уменьшилась на 13 %, а двух видов чечевицы – на 20 %. К седьмым суткам потеря активности для солода из зерновых, в среднем, составила 55 %, из бобовых – 60 %. Через две недели активность иммобилизованного солода _{составляла всего 3-5 % от исходных значений.} Наибольшая потеря ферментативной активности наблюдалась у солодового препарата, изготовленного из чечевицы, а наименьшая – из тритикале.


Оценка амилолитической активности иммобилизованного солода в

зависимости от температуры, рН и концентрации субстрата

Для проведения этой серии экспериментов концентрация ферментного препарата иммобилизованного солода составляла 0,1 %, т. е. была в 10 раз меньше, чем нативного. Было установлено, что после иммобилизации солода на полипропиленовых носителях оптимальная температура гидролиза крахмала смещается в сторону более высоких значений. Однако, максимальная каталитическая активность такого солода определялась при 60°С, что, в среднем, на 20°С больше, чем у нативного ферментного препарата (рис. 7). В то же время, максимальная амилолитическая активность иммобилизованного солода из тритикале была меньше на 13 %, чем у нативного препарата. Что касается других зерновых культур, то при 60°С эта активность для иммобилизованного солода из пшеницы была меньше на 28 %, а из ржи – на 37 %, чем у нативного препарата. Полученные данные свидетельствуют о том, что иммобилизованный солод более термоустойчив, чем нативный. Это, естественно, расширяет температурный диапазон использования иммобилизованного ферментного препарата солода, в том числе и на производстве. В то же время, оптимум pH для иммобилизованного солодового препарата оказался практически одинаковым с нативным, составляя 5,5 – 5,7 (рис. 8).

Изучение в динамике амилолитической активности в зависимости от разных концентраций субстрата (рис. 9) позволило рассчитать константу Михаэлиса и скорость ферментативной реакции для иммобилизованного солодового препарата. Показано, что иммобилизация приводит к увеличению значений константы Михаэлиса и уменьшению максимальной скорости реакции по сравнению с нативным энзимом. Это свидетельствует о том, что иммобилизованный ферментный препарат имеет меньшее сродство к субстрату и характеризуется меньшей начальной скоростью реакции гидролиза крахмала. Так, константа Михаэлиса для иммобилизованного солода из тритикале на 30 %, из пшеницы – на 12 %, а из ржи – на 19 % была выше, чем у нативного. В связи с этим у иммобилизованного солода указанных культур максимальная скорость ферментативной реакции оказалась ниже, соответственно, на 12, 8 и 6 %, чем у нативного (табл. 1).



Рис. 7. Сравнительная оценка каталитической активности нативного (1) и иммобилизованного (2) солода из тритикале в зависимости от температуры



Рис. 8. Сравнительная оценка каталитической активности нативного (1) и

иммобилизованного (2) солода из тритикале в зависимости от pH среды

Показатели		Солод
		тритикале	пшеница	рожь
Km, г/дл	нативный	0,72	0,68	0,65
	иммобилизованный	0,50	0,60	0,53
Vmax, ед/с	нативный	24,0	28,0	32,0
	иммобилизованный	2,75	2,25	1,92

Таблица 1 - Кинетические параметры нативного и иммобилизованного солода





Рис. 9. Сравнительная оценка каталитической активности нативного (1) и иммобилизованного (2) солода из тритикале в зависимости от концентрации субстрата


Таким образом, нами впервые разработана технология физической иммобилизации солода, полученного из тритикале, пшеницы и ржи. Установлены оптимальные значения температуры, pH и концентрации субстрата, при которых расщепление крахмала происходит полностью. Полученные данные свидетельствуют о неодинаковом сродстве нативного и иммобилизованного ферментного препарата солода к своему субстрату и, следовательно, о их разной каталитической активности. Иммобилизованный ферментный препарат солода имеет меньшее сродство к субстрату и характеризуется меньшей начальной скоростью гидролиза крахмала. Показано, что иммобилизация повышает константу Михаэлиса и уменьшает максимальную скорость реакции по сравнению с нативным энзимом.


Роль биотехнологических препаратов и растворов редкоземельных металлов в изменении амилолитической активности иммобилизованного солода

Далее нами оценивалось влияние препарата эффективных микроорганизмов, коллоидного золота и растворов редкоземельных металлов в концентрации 5·10^-9 г/л на амилолитическую активность иммобилизованного солода. Перед выполнением этих опытов, нами были проведены проверочные эксперименты на солоде из чечевицы II, т. к. он обладал наименьшей амилолитической активностью (табл. 2).

Препараты	Обработка солода	Обработка трубок
ЭМ-препарат	943,6421,73	997,3212,48
Коллоидное золото	960,3617,25	1007,5013,74
Неодим	925,2718,31	978,8212,58
Празеодим	914,4115,82	957,687,93
Лантан	901,3314,57	925,005,72

Таблица 2 - Амилолитическая активность (ед.) солода из чечевицы II


Из таблицы 2 следует, что обработка носителя всегда сопровождалась более высокой амилолитической активностью солода. Так, активность иммобилизованного солода при обработке трубок ЭМ-препаратом была больше на 3-6 %, чем после стимуляции самого солода. Исходя из этого, в дальнейших экспериментах мы использовали лишь полипропиленовые трубки, которые перед иммобилизацией солода обрабатывали указанными растворами.

Затем, на примере чечевицы II, нами была проанализирована остаточная амилолитическая активность иммобилизованного ферментного препарата солода, т. е. на 15-е сутки. Установлено, что после обработки носителя ЭМ-препаратом активность иммобилизованного солода из чечевицы II составляла 9 %, коллоидного золота – 10 %, неодима – 5 % (рис. 10).



Рис. 10. Активность иммобилизованного ферментного препарата солода из чечевицы II на 15-е сутки опыта

Примечание: 1 – контроль; 2, 3, 4 – носитель, обработанный растворами неодима, ЭМ-препарата и коллоидного золота, соответственно.


Влияние иммобилизованного солодового препарата на

производственные показатели теста, хлеба, пива и кваса

Учитывая несомненную практическую важность полученных данных, значительный объем исследований был посвящен возможному практическому применению иммобилизованного ферментного препарата солода. Для этого выбран солод, полученный из тритикале, т. к. его ферментативная активность была самой высокой. В лабораторных условиях с использованием иммобилизованного ферментного препарата солода из тритикале были изготовлены тесто, хлеб, пиво, квас и исследованы их органолептические и физико-химические показатели, характеризующие качество полученных изделий.

На основании полученных данных и в соответствии с актами независимой экспертизы заключено, что использование препарата иммобилизованного солода в производстве теста, хлеба, пива и кваса весьма рентабельно и вполне оправдано, ибо все показатели качества полученных продуктов соответствовали нормативным требованиям ГОСТов. В качестве примера приведем такие данные только для хлеба (табл. 3).

Нами впервые было установлено, что при изготовлении хлеба иммобилизованный ферментный препарат солода без изменения качества продукта можно использовать не менее пяти суток, пива – восьми, а кваса – семи суток (рис. 11). Однако, гостируемые характеристики продуктов выдерживаются в полной мере при использовании такого солода для изготовления хлеба только в течение трех суток, пива - пяти и кваса - четырех суток.

Таблица 3 - Изменение производственных показателей качества хлеба

№ п/п	Показатели	ГОСТ 2077 - 84	Контроль	Солод
				нативный	иммобилизованный
					1-е сутки	2-е сутки	3-е сутки
1.	Содержание влаги, %	не более 41 - 53	41,230,18	42,53 0,67 Р > 0,05	41,860,26 Р < 0,001	42,030,15 Р < 0,001	42,170,36 Р > 0,05
2.	Кислотность, град.	не более 7 - 11	5,230,07	8,030,03 Р < 0,001	5,760,13 Р > 0,05	6,870,35 Р < 0,001	7,300,07 Р < 0,001
3.	Пористость, %	не менее 46	46,530,85	58,100,72 Р < 0,001	48,140,73 Р < 0,001	53,600,87 Р > 0,05	55,710,64 Р < 0,001

Примечание: Р – по отношению к контролю.




Рис. 11. Динамика амилолитической активности иммобилизованного солода при изготовлении пива (1) и кваса (2)


Подчеркнем, что иммобилизованный ферментный препарат солода можно использовать неоднократно, что весьма важно для производственного цикла изготовления продуктов, ибо позволяет значительно сократить расходы и повысить рентабельность. Продукты, изготовленные с применением иммобилизованного ферментного препарата солода не содержат белковых (resp. аллергенных) примесей, что особенно существенно в пищевой промышленности.


ВЫВОДЫ

1. Установлено, что под влиянием препарата эффективных микроорганизмов улучшаются посевные качества семян пшеницы, ржи, тритикале и двух видов чечевицы. Энергия прорастания семян увеличивается, в среднем, на 10 %, сокращаются сроки прорастания, в среднем, в 1,5 раза, отмечено позитивное влияние на развитие проростков и корнеобразование.

2. Впервые показано, что обработка посевных семян ржи, тритикале и двух видов чечевицы коллоидным золотом и растворами редоземельных металлов (неодима, празеодима, лантана) в концентрации 5·10^-9 г/л увеличивает энергию прорастания на 8-10 %, сокращает скорость прорастания, в среднем, на 30 %, усиливает рост проростков и образование корней.

3. Изучена зависимость скорости амилолитической активности нативного солода, полученного из зерновых и бобовых культур, от температуры, рН, концентрации ферментного препарата и концентрации субстрата. Установлено, что ферментативная активность солода из зерновых в 3-4 раза выше, чем солода, полученного из бобовых культур. Солод из чечевицы имеет низкое сродство к субстрату и характеризуется низкой начальной скоростью гидролиза крахмала, по сравнению с солодом из зерновых.

4. Впервые разработана технология физической иммобилизации солода из пшеницы, ржи, тритикале и двух видов чечевицы. На момент изготовления иммобилизованные ферментные препараты солода из тритикале сохраняли 93,5 %, из пшеницы – 87,3 %, из ржи – 80,6 % от активности нативного фермента. Иммобилизованный солодовый препарат возможно использовать многократно, до 15 суток.

5. Установлено, что обработка полимерных носителей препаратом эффективных микроорганизмов, коллоидным золотом или растворами редкоземельных металлов с последующей иммобилизацией солода в каталитическом отношении оказывается более эффективной, чем аналогичная обработка нативного солода.

6. Впервые изучено влияние температуры, pH и концентрации субстрата на амилолитическую активность иммобилизованного солода, полученного из пшеницы, ржи и тритикале. Максимальная каталитическая активность такого препарата определяется при 60°С, что свидетельствует о его высокой термостабильности. Иммобилизация солода сопровождается увеличением константы Михаэлиса и уменьшением максимальной скорости реакции.

7. Впервые показана целесообразность применения иммобилизованного ферментного препарата в производстве теста, хлеба, пива и кваса. При этом показатели качества пищевых продуктов отвечают нормативным критериям соответствующих ГОСТов, повышается их амилолитическая активность, а длительность использования иммобилизованного солодового препарата, по сравнению с нативным солодом, увеличивается в 3-5 раз.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предпосевная обработка зерновых (пшеницы, ржи, тритикале) и бобовых (два вида чечевицы) культур препаратом эффективных микроорганизмов, коллоидным золотом, растворами редкоземельных металлов улучшает посевные качества этих семян.

2. Предложен способ получения солода из чечевицы, что расширяет области его применения. Получен патент на изобретение № 2428464 «Способ производства солода из чечевицы».

3. Разработанная программа «Расчет амилолитической активности солода» позволяет находить искомые значения ферментативной активности солода при заданных значениях концентрации субстрата. Получено свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2010617147 – Федеральная служба по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам г. Москва.

4. Иммобилизованный солодовый препарат рекомендуется к использованию в технологических процессах изготовления теста, хлеба, пива и кваса. Эффективность его применения подтверждена актом о внедрении научно-исследовательской работы на ОАО «Хлебокомбинат им. Стружкина» г. Саратова.


СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Буршина С.Н., Шатько А.А. Влияние солода разного вида на качество хлебобулочных изделий // Материалы конф. по итогам научно-исследовательской и производственной работы студентов за 2008 год: сб. науч. статей. Саратов: Наука, 2009. С. 29 – 30.

2. Буршина С.Н., Шатько А.А. Сравнительный анализ амилолитической активности солода различного вида // Материалы Всероссийской науч.-практ. конф. Саратов: Наука, 2008. С. 43 – 44.

3. Шатько А.А. Сравнительный анализ амилолитической активности солода различного вида и его использование в технологии хлебобулочных изделий // Молодые ученые Саратовской области: тез. науч. работ студ. высших учеб. заведений Сарат. обл.-участников обл. конкурса «Студенческая наука 2009». Саратов: Макси-принт, 2009. С. 105 – 106.

4. Шатько А.А. Влияние солода разного вида на качество теста и хлеба // Актуальные проблемы ветеринарной патологии, физиологии, биотехнологии, селекции животных: сб. материалов науч.-практ. конф. Саратов: Наука, 2010. С. 166 – 167.

5. Шатько А.А. Изменение посевных качеств семян под влиянием микробиологи-ческих и нановоздействий // Технология и продукты здорового питания: материалы IV междунар. науч.-практ. конф. Саратов: КУБиК, 2010. С. 171 – 172.

6. Шатько А.А. Характеристика ферментативной активности солода из зерновых и бобовых культур // Вавиловские чтения - 2010: материалы междунар. науч.-практ. конф. Саратов: КУБиК, 2010. Т. 2. С. 182 – 183.

7. Блинов В.А., Шатько А.А. Влияние пробиотического препарата, наночастиц золота и редкоземельных металлов на посевные качества семян // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. 2010. № 11. С. 10 – 13.

8. Блинов В.А., Шатько А.А. Иммобилизованный солод: технология, кинетика, изменение под влиянием пробиотика и наноконцентраций металлов // Шестой Саратовский салон изобретений, инноваций и инвестиций. Саратов: Саратовский ГАУ. 2011. Ч. 2. С. 64 – 65.

9. Блинов В.А., Шатько А.А. Характеристика ферментативной активности солода из зерновых и бобовых культур // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. 2011. № 3. С. 5 – 8.

10. Шатько А.А. Влияние нанотехнологических воздействий на иммобилизацию солода и возможность применения этого препарата // Материалы интернет-конф. «Приоритетные направления модернизации аграрной экономики: тенденции, проблемы, перспективы». 2011. [Электронный ресурс]. URL:ссылка скрыта (дата обращения: 10.11.2011).

11. Шатько А.А. Сравнительная оценка активностей нативного и иммобилизованного солода // Актуальные проблемы ветеринарной патологии, физиологии, биотехнологии и селекции животных: материалы конф., посвященной 80-летию доктора ветеринарных наук, профессора, заслуженного деятеля науки РФ Демкина. Саратов: КУБиК, 2011. С. 72 – 73.

12. Блинов В.А., Шатько А.А. Характеристика некоторых параметров иммобилизованного солода как катализатора катаболизма крахмала // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. 2011. № 11. С. 8 – 10.

13. Блинов В.А., Шатько А.А. Пат. 2428464 Рос. Федерация, МПК C 12C 1/00. Способ производства солода из чечевицы. № 2010128203/10 заявл. 07.07.2010: опубл. 10.09.2011. Бюл. № 25. 4 с.